eng
Просмотры: 954
20.09.2016
Шведские учёные разработали новый метод получения и визуализации транскриптомных данных прямо на гистологических срезах, причем с учетом пространственного параметра.
Инновационный подход дает возможность одновременно оценивать транскрипцию тысяч разных генов с разрешением 200 мкм и может стать революционным в биомедицине и диагностике.
Генотип – последовательность ДНК, «текстовая» инструкция, по которой создается фенотип особи. Одна из главнейших задач современной биологии – разобраться, как именно происходит процесс перехода генотипа в фенотип.
В соответствии с центральной догмой молекулярной биологии информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении: проще говоря, информация транскрибируется РНК, затем РНК транслируется в белки. И именно белки можно уже отнести к фенотипу: их взаимодействия и деятельность во многом формируют организм и его физиологию.
Но не все гены транскрибируются, а РНК транслируются. Таким образом, чтобы понять, как формируется фенотип, важно разбираться не только в функционировании белков и "прочитать" геном, но и проследить исполнение этой "инструкции" - от гена к РНК и от РНК к белку.
К счастью, кроме геномного секвенирования можно изучать и другие «узловые точки» центральной догмы: мы можем узнать, какие РНК синтезируются и к какому набору белков все это приводит. Однако это только половина методической победы, поскольку организм состоит из разных органов и тканей, а они, в свою очередь, — из разных типов клеток, и каждый из типов синтезирует свой набор РНК и белков. Также клетки разных типов взаимодействуют друг с другом. Получается, что нужно отслеживать еще как минимум один параметр — пространственный — и знать не только набор «генотип, РНК, белок», но и то, откуда это взято и что находится вокруг.
Шведским ученых удалось придумать технологию, благодаря которой появилась возможность отслеживать синтез всех РНК в образце тканей организма — то есть учитывать этот пространственный параметр на уровне РНК.
Чтобы узнать, какие РНК синтезируются в определенной части организма, обычно берут некоторое количество материала интересующего нас органа или ткани, выделяют суммарную (тотальную) РНК и секвенируют ее. Чтобы узнать, где в организме идет транскрипция с определенного гена, можно синтезировать меченый красителем или радиоактивным изотопом РНК-зонд, комплементарный РНК этого гена, и провести гибридизацию на срезе органа или в целом организме, если он небольшой (In situ hybridization). Но хочется большего — узнать транскрипцию всех генов во всех клетках организма (или хотя бы его части, размеры которой сильно больше размеров одной клетки).
Очевидно, что использование названных подходов столько раз, сколько в организме клеток (порядка 1013 для человека) или столько раз, сколько генов в геноме (порядка 20 000 у человека), попросту невозможно. Новый метод позволяет изучать транскрипцию всех генов на гистологических срезах с разрешением 200 мкм. До масштабов отдельных клеток еще далеко (нужно улучшить разрешение в 10 раз — до 10–20 мкм), до объемов всего организма тоже пока далеко (нужно эффективно использовать серии срезов). Но по сравнению с имеющимися подходами был сделан значительный шаг вперед.
Предлагаемый метод основан на том, что гистологический срез помещают на специальную стеклянную подложку, несущую связанные одноцепочечные молекулы ДНК (олиго(дТ)-праймеры), комплементарные полиА-хвосту мРНК (тех, что кодируют белки). С одной стороны, подложка выступает в роли предметного стекла, на котором срез может быть фиксирован, прокрашен и микроскопирован. С другой стороны, это — чип, который на себе связывает мРНК, выходящие из клеток при обработке среза специальным составом, содержащим ДНКазы и протеазы. После связывания РНК нужно провести реакцию обратной транскрипции и удалить остатки ткани, в результате чего на подложке останутся островки кДНК, соответствующие клеткам. Благодаря использованию нуклеотидов, меченых Cy3-флуоресцентным красителем, транскрипционный отпечаток можно увидеть в флуоресцентном микроскопе.
Но и это еще не всё. В последующем эксперименте исследователи разделили подложку более чем на 1000 зон (диаметр каждой зоны 100 мкм, расстояние между центрами зон 200 мкм) так, чтобы в каждой зоне олигонуклеотиды, связывающие мРНК, были уникальны и отличались от всех остальных зон. Это было достигнуто введением в связывающий олигонуклеотид специальной вариабельной последовательности — баркода, уникального для каждой зоны. Убрав остатки ткани с подложки, ученые получили кДНК-оттиск исходного препарата, имеющий пространственное разрешение 200 мкм. Специальная обработка позволяет отрезать молекулы ДНК с подложки и перевести их в раствор для последующего секвенирования по стандартному протоколу. При этом каждая молекула ДНК «помнит» к какой именно из 1000 зон она была прикреплена, поскольку несет в себе последовательность баркода.
Таким образом, благодаря баркодам, после секвенирования можно узнать, сколько молекул мРНК, соответствующих конкретному гену (транскрипцию которого хочется измерить), пришло из каждой зоны, то есть можно определить уровень его транскрипции с точностью до зоны.
Дальнейшее усовершенствование технологии может позволить увеличить разрешающую способность метода вплоть до отдельных клеток — путем уменьшения размера зон и увеличения вариабельности последовательностей-баркодов. Но уже в представленном варианте метод может быть крайне полезен не только для фундаментальной науки, но и для биомедицины и диагностики (например, рака), когда одновременно с микроскопическими исследованиями необходима оценка уровня транскрипции различных генов-маркеров.
Генотип – последовательность ДНК, «текстовая» инструкция, по которой создается фенотип особи. Одна из главнейших задач современной биологии – разобраться, как именно происходит процесс перехода генотипа в фенотип.
В соответствии с центральной догмой молекулярной биологии информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении: проще говоря, информация транскрибируется РНК, затем РНК транслируется в белки. И именно белки можно уже отнести к фенотипу: их взаимодействия и деятельность во многом формируют организм и его физиологию.
Но не все гены транскрибируются, а РНК транслируются. Таким образом, чтобы понять, как формируется фенотип, важно разбираться не только в функционировании белков и "прочитать" геном, но и проследить исполнение этой "инструкции" - от гена к РНК и от РНК к белку.
К счастью, кроме геномного секвенирования можно изучать и другие «узловые точки» центральной догмы: мы можем узнать, какие РНК синтезируются и к какому набору белков все это приводит. Однако это только половина методической победы, поскольку организм состоит из разных органов и тканей, а они, в свою очередь, — из разных типов клеток, и каждый из типов синтезирует свой набор РНК и белков. Также клетки разных типов взаимодействуют друг с другом. Получается, что нужно отслеживать еще как минимум один параметр — пространственный — и знать не только набор «генотип, РНК, белок», но и то, откуда это взято и что находится вокруг.
Шведским ученых удалось придумать технологию, благодаря которой появилась возможность отслеживать синтез всех РНК в образце тканей организма — то есть учитывать этот пространственный параметр на уровне РНК.
Чтобы узнать, какие РНК синтезируются в определенной части организма, обычно берут некоторое количество материала интересующего нас органа или ткани, выделяют суммарную (тотальную) РНК и секвенируют ее. Чтобы узнать, где в организме идет транскрипция с определенного гена, можно синтезировать меченый красителем или радиоактивным изотопом РНК-зонд, комплементарный РНК этого гена, и провести гибридизацию на срезе органа или в целом организме, если он небольшой (In situ hybridization). Но хочется большего — узнать транскрипцию всех генов во всех клетках организма (или хотя бы его части, размеры которой сильно больше размеров одной клетки).
Очевидно, что использование названных подходов столько раз, сколько в организме клеток (порядка 1013 для человека) или столько раз, сколько генов в геноме (порядка 20 000 у человека), попросту невозможно. Новый метод позволяет изучать транскрипцию всех генов на гистологических срезах с разрешением 200 мкм. До масштабов отдельных клеток еще далеко (нужно улучшить разрешение в 10 раз — до 10–20 мкм), до объемов всего организма тоже пока далеко (нужно эффективно использовать серии срезов). Но по сравнению с имеющимися подходами был сделан значительный шаг вперед.
Предлагаемый метод основан на том, что гистологический срез помещают на специальную стеклянную подложку, несущую связанные одноцепочечные молекулы ДНК (олиго(дТ)-праймеры), комплементарные полиА-хвосту мРНК (тех, что кодируют белки). С одной стороны, подложка выступает в роли предметного стекла, на котором срез может быть фиксирован, прокрашен и микроскопирован. С другой стороны, это — чип, который на себе связывает мРНК, выходящие из клеток при обработке среза специальным составом, содержащим ДНКазы и протеазы. После связывания РНК нужно провести реакцию обратной транскрипции и удалить остатки ткани, в результате чего на подложке останутся островки кДНК, соответствующие клеткам. Благодаря использованию нуклеотидов, меченых Cy3-флуоресцентным красителем, транскрипционный отпечаток можно увидеть в флуоресцентном микроскопе.
Но и это еще не всё. В последующем эксперименте исследователи разделили подложку более чем на 1000 зон (диаметр каждой зоны 100 мкм, расстояние между центрами зон 200 мкм) так, чтобы в каждой зоне олигонуклеотиды, связывающие мРНК, были уникальны и отличались от всех остальных зон. Это было достигнуто введением в связывающий олигонуклеотид специальной вариабельной последовательности — баркода, уникального для каждой зоны. Убрав остатки ткани с подложки, ученые получили кДНК-оттиск исходного препарата, имеющий пространственное разрешение 200 мкм. Специальная обработка позволяет отрезать молекулы ДНК с подложки и перевести их в раствор для последующего секвенирования по стандартному протоколу. При этом каждая молекула ДНК «помнит» к какой именно из 1000 зон она была прикреплена, поскольку несет в себе последовательность баркода.
Таким образом, благодаря баркодам, после секвенирования можно узнать, сколько молекул мРНК, соответствующих конкретному гену (транскрипцию которого хочется измерить), пришло из каждой зоны, то есть можно определить уровень его транскрипции с точностью до зоны.
Дальнейшее усовершенствование технологии может позволить увеличить разрешающую способность метода вплоть до отдельных клеток — путем уменьшения размера зон и увеличения вариабельности последовательностей-баркодов. Но уже в представленном варианте метод может быть крайне полезен не только для фундаментальной науки, но и для биомедицины и диагностики (например, рака), когда одновременно с микроскопическими исследованиями необходима оценка уровня транскрипции различных генов-маркеров.
Комментарии читателей
