Перед вами не просто книга, а титанический труд Ллойда Снайдера, Джека Кирк-
ленда и Джона Долана, посвященный ВЭЖХ. Это и учебник, и справочник, и даже
энциклопедия по всем (или почти по всем) вопросам, связанным с ВЭЖХ. На се-
годняшний день третье издание «Введения в современную жидкостную хроматогра-
фию» — одно из самых популярных в мире справочных руководств на эту тему. Что
и говорить, перевод этой книги на русский язык задержался, но лучше поздно, чем
еще позднее.
В книге освещено огромное количество вопросов, связанных с теорией хрома-
тографии, современным оборудованием ВЭЖХ, методами детектирования и устрой-
ством детекторов, подробно рассмотрены теоретические и практические аспекты вы-
бора неподвижных и подвижных фаз. Особое внимание уделено обращенно-фазовой,
нормально-фазовой, гель-проникающей, гидрофобной, гидрофильной и другим ви-
дам хроматографии. Отдельные главы посвящены разделению синтетических и при-
родных полимеров, препаративной хроматографии, разделению энантиомеров, про-
боподготовке, типовым проблемам при работе с хроматографическим оборудованием
и, что особенно важно в современных условиях, валидации аналитических методов.
В.А. Жуковский говорил, что «переводчик в прозе — раб, а переводчик в сти-
хах — соперник». Коллектив переводчиков этой книги решил быть соперниками.
В тех случаях, когда оригинальный текст устарел, или необходимо было дать допол-
нительные разъяснения, или у переводчиков имелось на этот счет другое мнение,
они писали примечания к переводу.
Перевод главы 13 сделан к.х.н. С.В. Шульгой-Морским, а главы 14 —
к.х.н. А.А. Новоженец. Коллектив переводчиков хотел бы поблагодарить
к.х.н. А.А. Колотвина за участие в редактировании главы 12, к.х.н. Л.Д. Аснина за
участие в редактировании главы 14 и К.Е. Маркачеву за помощь при оформлении
многочисленных рисунков и графиков.
к.т.н. М.Б. Бару
И.В. Важенина
д.х.н. С.М. Староверов
ПРЕДИСЛОВИЕ
В настоящее время высокоэффективная хроматография (ВЭЖХ) является основной
технологией химического анализа и его приложений. С ее помощью возможно разде-
лить, проанализировать и очистить практически любой образец. Второе издание этой
книги появилось в 1979 году и стало для десятков тысяч читателей справочником
по ВЭЖХ. Заметный успех второго издания (вкупе со значительными продажами
в первом десятилетии нынешнего века) может быть отнесен к ряду достоинств, кото-
рые перешли и в эту книгу. Во-первых, все три издания выросли из кратких курсов,
прочитанных за последние сорок лет тремя авторами перед аудиторией, состоящей из
более чем десяти тысяч хроматографистов, работающих в промышленности, исследо-
вательских институтах и правительственных учреждениях. Преподавание позволяет
опробовать и оценить различные подходы к предмету изложения. Когда студенты яв-
ляются практикующими хроматографистами, особенно важен практический подход.
Во-вторых, во всех трех изданиях мы попытались объединить практические советы
(как?) с теоретической основой (почему?). И теория, и практика даны так, чтобы чита-
тель мог лучше понять и оценить данные в книге рекомендации. И, наконец, каждый
из трех авторов на протяжении большей части своей карьеры был активным участни-
ком исследований в области ВЭЖХ и/или ее практического применения.
С момента подготовки второго издания в 1979 году существенно улучшились ко-
лонки и хроматографическое оборудование. Кроме того, мы существенно продви-
нулись в направлении (1) понимания ВЭЖХ-разделения, (2) нашей способности
решать проблемы, которые раньше было сложно решить, и (3) применения ВЭЖХ
для разделения новых типов образцов. В то время как во втором издании было уде-
лено равное внимание шести различным ВЭЖХ-методам, в третьем основное (но не
исключительное) внимание направлено на обращенно-фазовую хроматографию, ко-
торая в настоящее время составляет около 80% всех ВЭЖХ-приложений. За послед-
ние три десятилетия использование ВЭЖХ для работы с биологическими образцами,
для разделения энантиомеров и для очистки веществ возросло чрезвычайно и сопро-
вождалось более глубоким пониманием сути этих и других областей ее применения.
Продолжается совершенствование коммерчески доступных колонок. Кроме того,
разработано много новых видов колонок для конкретных приложений, для ускоре-
ния процесса разделения и для того, чтобы повысить безотказность работы
ВЭЖХ-систем. До начала девяностых годов разработка ВЭЖХ-метода была непред-
сказуемой. Зачастую требовалось несколько месяцев, чтобы добиться приемлемого
разделения образца. С того времени стало возможным существенное ускорение раз-
работки метода, особенно в случае использования подходящего программного обес-
печения. В то же самое время практика ВЭЖХ все больше стала проходить в норма-
тивно-правовом поле, что замедляет утверждение разработанного метода. Все эти
многочисленные и различные достижения в области ВЭЖХ и обусловили большую
часть изменений в настоящем издании.
Структура этой книги, хотя и похожа на структуру второго издания, существенно
переработана в свете современных исследований. В первой главе даются основы
ВЭЖХ с кратким изложением того, как использование этих знаний соотносится
с различными современными методами разделения. Кроме того, в первой главе при-
веден обзор истории ВЭЖХ. В главе второй углубленно рассмотрены основы ВЭЖХ
и влияние различных экспериментальных условий на параметры разделения. Главы
третья и четвертая посвящены соответственно оборудованию и детектированию.
В 1979 году детекторы еще были «слабым звеном» в системе ВЭЖХ, но сегодня широкое использование диодно-матричных УФ-детекторов и масс-спектрометрического
детектирования, так же как и наличие ряда детекторов специального назначения, ре-
шило эту проблему. В пятой главе описывается колонка: «сердце» всей хроматогра-
фической системы. В 1979 году у колонок существовало множество недостатков:
уширение заднего фронта пика (особенно для основных образцов), нестабильность
работы при повышенных температурах или ограничения по рН мобильной фазы,
а также нестабильность характеристик от партии к партии. Сегодня эти проблемы
встречаются гораздо реже. Мы теперь хорошо знаем, как эффективность изменяет-
ся в зависимости от типа колонок, и это знание позволяет нам лучше их подбирать
для конкретных случаев. И, наконец, в значительной степени благодаря усовершен-
ствованию колонки стало возможным проведение сверхбыстрых разделений (в кото-
рых время разделения составляет несколько минут или меньше) и более качествен-
ное фракционирование смесей, содержащие сотни или даже тысячи компонентов.
Шестая глава, в которой рассматриваются разделения неионных образцов на об-
ращенных фазах, расширяет начатое во второй главе обсуждение важных приложе-
ний ВЭЖХ. Подобное рассмотрение нормально-фазовой хроматографии (НФХ) про-
водится в восьмой главе. При этом уделено специальное внимание хроматографии
гидрофильных влаимодействий (ГИХ). В седьмой главе обсуждается разделение ино-
низованных и ионизируемых образцов с помощью обращенно-фазовой, ион-парной
или ионообменной хроматографии. Разговор о градиентном элюировании образцов
низкомолекулярных веществ начинается в девятой главе для того, чтобы им предва-
рить обсуждение процесса разделения больших биомолекул в тринадцатой главе.
Рассмотрены и двумерные разделения, приобретающие все большее значение. В де-
сятой главе описано компьютерное моделирование хроматографических методов.
Другие важные общие темы освещены в главах 11 (количественный и качественный
анализ) и 12 (валидация метода).
Глава тринадцатая представляет собой введение в разделение высокомолекуляр-
ных соединений, включая как биологические, так и синтетические полимеры. Мето-
ды ВЭЖХ, использующиеся для этих целей, рассмотрены подробнее — обращен-
но-фазовая, ионообменная и эксклюзионная хроматография — а также связанные
с ними двумерные разделения. В четырнадцатой главе рассматривается особый слу-
чай — разделение энантиомеров. Особый он постольку, поскольку для того, чтобы
разделить энантиомеры, требуется специально подбирать колонки и условия
для каждого образца. Этот подход не похож на те, что используются в большинстве
ВЭЖХ приложений, описанных в предыдущих главах.
Пятнадцатая глава посвящена препаративным разделениям (преп-ЖХ), в кото-
рых на колонку вводят гораздо боќльшие количества образца. С 1979 года в препара-
тивной хроматографии произошли большие изменения, мы теперь гораздо лучше по-
нимаем, как препаративные разделения зависят от изменения условий, что, в свою
очередь, дает возможность более эффективно и систематически разрабатывать метод
разделения. В шестнадцатой главе дается подробное введение в пробоподготовку,
важный раздел ВЭЖХ. Как и в случае с другими разделами ВЭЖХ, пробоподготовка
за последние тридцать лет претерпела существенные изменения, что позволило ее
превратить в рутинную процедуру, служащую дополнением к методу разделения. На-
конец, в семнадцатой главе рассматриваются возможные в ВЭЖХ проблемы и неис-
правности. Несмотря на все наши достижения в усовершенствовании оборудования,
колонок, материалов и методов, гарантировать бесперебойную ВЭЖХ по-прежнему
невозможно. К счастью, мы стали более осведомленными, наши знания в большей
степени систематизированы и, как следствие, наши возможности предвидеть, диа-
гностировать и решать проблемы, связанные с ВЭЖХ, увеличились. Один из трех ав-
торов этой книги (Джон Долан) приложил большие усилия именно в этой области.
Разные читатели будут пользоваться этой книгой для решения разных задач. Тот,
у которого уже есть опыт, возможно, захочет выборочно изучить нужные ему темы
или станет искать ответы на конкретные вопросы. Таким читателям лучше начать
знакомство с книгой с изучения предметного указателя. Начинающие могли бы сна-
чала просмотреть главы с первой по седьмую, а затем с девятой по десятую: в них
наибольшее внимание уделено обращенно-фазовой ВЭЖХ. Эта последовательность
глав представляет собой в общих чертах ядро краткого курса ВЭЖХ, разработанного
авторами. После такого введения читатель может перейти к главам, которые пред-
ставляют для него особый интерес. Другие читатели, возможно, захотят начать чте-
ние с конкретных тем, перечисленных в оглавлении в начале книги, и в оглавлениях,
помещенных перед каждой главой. Книга так построена, что возможны разные вари-
анты ее прочтения.
Третье издание насыщено перекрестными ссылками с тем, чтобы позволить чи-
тателю следовать за интересующей его темой или прояснить вопросы, возникающие
по ходу чтения. Поскольку большое количество перекрестных ссылок может отвле-
кать, то зачастуюрекомендуется их просто игнорировать (или откладывать, что назы-
вается, на потом), чтобы не прыгать из одной главы в другую. Некоторые главы содер-
жат разделы, в которых детально рассматриваются те или иные вопросы. Это может
быть несколько в стороне от непосредственного интереса читателя, и потому такие
разделы выделены курсивом, чтобы читатель мог их пропустить. Кроме того, мы свели
определения всех символов, встречающихся в книге, в глоссарий и составили всеобъ-
емлющий предметный указатель. Наконец, следует обратить внимание на «наиболее
оптимальные методики» в предметном указателе, в которых объединены различные
рекомендации как для разработки метода, так и для рутинных методик.
Мы высоко ценим вклад, который внесли в создание настоящей книги восемь
наших коллег: Петер Шонмэйкерс (разделы 9.3.10, 13.10), Майк Шварц (глава 12),
Тим Вэр (разделы 13.1—13.8), Карл Сканделла (раздел 13.9), Вольфганг Линднер,
Михаель Лэммерхофер и Норберт Майер (глава 14), Джефф Кокс (глава 15) и Рон
Мэйджорс (глава 16). Они сотрудничают в следующих организациях:
Петер Шонмэйкерс University of Amsterdam
Майк Шварц Synomics Pharma
Тим Вэр BioRad Corp.
Карл Сканделла Consulting (4404 91st Avenue NE Bellevue, WA 98004)
Вольфганг Линднер, University of Vienna
Михаель Лэммерхофер
и Норберт Майер
Джефф Кокс Chiral Technologies
Рон Мэйджерс Agilent Technologies
Мы признательны рецензентам различных частей этой книги: Питеру Карру,
Тому Чэмберсу, Джеффу Коксу, РоюЭкстену, Джону Фетцеру, Дику Хенри, Влади-
миру Иоффе, Павлу Жандере, Питеру Джонсону, Тому Жупиль, Рону Мэйджорсу,
Дэну Марчанду, Дэвиду МакКэлли, Имре Мольнару, Тому Моурей, Уве Нойе, Рави
Равичандрану, Карен Руссо, Карлу Сканделле, Петеру Шонмэйкерсу и Лорен Рис-
лей. Тем не менее за все ошибки и недочеты в книге авторы берут ответственность
на себя.
Ллойд Р. Снайдер
Дж. Дж. (Джек) Киркленд
Джон В. Долан
Оринда. Калифорния
Уилмингтон, Делавэр
Амити, Орегон
Словарь символов и принятых сокращений
Этот раздел состоит из двух частей: основные символы и второстепенные символы.
Большинство обозначений, представляющих интерес, включены в список основных
символов. Уравнения, служащие определением данного символа, указаны рядом с
этим символом. Например, указание «уравнение (2.18)» отсылает к уравнению (2.18)
главы 2. Приведены единицы измерения для всех обозначений, используемых в дан-
ной книге.
Основные символы и принятые сокращения
A (%А) «слабый» компонент бинарной подвижной фазы (A/B) и его объемный процент;
в обращенно-фазовой хроматографии растворитель А представляет собой воду или
водный буфер; также силикагель типа А (старый, более кислотный силикагель)
ACN ацетонитрил
B (%B) «сильный» компонент (и его объемный процент) в бинарной подвижной фазе
(A/B); в обращенно-фазовой хроматографии растворитель B представляет собой
органический растворитель, такой как ацетонитрил; также силикагель типа В
(современный, менее кислотный силикагель, раздел 5.2.2.2)
CV коэффициент вариации (эквивалентный относительному стандартному отклоне-
нию, ОСО), раздел 4.2.3.2
С8, С18 обозначение обращенно-фазового лиганда, показывает длину алкильных цепочек,
привитых к поверхности сорбента
dc внутренний диаметр колонки (мм)
dp диаметр частиц сорбента (мкм)
F объемная скорость подвижной фазы, скорость потока (мл/мин)
H высота теоретической тарелки (равная L/N) раздел 2.4; см. также «менее часто
используемые символы»
k фактор удерживания (то же самое, что и коэффициент емкости kґ);
равен (tR/t0) 1,
раздел 2.3.1
k* градиентный фактор удерживания; уравнение (9.5), раздел 9.2
L длина колонки (мм)
M молекулярная масса (Да)
MeOH метанол
N число теоретических тарелок, уравнение (2.9), раздел 2.4
nc «эквивалентная» пиковая емкость, обычно именуемая «условной» или «пиковой
емкостью образца» nc = PC (tZ tA)/
tG, раздел 9.3.9
P перепад давления на колонке (psi); 1 бар или 1 атм = 14,7 psi; 1 МПа = 10 бар =
= 147 psi; также коэффициент распределения вещества между различными раство-
рителями (partition coefficient), раздел 6.2.2
PC пиковая емкость; уравнение (2.30), рис. 2.26а (изократика); уравнение (9.20),
рис. 9.20 (градиент)
pKa логарифм константы ионизации кислоты или основания (log
Ka); уравнения (7.2),
(7.2а), раздел 7.2
RF относительное перемещение зон (пятен) вещества в ТСХ; уравнение (8.6), рис. 8.8,
раздел 8.2.3
Rs разрешение; уравнение (2.23), раздел 2.5
S наклон прямой в координатах logk,ц (dlogk/dц); уравнение (2.26), раздел 2.5.1
T температура (°С)
tD время задержки (мин); эквивалентно VD/F, рис. 3.26, раздел 3.10.1.2
TF фактор размывания заднего фронта пика (tailing factor), рис. 2.16а, раздел 2.4.2
tG время градиента (мин)
t0 «мертвое» время колонки (мин); также время удерживания неудерживаемого анали-
зируемого вещества; эквивалентно Vm/F; уравнения (2.4а), (2.7), раздел 2.3.1
tR время удерживания (мин); уравнение (2.5), раздел 2.3.1
UV поглощение в ультрафиолетовой области спектра
Vc объем колонки (мл)
VD приборный объем задержки, VD = tDF, раздел 9.2.2.4
Vm «мертвый» объем колонки; объем подвижной фазы внутри колонки (мл); уравне-
ние (2.7а), раздел 2.3.1
VR объем удерживания анализируемого вещества (мл); равен tRF
W ширина пика при основании; рис. 2.10, раздел 2.4
wmax максимальная масса образца, которую можно нанести на колонку без ее перегруз-
ки, раздел 2.6.3
ws емкость насыщения колонки (г), раздел 15.3.1.1
wx масса наносимого вещества (г), раздел 15.3.1.2
б коэффициент селективности (фактор разделения); уравнение (2.24а), раздел 2.5
Дц изменение ц в течение градиента; рис. 9.2, раздел 9.1.2
е элюирующая сила подвижной фазы в НФХ; уравнения(8.2), (8.5); также диэлектри-
ческая постоянная
е0 значение е (в НФХ) для чистого растворителя
ц объемная доля элюента B (равна 0,01×%В)
ц* значение ц в градиентной хроматографии, когда зона вещества достигает середины
колонки
н приведенная скорость; уравнение (2.18а), раздел 2.4.1.1
з вязкость подвижной фазы (сП)
АХИМ аффинная хроматография на сорбентах с иммобилизованными металлами (immobilized-
metal affinity chromatography, IMAC) или металл-аффинная хроматография,
раздел 13.4.2.5
ВАХ высокоэффективная анионообменная хроматография (high-performance anionexchange
chromatography, HPAE), раздел 13.6.3
ВПМС времяпролетный масс-спектрометр ( timeofflight (TOF) MS-detector), раздел 4.14.3
ГИХ хроматография гидрофильных взаимодействий (hydrophilic interaction chromatography,
HILIC) раздел 8.6
ГИХЭО хроматография гидрофильных взаимодействий с электростатическим отталкивани-
ем (electrostatic-repulsion hydrophilic-interaction chromatography, ERLIC), раз-
дел 13.4.4.4
ГПХ гель-проникающая хроматография (gel-permiation chromatography, GPC), раз-
дел 13.10.3.1
ФХ гель-фильтрационная хроматография (gel-filtration chromatography) или эксклю-
зионная хроматография ЭХ, раздел 13.8
ДПП детектор показателя преломления или рефрактометр (refractive index, RI detector),
раздел 4.11
ЖХ жидкостная хроматография
ЖХ-МС жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (liquid chromatography–mass
spectrometry, LC-MS), раздел 4.14
ИАД импульсное амперометрическое детектирование (pulsed-amperometric detection,
PAD), раздел 13.6.3
ИДС испарительный детектор светорассеяния (evaporative light-scattering detector, ELSD),
раздел 4.12.1
и-ЖХ интерактивная жидкостная хроматография (interactive LC), раздел 13.10.3.2
ИКФП инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (Fourier transform infrared
spectroscopy, FTIR) или соответствующий спектрометр; раздел 4.15.1
ИОХ ионообменная хроматография (ion-exchange chromatography, IEС), раздел 7.5
ИПР ион-парный реагент
ИПХ ион-парная хроматография (ion-pair chromatography, IPC), раздел 7.4
КФГ клапаны, формирующие градиент (для систем ВЭЖХ со смешиванием при низком
давлении), раздел 3.10.1.2
ЛДС лазерный детектор светорассеяния (laser light-scattering detector, LLSD), раздел 4.12.3
МЖХ многомерная жидкостная хроматография (multidimensional liquid chromatography,
MDLC), раздел 13.4.5, и 2D-ЖХ для двумерного разделения, раздел 9.3.10
МС/МС-детектор
детектор с тандемной масс-спектрометрией (triple-quadrupole mass spectrometer),
раздел 4.12.2, или с другими сочетаниями нескольких МС-анализаторов
НОФХ неводная обращенно-фазовая хроматография (nonaqueous RPC, NARP), раздел 6.5
НПД нижний предел детектирования, раздел 4.2.4; иногда называется пределом обнару-
жения, ПО, раздел 11.2.5
НПКО нижний предел количественного определения, раздел 4.2.4, или предел количест-
венного определения, ПКО, раздел 11.2.5
НФХ нормально-фазовая хроматография (normal-phase chromatography, NPC), глава 8
ОК операционная квалификация (operational qualification) — тестирование новой систе-
мы ВЭЖХ на соответствие техническим характеристикам, указанным производите-
лем, раздел 3.10.1.1
ОСО относительное стандартное отклонение или СО (relative standard deviation, RSD),
что эквивалентно относительному среднеквадратичному отклонению (СКО)
ОФХ обращенно-фазовая хроматография (reversed-phase chromatography, RPC), глава 6
ПАВ поверхностно-активные вещества
ПЛ поляриметр (polarimeter, PL), раздел 4.10
ПП показатель преломления (refractive index, RI)
преп-ЖХ препаративная жидкостная хроматография, глава 15
ПС-ДВБ полистирол-дивинилбензол (PS-DVB)
СКО относительное среднеквадратичное отклонение, эквивалентно ОСО
С-П-разделение
разделение соприкасающихся пиков (touching-peak separation), раздел 15.1.2
ТБА тетрабутиламин (TBA)
типа А старый, более кислотный силикагель, раздел 5.2.2.2
типа В новый, менее кислотный силикагель, раздел 5.2.2.2
ТФУК трифторуксусная кислота (TFA)
ТФЭ твердофазная экстракция (solid-phase extraction, SPE), раздел 16.6
ТЭА триэтиламин (TEA)
УВЭЖХ ультравысокоэффективная жидкостная хроматография (ultra-high-pressure liquid
chromatography, U-HPLC)
УК установочная квалификация (installation qualification) — тестирование новой систе-
мы ВЭЖХ на соответствие установки системы условиям, указанным производите-
лем, раздел 3.10.1.1
УФ ультрафиолетовый (область спектра, детектирование по поглощению в этой облас-
ти и т.д.)
ХГВ хроматография гидрофобных взаимодействий (hydrophobic interaction chromatography,
HIC), раздел 13.4.3
ХЛОХ хиральная лигандообменная хроматография (chiral ligand-exchange chromatography,
CLEC), раздел 14.6.9
ХНФ хиральная неподвижная фаза, глава 14
ЭК эксплуатационная квалификация (performance qualification) — разработанная поль-
зователем совокупность тестов для проверки работы системы ВЭЖХ, раз-
дел 3.10.1.1
ЭХ эксклюзионная хроматография (size-exclusion chromatography, SEC) или гель-филь-
трационная хроматография, ГФХ, раздел 13.8
ЭХ-детектор
электрохимический (амперометрический) детектор (electrochemical, EC (amperometric)
detector), раздел 4.6
Менее часто используемые (или менее
общеупотребительные) символы и аббревиатуры
A поглощение
A кислотность водородных связей сорбента колонки; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
AAPS Американская ассоциация ученых-фармацевтов (American Society of Pharmaceutical
Scientists), глава 12
AOAC Ассоциация химиков-аналитиков, состоящих на государственной службе (Association
of Official Analytical Chemists), глава 12
AS коэффициент/фактор асимметрии пика (peak asymmetry factor), рис. 2.16а, раздел 2.4.2
AU единицы абсорбции (детектирование по УФ); по-русски е.п. (единицы поглоще-
ния), раздел 4.4
b параметр крутизны градиента; уравнение (9.4), раздел 9.1.3.1
B основность водородных связей сорбента колонки; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
С ионообменная емкость колонки, характеризующая электростатические взаимодей-
ствия сорбента с анализируемым веществом; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
Сm концентрация анализируемого вещества в подвижной фазе
сGMP современная надлежащая производственная практика (current Good Manufacturing
Practice), глава 12
Cs концентрация анализируемого вещества в стационарной фазе
2D-ГЭ двумерный гель-электрофорез (two-dimensional gel electrophoresis, 2D-GE), раз-
дел 13.4.5
2D-ЖХ двумерное разделение (two-dimensional separation, 2D-LC), раздел 9.3.10
Dm коэффициент диффузии вещества (см2/с); уравнение (2.19), раздел 2.4.1.1
EPA Агентство по охране окружающей среды, США (Enviromental Protection Agency),
глава 12
Fopt оптимальная объемная скорость подвижной фазы (мл/мин), раздел 2.4.1
Fs функция сравнения колонок; уравнение (5.4), раздел 5.4.2
Fs(С)
значение Fs для неионизированных образцов; уравнение (6.3), раздел 6.3.6.1
FDA Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медика-
ментов, США (US Food and Drug Administration), глава 12
G коэффициент сжатия пика в градиенте; уравнение (9.15а), раздел 9.2.4.3
H гидрофобность колонки; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
h приведенная высота теоретической тарелки; уравнение (2.18), раздел 2.4.1.1
hp высота пика
ICH Международный совет по гармонизации технических требований к регистрации
фармацевтических продуктов, предназначенных для применения человеком, США
(Internationa l Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals
in Human Use), глава 12
ISO Международная организация по стандартизации (International Organization for
Standardization), глава 12
ISPE Международное общество фармацевтической инженерии (International Society for
Pharmaceutical Engineering), глава 12
K коэффициент распределения анализируемого вещества между неподвижной и по-
движной фазами (называемый также постоянной Генри) в уравнении (15.2) изо-
термы адсорбции Ленгмюра, равный (Cs /Сm), раздел 15.3.1.1
KD коэффициент распределения в ЭХ; рис. 13.39; также коэффициент распределения
в законе распределения Нернста, уравнение (16.1)
kEB значение k этилбензола (для различных колонок при стандартных условиях); урав-
нение (5.3), раздел 5.4.1.1
kw экстраполированные значения k веществ, когда подвижная фаза вода (или водный
буфер); уравнение (2.26), раздел 2.5
k0 значение k вещества на старте градиентного элюирования, раздел 9.2.4.1
mAU милли единицы абсорбции (детектирование по поглощению в УФ)
m/z отношение массы молекулы к ее заряду
N* эффективное число теоретических тарелок при градиентном элюировании, раз-
дел 9.2.4.4
P мера общей полярности растворителя, раздел 2.3.2.1, таблица 2.3
PhRMA Американская ассоциация фармацевтических исследователей и производителей
(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America), глава 12
QuEChERS технология экстракции для пробоподготовки образцов к анализу на содержание
пестицидов (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe), раздел 16.6.7.5
R доля молекул анализируемого вещества в подвижной фазе, раздел 2.3
R+ катионный реагент для ИПХ или катионная группа анионообменника, раздел 7.4
Rанионный
реагент для ИПХ или анионная группа катионообменника, раздел 7.4
R± обозначает либо R+, либоRS*
характеристика стерических взаимодействий сорбента колонки с анализируемым
веществом; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1 (сопротивление неподвижной фазы про-
никновению объемных молекул анализируемого вещества)
SDS PAGE гель-электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, раз-
дел 13.4.5
S/N отношение сигнал/шум, раздел 4.2.3.2
TK температура (в градусах Кельвина)
TOF времяпролетный (масс-спектрометр) ( timeofflight MS-detector), раздел 4.14.3
u линейная скорость подвижной фазы (мм/мин)
ue скорость подвижной фазы между частицами сорбента или интерстициальная ско-
рость подвижной фазы (мм/мин); ue > u, раздел 2.4.1.1
ux скорость полосы анализируемого вещества при перемещении по колонке
(мм/мин)
USP Фармакопея США (United States Pharmacopeia)
VG объем градиента (равен tG F) (мл)
VM объем смешивания оборудования при градиентном элюировании (мл), раз-
дел 9.2.2.4
Vp объем пика (мл)
VS объем образца, наносимого на колонку; уравнение (2.29а), раздел 2.6.1; также объ-
ем стационарной фазы в колонке (мл)
W0 значение W в отсутствие внеколоночного размывания пика, раздел 2.4.1.1
W1/2 ширина пика на полувысоте; рис. 2.10а, раздел 2.4
X молярная доля
б* коэффициент селективности (фактор разделения) в градиентном элюировании,
раздел 9.2.4.4
б кислотность водородных связей молекул анализируемого вещества и сорбента;
уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
б кислотность водородных связей между подвижной фазой и анализируемым веще-
ством, раздел 2.3.2.1
в основность водородных связей между подвижной фазой и анализируемым вещест-
вом, раздел 2.3.2.1
в основность водородных связей молекул анализируемого вещества и сорбента;
уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
ДtR разность времен удерживания компонентов анализируемого образца в градиенте;
рис. 9.15, раздел 9.3.1.1
е диэлектрическая постоянная; также молярный коэффициент экстинкции
еe пористость сорбента (объем между частицами), раздел 2.4.1.1
еi пористость частиц сорбента (объем пор частиц), раздел 2.4.1.1
еT общая пористость колонки, раздел 2.4.1.1
цf конечное значение ц в градиентном разделении; уравнение (9.2а)
ц0 исходное значение ц в градиентном разделении; уравнение (9.2а)
з гидрофобность молекул анализируемого вещества во взаимодействии с сорбентом;
уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
эффективный ионный заряд молекул анализируемого вещества во взаимодействии
с сорбентом; уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
р* полярность подвижной фазы, раздел 2.3.2.1
у стандартное отклонение гауссовой кривой; уравнение (2.9б), раздел 2.4
у объемность молекул анализируемого вещества во взаимодействии с сорбентом;
уравнение (5.3), раздел 5.4.1.1
У сумма значений б, в и р* подвижной фазы, раздел 2.3.2.1
Ш фазовое отношение, равно VS/Vm, раздел 2.3.1
АФИ активный фармацевтический ингредиент (фармацевтическая субстанция, ФС),
глава 12
ВС водородная связь
ВПКО верхний предел количественного определения, раздел 11.2.5
ВЭ-ТСХ высокоэффективная ТСХ
ГХ газовая хроматография (gas chromatography, GC)
ГФМК гептафтормасляная кислота (HFBA)
Да Дальтон (атомная единица массы или углеродная единица, внесистемная единица,
применяемая для оценки масс молекул, атомов, атомных ядер)
ДЗА детектор заряженных аэрозолей (также называемый детектором ионизации корон-
ным разрядом; corona-discharge detector, CAD), раздел 4.13
ДМД диодно-матричный УФ-детектор (или детектор с фотодиодной матрицей; diode-array
detector, DAD), раздел 4.4.3
ДМСО диметилсульфоксид (DMSO)
ДОВ детектор дисперсии оптического вращения (optical rotary dispersion detector, ORD),
раздел 4.10
ДСН додецилсульфат натрия (SDS)
ДСЦК детектор светорассеяния на центрах (ядрах) конденсации (condensation nucleation
light-scattering detector, CNLSD), раздел 4.12.2
ДТМ диспергирование твердой матрицы для экстракции из твердых образцов (matrix solid-
phase dispersion, MSPD); таблица 16.9, раздел 16.8
ЖЖЭ экстракция в системе жидкость — жидкость (liquid—liquid extraction, LLE), раз-
дел 16.5
ЖМЭ жидкофазная микроэкстракция (liquid-phase microextraction, LPME), раздел 16.5.4.2
ЖЭД жидкостная экстакция под давлением (pressurized liquid extraction, PFE), называе-
мая также ускоренной экстракцией растворителем, УСЭР (accelerated solvent extraction,
ASE), раздел 16.8.2.3
ИДУК иминодиуксусная кислота (IDA)
ИЖЭ жидкостная экстракция на иммобилизованном носителе (immobilized liquid extraction,
ILE), раздел 16.5.4.4
ИПС изопропиловый спирт, изопропанол (IPA)
КД детектор кругового дихроизма (circular dichroism (CD) detector), раздел 4.10
КК контроль качества (quality control, QC), глава 12
КЭ капиллярный электрофорез (capillary electrophoresis, CE)
КЭХ капиллярная электрохроматография (capillary electrochromatography, CEC)
ЛИУС Лабораторная информационно-управляющая система (Laboratory Information Management
System, LIMS), раздел 3.8.1
МБТЭ метил-трет-бутиловый эфир (MTBE)
МИП молекулярно-импринтированные полимеры (molecular-imprinted polymer, MIP),
раздел 16.6.7.3
ММР молекулярно-массовое распределение (molecular-weight distribution, MWD), раз-
дел 13.10.2
МОК микроэкстракция методом одной капли (single-drop microextraction, SDME), раз-
дел 16.5.4.2
МЭ экстракция с микроволновым нагреванием (microwave-assisted extraction, MAE),
раздел 16.8.2.4
Менее часто используемые (или менее общеупотребительные) символы
и аббревиатуры
НМП наконечник микропипетки для микроэкстракции (micropipette tip, MPT), раз-
дел 16.6.3.3
НФ нормально-фазовый (только для разделений на ХНФ), глава 14
ОДП адсорбенты с ограниченно доступной поверхностью (restricted access media, RAM),
раздел 16.6.7.2
ОФ обращенно-фазовый (только для разделений на ХНФ), глава 14
ПАУ полициклические ароматические углеводороды (PAH)
ПВХ поливинилхлорид (PVC)
ПКО предел количественного определения, раздел 11.2.5, называемый также нижним
пределом количественного определения, НПКО
ПО предел обнаружения, раздел 11.2.5; также полярно-органический режим элюирова-
ния (только в разделениях на ХНФ), раздел 14.6.1
ПТМ посттрансляционная модификация (post-translational modification), глава 13
ПТФЭ политетрафторэтилен (PTFE)
ПТХ противоточная хроматография (counter current chromatography, ССС), раздел 1.3.5
ПЭЭК полиэфирэфиркетон (PEEK )
РХС распределение по химическому составу (chemical-composition distribution, CCD),
раздел 13.10.2
СОП стандартная операционная процедура, глава 12
СФХ сверхкритическая флюидная хроматография (supercritical fluid chromatography, SFC)
СФЭ сверхкритическая флюидная экстракция (supercritical fluid extraction, SFE), раз-
дел 16.8.2.2
ТГФ тетрагидрофуран (THF)
TКМЭДА трис(карбоксиметил)этилендиамин (TED)
ТМА передача (трансфер) методики анализа (analytical method transfer, AMT), глава 12
ТМКЦ триацетат микрокристаллической целлюлозы (хиральная неподвижная фаза), раз-
дел 14.6.1
ТСХ тонкослойная хроматография (thin-layer chromatography, TLC)
ТФЖЖЭ экстракция в системе жидкость — жидкость на твердой фазе (solid-supported liquid—
liquid extraction, SLE), раздел 16.5.4.3
ТФМЭ твердофазная микроэкстракция (solid-phase microextraction, SPME), раздел 16.6.3.3
ТЭАФ триэтиламмония фосфат (TEAP)
УФЦ ультрафильтрация (ultrafiltration), раздел 16.10
ФКБ фенилборная кислота (PBA)
ФС фармацевтическая субстанция (или активный фармацевтический ингредиент,
АФИ), глава 12
ХДА хиральный дериватизирующий агент (chiral derivatizing reagent, CDR), раздел 14.3
ХДПФ хиральные добавки к подвижной фазе (chiral mobile-phase-additive, CMPA), раз-
дел 14.4
ХЛАД хемилюминесцентный азотный детектор (chemiluminescent nitrogen detector,
CLND), раздел 4.9
ХС хиральный селектор, хиральный комплексообразующий агент, раздел 14.4
ЦД циклодекстрин (CD), раздел 14.6.4
ЭАС экстракция в автоматизированном аппарате Сокслета (automated Soxlet extraction,
ASE), раздел 16.8.2.1
ЭДТА 1,2-этилендиамин-N,N,N ,N -тетрауксусная кислота (EDTA)
ГЛАВА 1
ВВЕДЕНИЕ
1.1. Предварительные сведения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.1.1. Что такое ВЭЖХ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.1.2. Каковы возможности ВЭЖХ? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
1.2. Небольшой экскурс в историю ВЭЖХ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
1.3. Некоторые альтернативы ВЭЖХ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.3.1. Газовая хроматография (ГХ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.3.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.3.3. Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ). . . . . . . . . . . . . . . . 50
1.3.4. Капиллярный электрофорез (КЭ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
1.3.5. Противоточная хроматография (ПТХ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
1.3.6. Специальные виды ВЭЖХ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
1.4. Другие источники информации о ВЭЖХ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
1.4.1. Книги . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
1.4.2. Журналы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
1.4.3. Обзоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
1.4.4. Краткие курсы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
1.4.5. Интернет . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — один из нескольких хро-
матографических методов, позволяющий проводить разделение и анализ смесей хи-
мических соединений (раздел 1.3). Среди других способов разделения ВЭЖХ зани-
мает особую нишу. Ее уникальность заключается в следующем:
• практически полная универсальность, только лишь небольшое количество образ-
цов не поддаются разделению методом ВЭЖХ;
• впечатляющая прецизионность измерений (±0,5%, а в большинстве случаев еще и
точнее);
• большой выбор оборудования, колонок и других сопутствующих компонентов, по-
зволяющих с помощью ВЭЖХ решить практически любую задачу;
• подавляющее большинство лабораторий, которые имеют дело с анализом химиче-
ских смесей, оснащены оборудованием для ВЭЖХ, это первое, что покупают в ла-
бораторию.
В настоящее время ВЭЖХ является наиболее используемым и широкоприменяе-
мым методом анализа. Масс-спектрометрия конкурирует с ВЭЖХ и во многом до-
полняет ее. В сущности, оба этих метода уже применяют в комплексе (ЖХ-МС) (раз-
дел 4.14). В будущем значение такого сочетания будет расти.
В данной главе будут:
• изложены некоторые общие особенности ВЭЖХ
• обобщена история ВЭЖХ
• очень кратко рассмотрены альтернативы ВЭЖХ и их конкретные области приме-
нения
• приведен список дополнительных источников информации о ВЭЖХ
1.1. Предварительные сведения
1.1.1. Что такое ВЭЖХ?
Жидкостная хроматография появилась в начале 1900-х (рис. 1.1а-д) и в настоящее
время известна как «классическая колоночная хроматография». В стеклянный ци-
линдр помещали мелко измельченный порошок, например, мел (рис. 1.1а), сверху
в колонку на слой порошка наносили образец (рис. 1.1б) и наливали растворитель
(рис. 1.1в). Под действием гравитации растворитель проходил через слой сорбента
в колонке (рис. 1.1г), а компоненты образца (А, Б и В) вслед за растворителем начи-
нали перемещаться с разной скоростью. Таким образом происходило разделение.
Изначально процесс разделения исследовали на цветных образцах, поскольку их
перемещения по колонке можно было наблюдать визуально. Затем растворитель,
вытекающий из колонки, собирали порциями, упаривали и проводили количествен-
ный анализ полученных компонентов образца или использовали в других целях
(рис. 1.1д). В те далекие времена для разделения каждого образца требовалась от-
дельная колонка, а сам процесс проводили вручную (а не в автоматическом режиме).
Поэтому разделение было трудоемким и отнимало много времени. Тем не менее,
даже на том этапе развития хроматография предоставляла уникальные возможности
по сравнению с другими методами анализа химических смесей.
Более простой вид жидкостной хроматографии, названный бумажной хроматог-
рафией (рис. 1.1е), появился в 1940-х. Полоска бумаги заменила колонку, изображен-
ную на рис. 1.1а. Образец наносится на нижний край бумажной полосы, которую за-
тем помещают в камеру, содержащую на дне растворитель. Благодаря капиллярным
силам растворитель перемещается вверх по полосе бумаги и происходит разделение,
аналогичное процессу, изображенному на рис. 1.1г, только в противоположном на-
правлении. Позже такой «открытый» вид хроматографии модифицировали и стали
вместо бумажной полоски, используемой в бумажной хроматографии, наносить тон-
кий слой порошкообразного силикагеля на стеклянную подложку. Так появилась
тонкослойная хроматография (ТСХ)1. К преимуществам бумажной и тонкослойной
хроматографии относятся (1) удобство, (2) возможность одновременно разделять не-
сколько образцов на одной и той же полоске бумаги или пластине и (3) простота об-
наружения небольших количеств разделяемых веществ благодаря использованию ко-
лориметрических реагентов уже после завершения разделения.
Вершиной развития современной жидкостной хроматографии стала ВЭЖХ
(рис. 1.1ж,з). Хроматографист начинает анализ с того, что помещает образцы в лоток
автоматического инжектора (автосамплера), из которого они попадают в колонку
(рис. 1.1ж). Насос непрерывно прокачивает элюент через колонку. Разделенные
компоненты образца покидают колонку и регистрируются детектором. Зависимость
интенсивности сигнала от времени представляет собой хроматограмму (рис. 1.1з),
которую можно сравнить с результатом разделения, изображенным на рис. 1.1д
(при условии идентичности состава образца А+Б+В и параметров разделения).
Компьютер полностью контролирует процесс разделения, от оператора требуется то-
лько поместить образец в лоток автоматического инжектора. Кроме того, компьютер
сам для каждого образца может сформировать отчет об анализе образца. Помимо
полностью автоматизированного процесса, в ВЭЖХ используются насосы высокого
давления, что позволяет ускорить разделение, многоразовые и более эффективные
колонки, что повышает качество разделения, и надлежащий контроль всего процесса
разделения, обеспечивающий более прецизионные и воспроизводимые результаты.
Более подробная информация об истории ВЭЖХ изложена в разделе 1.2.
С появлением ВЭЖХ в конце 1960-х начинается ее развитие (раздел 1.2).
На рис. 1.2а показано ежегодное количество публикаций, посвященных ВЭЖХ. Пер-
вая статья появилась в 1966 [2]. Затем число статей каждый год росло экспонен-
циально и достигло постоянного значения только в конце 1980-х. К 1990-м годам
удалось достичь понимания процесса разделения, стали доступны необходимые обо-
рудование и колонки. В настоящее время ВЭЖХ можно рассматривать как зрелый
метод анализа, которым теперь пользуются во всем мире. В то же время новые спе-
циализированные приложения для ВЭЖХ продолжают появляться и после 1990 года.
Постоянное внимание уделяется оставшимся пробелам в нашем понимании сути
процесса, которое теперь вряд ли уже кардинально поменяется.
Хотя к 1990 году количество исследований, посвященных ВЭЖХ, перестало рас-
ти, на аналогичную стабилизацию экономики ВЭЖХ ушло немного больше времени,
что подтверждает график (рис. 1.2б) зависимости ежегодных расходов от времени для
всех продуктов ВЭЖХ (без учета инфляции). Ежегодные затраты на ВЭЖХ в настоя-
щее время превышают затраты на любую другую аналитическую технику.
1.1.2. Каковы возможности ВЭЖХ?
Во втором издании этой книги, которое вышло в свет в 1979 году, были опубликова-
ны некоторые примеры возможностей ВЭЖХ. Два из них приведены и в этой книге
(рис. 1.3). На рис. 1.3а изображено экспресс-разделение 15 соединений продолжите-
льностью 1 минута. В другом примере (рис. 1.3б) на неполное разделение более чем
100 пиков потребовалось всего лишь 30 мин. Для сравнения на рис. 1.4 представлены
разделения, проведенные спустя 25 лет. Обратите внимание на первую хроматограм-
му (рис. 1.4а), на которой за 7 секунд удалось разделить 6 белков, а на разделение
более 1000 пептидов и белков (рис 1.4б,в) ушло всего 1,5 часа. Улучшение раз-
деления, наблюдаемое на рис. 1.4а в сравнении с 1.3а, удалось получить благодаря
нескольким факторам, часть из которых обсуждается в разделе 1.2. Разделение
1000 соединений (рис. 1.4б,в) проводили с помощью так называемой двумерной хро-
матографии (раздел 9.3.10), смысл которой заключается в том, что сначала образец
фракционируют на одной колонке, а потом полученные фракции разделяют на вто-
рой колонке. В этом примере каждую фракцию с первой колонки собирали в тече-
ние 4 минут, затем делили на второй колонке. На рис. 1.4в показано разделение
фракции 7. Общее количество (распознаваемых) пиков в образце получили, просум-
мировав пики индивидуальных веществ, присутствующие в каждой фракции. Огром-
ный прогресс, достигнутый в производительности ВЭЖХ за предыдущие 25 лет
(сравните рис. 1.3 и 1.4), позволяет предположить, что в ближайшие годы вряд ли
стоит ожидать сопоставимые существенные улучшения в скорости или эффективно-
сти разделения.
С 1979 года имели место и другие столь же значимые достижения в ВЭЖХ. На-
чиная с 1980-х годов появляются колонки, пригодные для разделения белков и дру-
гих крупных биомолекул [7, 8], что открыло совершенно новую область применения
ВЭЖХ и способствовало значительному прогрессу в области биохимии. Благодаря
разработанным Пирклом и др. [9]1 хиральным колонкам для разделения энантиоме-
ров, такой же прогресс наблюдается в области фармацевтики и связанных с ней нау-
ках о жизни.
Также растет интерес к ВЭЖХ очистке веществ в крупных масштабах благодаря
доступности соответствующего оборудования, глубокому пониманию того, как лучше
всего провести то или иное разделение, а также вследствие ужесточения требований
контрольных органов к чистоте фармацевтических препаратов.
1.2. Небольшой экскурс в историю ВЭЖХ
В разделе 1.1 описано развитие жидкостной хроматографии до появления ВЭЖХ.
Чтобы заполнить все пробелы в истории ВЭЖХ до 1965 года, можно обратиться
к обзорам, написанным «историком хроматографии» Лесли Эттером:
• предшественники хроматографии; разработки в период до 1900 [10, 11];
• создание хроматографии М.С. Цветом в начале 1900-х [12];
• повторное открытие хроматографии в начале 1930-х [13];
• создание А.Дж.П. Мартином распределительной и бумажной хроматографии в на-
чале 1940-х [14];
• разработка аминокислотного анализатора С. Муром и У.С. Штайном к концу
1950-х [15];
• разработка гель-проникающей хроматографии компанией Waters в начале
1960-х [16].
Карл Рунге, немецкий химик, занимавшийся красителями, родился в 1856 году.
Он первым сообщил о разделении неочищенных красителей методом, похожим на бу-
мажную хроматографию [10], однако ни он, ни другие исследователи не стали разви-
вать практические возможности этой работы. В конце 1890-х годов Дэвид Дэй из Гео-
логической Службы США разделял нефть методом, напоминающим классическую
колоночную хроматографию [11]. Однако целью этой работы была не разработка мето-
дики разделения, а демонстрация того, что различное качество нефти из разных место-
рождений обусловлено ее разделением при прохождении сквозь слои земли. Исследо-
вания Дэвида Дэя, также как и труды Карла Рунге, не были продолжены. В начале
1900-х Михаил Цвет изобрел классическую колоночную хроматографию и продемо-
нстрировал разделение экстрактов различных растений [12]. Это событие, безусловно,
считается началом хроматографии, хотя в последующие два десятилетия эту работу
по достоинству так и не оценили. В начале 1930-х годов на работу Цвета вновь обрати-
ли внимание [13], что привело к последующему бурному развитию хроматографии.
В 1943 году А.Дж.П. Мартин разработал бумажную хроматографию [14], наряду с этим
с конца 1930-х до середины 1950-х была введена в практику тонкослойная хроматогра-
фия [17]. Такое краткое извлечение из истории, охватывающее период до 1955 года,
неизбежно влечет за собой потерю огромного количества работ других исследователей,
которые также внесли свой вклад в развитие хроматографии.
В конце 1950-х [15] годов был создан аминокислотный анализатор — основной
предшественник ВЭЖХ. Смеси аминокислот на нем анализировали методом ионооб-
менной хроматографии в автоматическом режиме (раздел 7.5). За этим событием по-
следовала разработка Муром [18] гель-проникающей хроматографии (раздел 13.8),
а в начале 1960-х компания Waters [16] использовала ее на практике. Каждый из этих
методов был по своим принципам близок к тому, что позже стали называть ВЭЖХ, и
немногим отличался от схемы, изображенной на рис. 1.1ж,з. В каждом из этих слу-
чаев через многоразовую наполненную мелкозернистым сорбентом колонку насос
под высоким давлением прокачивал растворитель, который после выхода из колонки
направлялся в детектор. Итогом разделения была хроматограмма (рис. 1.1з). Чего же
не хватало двум этим системам? Возможности разделять и анализировать разного
рода образцы. Аминокислотный анализатор ограничивался лишь анализом ами-
нокислотных смесей, а гель-проникающая хроматография служила исключительно
для определения распределения молекулярной массы синтетических полимеров.
Ни один из этих методов не был адаптирован для других образцов.
В начале 1960-х две группы, одна в США под руководством Чаба Хорвата, дру-
гая — в Европе под руководством Йозефа Хубера, приступили к разработке
ВЭЖХ-системы универсального назначения. Оба ученых описали свои ранние работы в личных воспоминаниях [19], а Эттре предоставил дополнительную информацию
о начале работы в лаборатории Хорвата [20]. Непосредственные работы этих групп,
а также связанные с ними работы других исследователей, проведенные несколькими
годами позже, описаны в статьях за период с 1966 по 1968 годы [2, 21—24]. Серийное
оборудование для ВЭЖХ появилось в конце 1960-х. Изначально монополистами
на рынке были компании Waters Associates и DuPont. Вскоре и другие фирмы смогли
предложить конкурентоспособные хроматографические системы. Началось стреми-
тельное развитие ВЭЖХ (см. рис. 1.2а). В 1971 году появилась первая книга о ВЭЖХ
[25], а Американское Химическое Сообщество представило краткий курс лекций
(Современная жидкостная хроматография), авторами которого были Дж.Дж. Кирк-
ленд и Л.Р. Снайдер.
Прогресс в ВЭЖХ-разделениях показан на рис. 1.5а-е, на котором видно, что
продолжительность анализа за 50 лет, начиная с 1960 г., сократилась на несколько
порядков. На рис. 1.5ж видно, что сокращение времени разделения ( , —) связано с увеличением перепада давления в колонке (---) и уменьшением размера частиц
сорбента (•). Поэтому на ранних этапах развития ВЭЖХ этот метод иногда называли
«жидкостная хроматография высокого давления» или «высокоскоростная жидкостная
хроматография». На рис. 1.5з показаны соответствующие изменения длины колонки
(•) и скорости потока ( ) для этих экспериментов (рис. 1.5а-е).
Еще задолго до 1960-х годов были разработаны теоретические принципы буду-
щего развития ВЭЖХ. В 1941 г. Мартин сообщал [27]: «самые эффективные колонки
… должны быть заполнены частицами небольшого размера и работать при больших
перепадах давления». Так, в двух словах, можно сформулировать суть ВЭЖХ (как по-
казано на рис. 1.5ж). В начале 1950-х Мартин создал смежный метод — газовую хро-
матографию [28]. Очень быстро этот метод стал популярен во всем мире [29], что
привело к ряду теоретических исследований, которые потом будут иметь отношение
к развитию ВЭЖХ. В начале 1960-х Гиддингз обобщил и продолжил эту работу уже
для определенных областей применения ВЭЖХ [30]. В будущем его работа оказалась
очень важна как для определения конструкции колонок, так и для выбора подходя-
щих экспериментальных условий.
Более подробно история ранних этапов развития ВЭЖХ описана в работах [19,
31—33]. Дополнительные исторические детали, касающиеся периода после 1980 года,
можно найти в собрании биографий некоторых разработчиков ВЭЖХ [34].
1.3. Некоторые альтернативы ВЭЖХ
Газовая хроматография (ГХ) и тонкослойная хроматография (ТСХ) — два основных
метода, существовавшие еще до 1965 года, каждая из которых в определенных ситуа-
циях может быть использована вместо ВЭЖХ. Еще один метод, разработанный до
1965 года, называется противоточной хроматографией (ПТХ). В принципе, он может
составить конкуренцию ВЭЖХ в решении многих задач, но в скорости и производи-
тельности с ВЭЖХ он не сравнится. После создания ВЭЖХ были разработаны неко-
торые дополнительные, потенциально конкурентоспособные методы разделения:
сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) в 1970-х, капиллярный электро-
форез (КЭ) в 1980-х, капиллярная электрохроматография (КЭХ) в 1990-х.
1.3.1. Газовая хроматография (ГХ)
Методом ГХ [35] можно проанализировать только те образцы, которые будут находи-
ться в газовой фазе1 при температурах ниже 300 °С. То есть вещества, кипящие при
очень высоких температурах или вообще нелетучие, а это примерно 75% всех извест-
ных соединений, невозможно разделить с помощью ГХ. С другой стороны, ГХ отли-
чается большей эффективностью (большим числом теоретических тарелок), а это
значит, что разделение проходит быстрее и/или лучше. Поэтому ГХ предпочтитель-
нее ВЭЖХ при анализе газов, большинства низкокипящих веществ и множества
образцов, кипящих при высоких температурах, но при этом термически стабильных
в условиях разделения. Кроме того, в арсенале ГХ имеются достаточно чувствитель-
ные детекторы и/или специфические детекторы селективные к конкретным элемен-
там, благодаря чему можно существенно снизить пределы обнаружения.
1.3.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ)
К преимуществу ТСХ [36] относится возможность одновременно на одной пластинке
разделять несколько проб, причем каждый компонент пробы в конце разделения ви-
ден на пластинке (в ВЭЖХ сильно удерживаемые вещества могут вообще не элюиро-
ваться с колонки и отсутствовать на хроматограмме). При использовании специально-
го оборудования, способного под давлением направлять поток растворителя от одного
края пластины к другому, стала возможна так называемая высокоэффективная ТСХ
(ВЭ-ТСХ). Вне зависимости от того, как осуществляется ТСХ, по эффективности
(числу теоретических тарелок) разделения она, тем не менее, проигрывает ВЭЖХ, да и
количественный анализ в таких условиях менее удобен и точен. ТСХ к 2010 г в США
при количественных анализах использовали довольно редко, хотя для полуколичес-
твенного анализа и определения примесей в образце этот метод очень удобен. ТСХ
широко используется для скрининга большого количества образцов без необходимости
существенной их очистки (например, контроль лекарственного препарата в плазме).
ВЭ-ТСХ более популярна в Европе, чем в США, но гораздо менее, чем ВЭЖХ.
1.3.3. Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ)
Оборудование и колонки для СФХ [37] похожи на использующиеся в ВЭЖХ. Раство-
рителем, по определению, является сверхкритическая жидкость, обычно это углекис-
лый газ при повышенном давлении и температуре. СФХ можно рассматривать, как
расширение возможностей ГХ вследствие способности сверхкритической жидкости
растворять и разделять нелетучие в обычных условиях соединения. То есть, СФХ зани-
мает промежуточное положение между ГХ и ВЭЖХ и характеризуется большей эффек-
тивностью разделения (больше N) по сравнению с ВЭЖХ, но меньшей в сравнении
с ГХ. Растворитель для СФХ имеет боќльшее значение, чем в ГХ, но меІньшее, чем
в ВЭЖХ. Чувствительность обнаружения в СФХ тоже находится между ВЭЖХ и ГХ.
СФХ в основном используют для анализа природных и синтетических полимерных
смесей, например, для разделения полифенолов [38]. Если в некоторых случаях ВЭЖХ
не позволяет разделить полимеры свыше некоторого максимума молекулярной массы,
то СФХ обычно значительно поднимает верхнюю границу предела молекулярной мас-
сы. Кроме того, с помощью СФХ разделяют энантиомеры, у которых близки времена
удерживания, и поэтому требуется боќльшая эффективность разделения (большее N).
1.3.4. Капиллярный электрофорез (КЭ)
КЭ [1, 39] не является одним из видов хроматографии, но в эффективности разделе-
ния определенных классов соединений может составить конкуренцию ВЭЖХ. Прин-
цип разделения заключается в разной скорости миграции веществ внутри капилляра.
Под воздействием электрического поля молекулы разделяются в зависимости от от-
ношения массы к заряду (m/z). Соединения с небольшим соотношением m/z мигри-
руют быстрее. Следовательно, с помощью КЭ можно разделять только заряженные
молекулы. По сравнению с ВЭЖХ у КЭ эффективность разделения выше (больше
N), особенно при разделении соединений с большой молекулярной массой. Однако
чувствительность обнаружения в случае КЭ обычно хуже, чем в ВЭЖХ. КЭ широко
применяется для анализа геномных образцов, основанного на фракционировании
ДНК-фрагментов. Кроме того, КЭ активно используют для разделения энантиоме-
ров, где его эффективность может быть выше ВЭЖХ по двум причинам: во-первых,
такие разделения, как правило, трудны, и для них требуется боќльшее значение N, что
может обеспечить КЭ; во-вторых, ВЭЖХ разделения обычно проводят на хиральных
колонках. Прежде чем получить удовлетворительный результат, каждый конкретный
образец разделяют методом проб и ошибок на нескольких разных (и дорогостоящих)
колонках, в то время как для КЭ достаточно всего лишь небольшого количества раз-
ных хиральных селекторов. В отличие от ВЭЖХ разделение происходит быстрее,
стоит дешевле, а метод является более универсальным. Дорогие хиральные комплек-
сообразующие реагенты нецелесообразно использовать в ВЭЖХ, поскольку скорости
потока в обычной ВЭЖХ много больше, чем в КЭ (мл/мин против мкл/мин). Кроме
того, существуют несколько вариантов КЭ, расширяющих использование этого мето-
да для других типов образцов. К примеру, с помощью мицеллярной электрокинети-
ческой хроматографии можно разделять неионные соединения [40].
1.3.5. Противоточная хроматография (ПТХ)
ПТХ [41, 42] представляет собой более ранний вид жидкостно-жидкостной распреде-
лительной хроматографии, впоследствии улучшенной различными способами.
ВЭЖХ с жидкой неподвижной фазой была вытеснена ВЭЖХ с привитыми фазами, и
потому ПТХ в качестве альтернативы ВЭЖХ стали использовать все реже. Часто
упоминаемая особенность ПТХ — отсутствие проблем, вызванных необратимой сор-
бцией образца на обширной внутренней поверхности колонок в ВЭЖХ. Однако ис-
пользуемые в настоящее время колонки для ВЭЖХ лишены этого недостатка. У ПТХ
есть некоторые преимущества при препаративном разделении энантиомеров [43].
В остальных случаях эта методика используется главным образом для выделения ла-
бильных природных соединений.
1.3.6. Специальные виды ВЭЖХ
В разделах 1.3.1—1.3.5 описаны пять методов разделения, существенно отличающих-
ся от ВЭЖХ. Еще четыре, о которых в данной книге речь не пойдет, можно отнести
к разновидностям ВЭЖХ. Тем не менее большая часть используемой в следующих
главах информации может быть применена и для них.
Капиллярная электрохроматография [44, 45] (КЭХ), в основном, подобна ВЭЖХ
за исключением одного момента: растворитель проходит через колонку не с помо-
щью нагнетающего его насоса, а посредством создания электрического потенциала
на концах колонки (эндоосмотический поток). Поскольку поток растворителя никак
не зависит от размера частиц сорбента (а эффективность колонки может быть выше
при малом размере частиц), то, в принципе, с помощью КЭХ можно получить гораз-
до большие значения N, чем с помощью обычной ВЭЖХ. Кроме того, N также уве-
личивается благодаря собственно эндоосмотическому потоку. Имея в виду потенциа-
льно большие значения N в КЭХ по сравнению с ВЭЖХ, с 1995 года в практическую
реализацию этого метода инвестировались значительные средства, однако к моменту
выхода из печати этой книги оставались нерешенными важные технические пробле-
мы, не позволяющие КЭХ стать рутинной альтернативой ВЭЖХ.
ВЭЖХ на чипе [46] — недавно разработанная технология для удобного анализа
небольших количеств образца. Микроколонку (например, 43 Ї 0,06 мм), которая яв-
ляется частью чипа, устанавливают между микронасосом и масс-спектрометром.
Принцип разделения такой же, как и в ВЭЖХ с обычными колонками и оборудо-
ванием. К преимуществам можно отнести эффективность разделения и удобство
при разделении очень малых количеств образца.
Ионная хроматография [47, 48] — широко используемая методика анализа сме-
сей, содержащих неорганические анионы и катионы, например, Clи
Na+ соответственно. Хотя принципы разделения такие же, как и в ионообменной ВЭЖХ (раздел 7.5), для ионной хроматографии требуется особое оборудование. Эта методика,
главным образом, предназначена для анализа неорганических соединений.
Мицеллярная жидкостная хроматография — вариант обращенно-фазовой хрома-
тографии, только вместо водно-органических элюентов используют водный раствор
поверхностно активного вещества [49]. В настоящее время эта методика очень редко
применяется из-за низкой эффективности разделения.
1.4. Другие источники информации о ВЭЖХ
В дополнение к данной книге имеется огромное количество других доступных источ-
ников информации. К ним относятся различные публикации (раздел 1.4.1-1.4.3),
краткие курсы (раздел 1.4.4) и интернет (раздел 1.4.5).
1.4.1. Книги
К настоящему времени изданы сотни книг, которые легко можно найти в интернете на
сайте Amazon.com и других сайтах. Книги по ВЭЖХ можно разделить на 2 группы:
1. специализированные книги, посвященные ВЭЖХ разделениям образцов опреде-
ленного типа (например, белков, углеводов, энантиомеров и др.) или особенно-
стям детектирования (например, масс-спектрометрии, химической дериватиза-
ции);
2. общие книги, такие как эта книга, охватывающие все аспекты ВЭЖХ.
Далее в конце глав перечислены профильные книги по разным тематикам
ВЭЖХ. В таблице 1.1 приведен неполный список книг по общим темам ВЭЖХ,
опубликованных с 1995 года. Они могут оказаться полезным дополнением к настоя-
щей книге.
1.4.2. Журналы
Технические статьи по ВЭЖХ можно найти в большинстве химических и биохимичес-
ких журналов. Тем не менее, приведенный ниже список журналов будет особенно це-
нен для тех читателей, которые хотят быть в курсе новых разработок в этой области.
• Analytical Chemistry, American Chemical Society
• Chromatographia, Springer
• Journal of Chromatographic Science, Preston
• Journal of Chromatography A, Elsevier
• Journal of Chromatography B, Elsevier
• Journal of Liquid Chromatography, Wiley
• Journal of Separation Science, Wiley
• LCGC, Advanstar (separate issues for North America and Europe)
1.4.3. Обзоры
Обзоры по ВЭЖХ можно найти не только в тех журналах, которые перечислены
выше, но и в других. Кроме того, есть ряд публикаций, частично посвященных
ВЭЖХ, изданных или в виде сборников обзорных статей
• Advances in Chromatography, Dekker
• High-Performance Liquid Chromatography. Advances and Perspectives, Academic Press
(публиковались только с 1980 г. по 1986 г.)
или как отдельные книги:
• Journal of Chromatography Library, Elsevier
1.4.4. Краткие курсы
В настоящее время существует огромное количество кратких курсов, которые чита-
ются как вживую, так и через интернет (раздел 1.4.5). Актуальный список кратких
курсов можно найти на последней странице журнала LCGC, либо в интернете по за-
просу «ВЭЖХ тренинг».
1.4.5. Интернет
Динамичное развитие интернета гарантирует нам быстрое устаревание напечатанной
в книге информации. Нижеперечисленные сайты содержат ссылки на другие сайты
и, вполне очевидно, будут таким образом постоянно обновляться:
• http://www.lcresources.com
• http://matematicas.udea.edu.co/carlopez/index7.html
• http://lchromatography.com/hplcfind/index.html
• thtp://tech.groups.yahoo.com/group/chrom-L/links
• http://userpages.umbc.edu/dfrey1/Freylink
• http://www.infochembio.ethz.ch/links/en/analytchem_chromat.html
• http://www.chromatographyonline.com
Литература
1. R. L. Cunico, K. M. Gooding, and T. Wehr, Basic HPLC and CE of Biomolecules, Bay Bioanalytical
Laboratory, Richmond, CA, 1998, p. 4.
2. C. G. Horvбth and S. R. Lipsky, Nature, 211 (1966) 748.
3. I. Halasz, R. Endele, and J. Asshauer, J. Chromatogr., 112 (1975) 37.
4. I. Molnar and C. Horvбth, J. Chromatogr. (Biomed App.), 143 (1977) 391.
5. T. Issaeva, A. Kourganov, and K. Unger, J. Chromatogr. A, 846 (1999) 13.
6. K. Wagner, T. Miliotis, G. Marko-Varga, R. Biscoff, and K. Unger, Anal. Chem., 74(2002) 809.
7. S. H. Chang, K. M. Gooding, and F. E. Regnier, J. Chromatogr., 125 (1976) 103.
8. W. W. Hancock, C. A. Bishop, and M. T. W. Hearn, Science, 153 (1978) 1168.
9. W. H. Pirkle, D. W. House, and J. M. Finn, J. Chromatogr., 192 (1980) 143.
10. H. H. Bussemas and L. S. Ettre, LCGC, 22 (2004) 262.
11. L. S. Ettre, LCGC, 23 (2005) 1274.
12. L. S. Ettre, LCGC, 21 (2003) 458.
13. L. S. Ettre, LCGC, 25 (2007) 640.
14. L. S. Ettre, LCGC, 19 (2001) 506.
15. L. S. Ettre, LCGC, 243 (2006) 390.
16. L. S. Ettre, LCGC, 23 (2005) 752.
17. J. G. Kirchner, Thin-layer Chromatography, Wiley-Interscience, New York, 1978, pp. 5—8.
18. J. C. Moore, J. Polymer Sci. Part A, 2 (1964) 835.
19. L. S. Ettre and A. Zlatkis, eds., 75 years of Chromatography—A Historical Dialog, Elsevier, Amsterdam,
1979.
20. L. S. Ettre, LCGC, 23 (2005) 486.
21. J. F. K. Huber and J. A. R. Hulsman, J. Anal. Chim. Acta, 38 (1967) 305.
22. J. J. Kirkland, Anal. Chem., 40 (1968) 218.
23. L. R. Snyder, Anal. Chem., 39 (1967) 698, 705.
24. R. P. W. Scott, W. J. Blackburn, and T. J. Wilkens, J. Gas Chrommatogr., 5 (1967) 183.
25. J. J. Kirkland, ed., Modern Practice of Liquid Chromatography, Wiley-Interscience, New York,
1971.
26. T. Braumann, G. Weber, and L. H. Grimme, J. Chromatogr., 261 (1983) 329.
27. A. J. P. Martin and R. L. M. Synge, Biochem. J., 35 (1941) 1358.
28. A. T. James and A. J. P. Martin, Biochem. J., 50 (1952) 679.
29. L. S. Ettre, LCGC, 19 (2001) 120.
30. J. C. Giddings, Dynamics of Chromatography. Principles and Theory, Dekker, NewYork, 1965.
31. L. R. Snyder, J. Chem. Ed., 74 (1997) 37.
32. L. S. Ettre, LCGC Europe, 1 (2001) 314.
33. L. R. Snyder, Anal. Chem., 72 (2000) 412A.
34. C. W. Gehrke, ed., Chromatography—A Century of Discovery 1900—2000, Elsevier, Amsterdam,
2001.
35. R. L. Grob and E. F. Barry, Modern Practice of Gas Chromatography, 4th ed.,Wiley-Interscience,
NewYork, 2004.
36. B. Fried and J. Sherma, Thin-Layer Chromatography (Chromatographic Science, Vol.81), Dekker,
New York, 1999.
37. R. M. Smith and S. M. Hawthorne, eds., Supercritical Fluids in Chromatography and Extraction, Elsevier,
Amsterdam, 1997.
38. T. Bamba, E. Fukusaki, Y. Nakazawa, H. Sato, K. Ute, T. Kitayama, and A. Kobayashi, J. Chromatogr.
A, 995 (2003) 203.
39. K. D. Altria and D. Elder, J. Chromatogr. A, 1023 (2004) 1.
40. A. Berthod and C. Gбrcia-Alvarez-Coque, Micellar Liquid Chromatography, Dekker, New York,
2000.
41. Y. Ito and W. D. Conway, eds., High-Speed Countercurrent Chromatography, Wiley, New York,
1996.
42. J.-M. Menet and D. Thiebaut, eds., Countercurrent Chromatography, Dekker, NewYork, 1999.
43. E. Gavioli, N.M.Maier, C.Minguillьn, and W. Lindner, Anal. Chem., 76 (2004) 5837.
44. K. D. Bartle and P. Meyers, Capillary Electrochromatography (Chromatography Monographs),2001.
45. F. Svec, ed., J. Chromatogr. A, 1044 (2004).
46.H. Yin and K. Killeen, J. Sep. Sci., 30 (2007) 1427.
47. J. S. Fritz and D. T. Gjerde, Ion Chromatography, 3rd ed., Wiley-VCH, Weinheim, 2000.
48. J. Weiss, Handbook of Ion Chromatography, 3rd ed., Wiley, 2005.
49. A. Berthod and M. C. Gбrcia-Alvarez-Coque, Micellar Liquid Chromatography, Dekker, New York, 2000.
ГЛАВА 2
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ И УПРАВЛЕНИЕ РАЗДЕЛЕНИЕМ
2.1. Введение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2. Хроматографический процесс . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.3. Удерживание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.3.1. Фактор удерживания k и мертвое время колонки t0 . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.3.2. Роль условий разделения и состава образца . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
2.3.2.1. Межмолекулярные взаимодействия. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.3.2.2. Температура . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.4. Ширина пика и число теоретических тарелок колонки N . . . . . . . . . . . . . . . . 71
2.4.1. Зависимость N от условий разделения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.4.1.1. Процессы размывания пика, определяющие значения N. . . . . . . 76
2.4.1.2. Несколько рекомендаций по выбору колонки . . . . . . . . . . . . . . . 82
2.4.2. Форма пика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
2.5. Разрешение и разработка метода. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
2.5.1. Оптимизация фактора удерживания k (член а в уравнении (2.24)) . . . . . 93
2.5.2. Оптимизация селективности б (член б в уравнении (2.24)) . . . . . . . . . . . 95
2.5.2.1. «Правильные» и «неправильные» образцы. . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
2.5.3. Оптимизация числа теоретических тарелок N (член в в уравнении (2.24)) . 97
2.5.3.1. Зависимость результатов разделения от параметров колонки. . . . 97
2.5.3.2. Скоростная ВЭЖХ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
2.5.4. Разработка метода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
2.5.4.1. Оценка состава образца и целей разделения . . . . . . . . . . . . . . . 101
2.5.4.2. Пробоподготовка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
2.5.4.3. Выбор вида хроматографии. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
2.5.4.4 Выбор детектора . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
2.5.4.5. Выбор хроматографических условий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
2.5.4.6. Спрогнозировать, определить и решить возможные проблемы. . 103
2.5.4.7. Валидация метода и пригодность системы. . . . . . . . . . . . . . . . . 104
2.6. Влияние количества пробы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
2.6.1. Перегрузка по объему: влияние объема образца на разделение . . . . . . . 105
2.6.2. Перегрузка по массе: влияние массы образца на разделение . . . . . . . . . 107
2.6.3. Как избежать проблем, связанных со слишком большим количеством
образца . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
2.6.3.1.Если концентрация образца больше ожидаемой . . . . . . . . . . . . . 109
2.6.3.2. Анализ следовых количеств вещества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
2.7. Смежные темы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
2.7.1. Уравновешивание колонки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
2.7.2. Градиентное элюирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
2.7.3. Пиковая емкость и двумерное разделение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.7.4. Отслеживание пика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
2.7.5. Вторичные равновесия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
2.7.6. Переключение колонок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
2.7.7. Предварительная оценка удерживания по структуре анализируемого
вещества . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
2.7.7.1. Модель сольватационных параметров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
2.1. Введение
Без понимания того, как разделение зависит от экспериментальных условий (колон-
ка, растворитель, температура, скорость потока и т.д.) оно успешным не будет.
В этой главе будут рассмотрены некоторые общие аспекты ВЭЖХ, которые помогут
разработать приемлемое разделение (разработка метода), выполнять рутинные
ВЭЖХ-анализы образцов и преодолевать трудности по мере их возникновения.
Как правило, описательный или качественный подход лучше всего позволяет понять
процесс разработки метода и использование ВЭЖХ в рутинных целях. Поэтому
читатель может пролистать или пропустить любые из последующих выводов формул,
по крайнее мере при ознакомлении с текстом. Важные уравнения, необходимые в ра-
боте, помещены в рамочку, например, уравнение (2.5).
2.2. Хроматографический процесс
На рис. 2.1 схематически изображена ВЭЖХ-система. Сплошными стрелками указа-
но направление потока: из емкости с растворителем к детектору. Растворитель обыч-
но называют элюентом или подвижной фазой. В главе 3 более подробно описан каж-
дый узел ВЭЖХ-системы. После того, как образец из инжектора попадает в колонку,
происходит разделение. Разделенные компоненты образца покидают колонку (элюи-
руются или вымываются из нее) и с потоком подвижной фазы направляются в де-
тектор, в большинстве случаев ультрафиолетовый (УФ) или масс-спектрометриче-
ский (МС). В главе 4 подробно рассказано о каждом виде ВЭЖХ-детекторов.
Основные свойства или «режим» разделения определяются, главным образом, выбо-
ром колонки (табл. 2.1). В настоящее время для анализа образцов преимущественно
используют обращенно-фазовую хроматографию (ОФХ), для которой характерно
использование неполярной неподвижной фазы (колонки) совместно с полярной
подвижной фазой (смесь воды и органического растворителя). В этой книге, если
не оговорено иное, в основном, рассматриваются разделения в режиме ОФХ. Другие
режимы ВЭЖХ можно найти в нижеследующих разделах этой книги (табл. 2.1).
В главах 2—8 мы будем считать состав растворителей на протяжении всего разделе-
ния постоянным, что характерно для изократического элюирования. В случае гради-
ентного элюирования соотношение элюентов во время разделения сознательно изме-
няют (раздел 2.7.2, глава 9).
Колонка представляет собой цилиндрическую трубку, наполненную чаще всего
небольшими (как правило, диаметром от 1,5 до 5 мкм) сферическими частицами (рис. 2.2а). Основой частицы в большинстве случаев является пористый силикагель.
На рис. 2.2 изображена пора в виде цилиндра определенного диаметра (обычно око-
ло 10 нм для «небольших молекул» массой менее 1000 Да). Внутренняя поверхность
каждой поры покрыта неподвижной фазой, в этом примере группами С18, привитыми
к частице силикагеля. На рис. 2.2в можно видеть приближенное к реальности изоб-
ражение современных пористых частиц для ВЭЖХ. Частицы, как показано на рисун-
ке, формируются из небольших сферических субчастиц. Поры представляют собой
пространство между субчастицами. Поскольку практически вся поверхность частицы
находится внутри этих пор, то большинство молекул образца удерживаются внутри
частицы, а не на ее поверхности. На внутреннюю поверхность пор приходится более
99% всей площади поверхности частиц, поэтому влияние внешней поверхности
частицы на разделение в большинстве случаев ничтожно мало. Подвижная фаза, перемещаясь внутри колонки, обволакивает каждую частицу, и благодаря диффузии
молекулы образца проникают в поры частиц. Обычно поток практически никогда не
течет сквозь частицу.
На рис. 2.3 изображено гипотетическое разделение образца, содержащего три со-
единения (или три растворенных вещества). Вещество X обозначено •, Y — , Z — μ.
Молекулы элюента для упрощения не показаны, а молекулы растворителя, в кото-
ром растворен образец, изображены в виде +. Нанесенный на колонку образец
(рис. 2.3а) под действием потока подвижной фазы перемещается по колонке
(рис. 2.3б-г) и, в итоге, растворенные вещества последовательно вымывается из нее
(рис. 2.3д). Детектор при этом регистрирует изменение сигнала в зависимости от вре-
мени, такую запись разделения называют хроматограммой. Во время разделения
(рис. 2.3а-г) вещества X, Y, Z ведут себя по-разному: различаются скорости их пере-
мещения и распределение молекул этих веществ. К моменту, показаному на рис. 2.3г,
вещества X, Y, Z внутри колонки отделились друг от друга.
Различные скорости перемещения (разные средние скорости, с которыми веще-
ства X, Y, Z двигаются или перемещаются внутри колонки) являются основой хроматографического разделения. Отсутствие разницы в скорости перемещения говорит
о невозможности разделения двух соединений. В этом примере быстрее всех переме-
щаются молекулы X (•), а медленнее всех — Z (μ). Молекулы растворителя, в кото-
ром растворен образец, как и молекулы подвижной фазы, вообще не удерживаются
на колонке, проскакивают сквозь нее быстрее всех и вымываются из колонки рань-
ше молекул образца. На рисунке молекулы растворителя образца показаны +
(рис. 2.3б-д).
По мере перемещения вещества по колонке его молекулы все более существенно
распределяются по ее объему. Объем, который занимают молекулы вещества внутри
колонки, называют полосой или зоной. Ширина этого объема измеряется по направле-
нию потока и называется шириной полосы. На рисунке 2.3а-г ширина полосы для ве-
щества X (•) указана стрелкой и скобкой. Полоса, смытая с колонки и зарегистри-
рованная на хроматограмме (рис. 2.3д), называется пиком. Распознавание пика проводят по времени его выхода из колонки (время удерживания tR)1. Концентрация
растворенного вещества в образце пропорциональна размеру пика, определяемому
либо по его площади, либо по его высоте (раздел 11.2.3). При достаточно малом коли-
честве вещества, наносимом на колонку (от нескольких нанограмм до микрограмм,
что характерно для количественного ВЭЖХ-анализа), время удерживания не зависит
от концентрации образца (и размера получающегося пика). Далее в этой главе зависи-
мость разделения от экспериментальных условий будет изучена подробнее.
2.3. Удерживание
Время удерживания вещества tR — это промежуток времени, которое проходит с мо-
мента ввода вещества в инжектор до появления вершины пика на хроматограмме.
Время удерживания веществ X, Y, Z соответственно 2, 3 и 5 минут (рис. 2.3д). Время
удерживания пика растворителя, равное одной минуте, называют мертвым временем
t0 колонки (раздел 2.3.1) (иногда для обозначения мертвого времени колонки t0 за-
меняют tm). Степень перемещения или скорость ux, с которой вещество X двигается
по колонке, определяется фракцией R молекул вещества X, находящихся в любой
момент времени в подвижной фазе. В среднем ux равна R, умноженной на скорость
перемещения или скорость u молекул растворителя:
ux = Ru. (2.1)
Например, если половина молекул X находится в подвижной фазе (R = 0,5),
а вторая половина адсорбировалась на неподвижной фазе, значит, в любой момент
времени только половина всех молекул перемещается с потоком и, следовательно,
средняя скорость вещества X будет равна половине скорости движения подвижной
фазы.
На рис. 2.4 показано, что фракция R молекул вещества X в подвижной (движу-
щейся) фазе определяется равновесным процессом:
X (подвижная фаза) X (сорбент). (2.2)
Молекулы X в любой момент времени присутствуют в равном количестве в по-
движной и неподвижной фазах, в то время как молекулы вещества Z преимущест-
венно адсорбировались на неподвижной фазе. То есть вещество Z сильнее удержива-
ется по сравнению с веществом X, а значит, и перемещается медленнее (указано
в нижней части рис. 2.4 стрелками, длина которых отражает скорость перемещения).
На это равновесие и скорость перемещения вещества влияют структура молекулы,
химический состав элюента и сорбента (растворителя и колонки), а также температу-
ра. Давление, изменяемое вдоль колонки, при разделении оказывает незначительное
влияние на удерживание вещества [1] (см. также раздел 2.5.3.1) и, как правило,
не учитывается при умеренных значениях (например, менее 345 бар/5000 psi).
2.3.1. Фактор удерживания k и мертвое время колонки t0
Для данных соединений фактор удерживания k (его до сих пор еще называют коэф-
фициентом емкости k ) определяют по отношению количества вещества на не-
подвижной фазе (s) к его количеству в подвижной фазе (m). Количество вещества в каждой фазе равно его концентрации (Cs или Cm соответственно), умноженной
на объем фазы (Vs или Vm, соответственно), то есть:
см. уравнение в книге (2.3)
где K = (Cs/Cm) — константа равновесия в уравнении (2.2), а Ш = (Vs/Vm) — это фазо-
вое отношение, то есть соотношение объемов неподвижной и подвижной фаз внутри
колонки. Далее будет показано, что величина k — важная характеристика каждого
пика на хроматограмме. Значения k позволяют нам интерпретировать и улучшать
разделение. Молекулы анализируемого вещества должны присутствовать в обеих фа-
зах, то есть, если фракция молекул вещества, находящаяся в элюенте, будет R, то
фракция молекул вещества на сорбенте должна быть 1-R. Тогда из уравнения (2.3)
следует:
см. уравнение в книге (2.3а)
или
см. уравнение в книге (2.3б)
Время удерживания X (tR) можно вычислить, разделив расстояние на скорость
(скорость полосы), где расстояние — это длина колонки L, а скорость полосы — это ux:
см. уравнение в книге (2.4)
Аналогичным образом определяют время удерживания пика растворителя
см. уравнение в книге (2.4а)
где u — средняя скорость подвижной фазы. Если из уравнения (2.4а) выразить вели-
чину L и подставить в уравнение (2.4), то получится:
см. уравнение в книге. (2.4б)
Если из уравнения (2.1) выразим R = ux/u0 и подставим в уравнение (2.3б), то по-
лучим:
см. уравнение в книге (2.5)
Кроме того, уравнение (2.5) можно выразить через объем удерживания VR = tRF,
где F — скорость подвижной фазы (мл/мин):
см. уравнение в книге (2.5а)
Здесь Vm — это мертвый объем колонки, равный t0F (далее величина Vm и уравнение
(2.5а) будут рассмотрены подробнее).
Уравнение (2.5) можно записать по-другому:
см. уравнение в книге (2.6)
По уравнению (2.6) можно вычислить значения k каждого пика на хроматограм-
ме. На практике k часто оценивают визуально по хроматограмме (на основе уравне-
ния 2.6), поскольку в рутинных анализах и при разработке разделения (разработка
метода) редко требуются точные значения k. Таким образом, k эквивалентен разно-
сти времен удерживания (tR-t0), отнесенной к t0 или:
см. уравнение в книге (2.6а)
По t0 можно также примерно оценить k (рис. 2.3е, который соответствует хрома-
тограмме на рис. 2.3д). Так для соединения X k равно одному отрезку t0, считая от t0,
для Y — двум отрезкам t0, Z — четырем отрезкам.
Далее в разделе 2.4.1 описано почему k предпочтительно должно находиться
в интервале значений от 1 до 10. Поэтому очень важно уметь оценивать (или вычис-
лять) значения k различных пиков на хроматограмме, что, в свою очередь, требует
знания мертвого времени t0 колонки. Величину t0 обычно определяют визуально
по отклонению базовой линии в самом начале хроматограммы (рис. 2.5а-б). Иногда
первый всплеск базовой линии имеет характерную форму (рис. 2.5а), которая точно
указывает на пик неудерживаемого растворителя образца. Такой всплеск при t0
обычно происходит при смене показателя преломления (ПП) подвижной фазы (из-за
разницы ПП подвижной фазы и растворителя образца), что влияет на количество
света, проходящего через ячейку детектора. Пик при t0 может отсутствовать, если об-
разец растворяют в элюенте (лучше всего так и делать).
В остальных случаях, особенно в тех, когда речь идет об анализе реакционной
массы, проб из окружающей среды, растительных или животных экстрактов, в на-
чале хроматограммы (рис. 2.5б) присутствует очень большой («неудерживаемый»
или «мусорный») пик. Здесь значение t0 соответствует началу подъема пика. Иногда
на хроматограмме можно и не увидеть пика растворителя (рис. 2.5в), тогда его опре-
деляют или вычисляют. Наиболее очевидный способ определения t0 — анализ не-
удерживаемого (k = 0) легко детектируемого вещества, растворенного в воде или по-
движной фазе (рис. 2.5г). Если использовать УФ детектор с длиной волны менее
220 нм, то в качестве тестового образца можно взять тиомочевину. Для определения
t0 также подходят урацил или концентрированные растворы солей, поглощающих в
УФ, например, нитрата натрия [2—4]. Наблюдаемое значение t0 для одной и той же
колонки может меняться в зависимости от состава подвижной фазы. Обычно колеба-
ния t0 составляют менее 5% в диапазоне 20—80 %В (%В означает объемное содержа-
ние в процентах органического компонента в подвижной фазе), а максимальные от-
клонения достигают ±10-15% при крайних значениях %В (0, 100 %В) [5]. Чтобы
примерно оценить k (рис. 2.3д), достаточно предположить, что значение t0, измерен-
ное при одном %В, будет таким же при всех значениях %В (при условии, что меня-
ется только %В).
С другой стороны, величину t0 можно оценить, основываясь на размерах колон-
ки и величине скорости потока (для колонок, упакованных полностью пористыми
частицами):
см. уравнение в книге (2.7)
Здесь L — длина колонки в мм, dc — внутренний диаметр колонки в мм, F — ско-
рость потока в мл/мин и t0 в минутах. Оказалось, что для нескольких сотен разных
ОФХ-колонок t0, вычисленное по уравнению (2.7), совпадает с экспериментальными
значениями t0 со средней ошибкой ±10% (1 СКО) [6]. На практике такая точность
вполне достаточна. Мертвый объем колонки Vm связан с t0 следующей зависимостью:
см. уравнение в книге (2.7а)
где L и dc измеряются в мм. Мертвый объем колонки Vm — это общий объем по-
движной фазы внутри колонки, вне частиц сорбента и внутри их. Например, Vm =
= 2 мл, F = 0,5 мл/мин, тогда t0 = Vm/F = 2/0,5 = 4 мин. t0 можно расценивать как
время, требуемое для полной замены подвижной фазы, которой колонка была изна-
чально заполнена.
В общем случае для колонок с внутренним диаметром 4—5 мм удобно оценивать
Vm соотношением (объединив уравнения 2.7 и 2.7а):
см. уравнение в книге. (2.7б), где длина колонки L в мм. Тогда зная Vm, можно получить значение t0: t0 = Vm/F.
Дальнейшее обсуждение измерения, точности и смысла мертвого времени и мертвого
объема колонки смотрите в работах [2—4].
2.3.2. Роль условий разделения и состава образца
Относительное влияние условий разделения на удерживание образца k обобщено
во второй колонке таблицы 2.2. Данные таблицы 2.2 применимы к любым режимам
разделения, но информация, изложенная ниже, касается обращенно-фазовой хрома-
тографии (ОФХ). Подвижная фаза, как правило, представляет собой смесь воды или
водного буфера (элюент А) и органического растворителя (элюент В), такого как
ацетонитрил или метанол. С увеличением объемной доли органического раствори-
теля (%В) снижается удерживание всех компонентов образца. Подвижная фаза,
при которой значения k уменьшаются, называется «сильной», то есть вода относится
к «слабым» элюентам, а органические растворители — к «сильным». При увеличении
доли элюента В на 10% значения k обычно снижаются в 2—3 раза. Влияние доли
растворителя В на удерживание образца показано на примере разделения смеси
из 5 гербицидов (рис. 2.6). Подвижная фаза, содержащая 80 %В, вызывает быстрое
элюирование компонентов образца (рис. 2.6а) с небольшими значениями k (0,3—
0,8), что приводит к плохому разделению. Если %В снизить (50 %В, рис. 2.6б),
то разделение улучшится, но станет продолжительным (16 минут по сравнению
с 1,5 минутами на рис. 2.6а). При этом из-за размывания высота пиков уменьшится.
Как правило, подбирая необходимый %В, можно регулировать k в желаемом интер-
вале. Кроме того, варьируя параметры, приведенные в таблице 2.2, можно контроли-
ровать селективность разделения (б) и эффективность колонки (N). Более подробно
см. раздел 2.5.
ОФХ предполагает неполярную неподвижную фазу (например, С18) и полярный
водный элюент. Здесь работает принцип «подобное взаимодействует с подобным»:
то есть полярные соединения (1,3-пропандиол) будут преимущественно взаимодейст-
вовать с полярной подвижной фазой (рис. 2.7б), а значит, будут менее удерживаемы
(боќльшие значения R и небольшие k), а неполярные вещества (н-гексан), напротив,
в основном будут взаимодействовать с неполярной стационарной фазой (рис. 2.7а),
что приведет к более сильному удерживанию (небольшие R и большие k). На рисун-
ке 2.7в изображена хроматограмма нескольких монозамещенных бензолов, имеющих
разную полярность или «гидрофобность» из-за наличия разных по своей природе за-
местителей. Полярные (менее гидрофобные) группы, например, —NHCHO,
—CH2OH или —OH снижают удерживание по отношению к незамещенному бензолу
(заштрихованный пик). Менее полярные (более гидрофобные) группы, например,
хлор, метил, бром, йод и этил, наоборот, увеличивают удерживание.
Ионизированные кислоты и основания гораздо «полярнее», а значит, менее
удерживаемы по сравнению с их нейтральными формами. Изменение рН подвижной
фазы, которое приводит к повышению ионизации вещества, еще больше снижает
удерживание (раздел 7.2).
2.3.2.1. Межмолекулярные взаимодействия
В этом разделе изложена информация, позволяющая более глубоко изучить вопрос зави-
симости удерживания от состава образца, колонки и подвижной фазы. Кроме того,
здесь содержится больше материала, чем обычно требуется на практике. Поэтому чи-
татель может его пропустить и перейти к следующему разделу 2.3.2.2, а сюда верну-
ться по мере необходимости.
Взаимодействие между ближайшими молекулами вещества и растворителя проис-
ходит благодаря различным межмолекулярным силам (рис. 2.8). В принципе, количес-
твенное понимание этих взаимодействий должно позволить оценить или даже пред-
сказать зависимость удерживания от структуры молекулы. Хотя в настоящее время1
сделать это практически невозможно (см. раздел 2.7.7), понимание этих взаимодействий в других ситуациях может оказаться полезным. Например, в выборе другой
колонки при попытке изменить разделение (раздел 5.4).
Дисперсионные взаимодействия (рис. 2.8а) возникают в результате случайных,
мгновенных смен положений электронов вокруг соседнего атома растворителя (S)
или вещества (Х). Обычно в каждый определенный момент электроны асимметрично
окружают ядро S (рис. 2.8а), что приводит к тому, что электроны ближайшего атома
Х (из-за кулоновского отталкивания) перемещаются так, как показано на рисунке.
В результате чего между молекулами S и Х возникает мгновенный дипольный мо-
мент, который вызывает электростатическое притяжение. Сила дисперсионных взаи-
модействий зависит от поляризуемости двух соседних атомов. Чем больше размер
молекулы (количество атомов или молекулярная масса) и показатель преломления
[9], тем больше поляризуемость, поэтому дисперсионные взаимодействия сильнее
для ароматических соединений и для молекул, у которых заместителями являются
атомы с более высоким атомным весом (сульфид, хлорид, бромид и т.д.), при усло-
вии, что молекулы имеют примерно одинаковый размер .
Дисперсионные взаимодействия существуют между каждыми двумя соседними
атомами, и это взаимодействие во многом объясняет физическое притяжение между
молекулами всех видов (особенно для менее полярных молекул). Из-за неспецифи-
ческой и универсальной природы дисперсионных взаимодействий они значительны
как в подвижной, так и в неподвижной фазе. Это приводит к тому, что дисперсион-
ные взаимодействия, как правило, мало влияют на селективность разделения при
смене подвижной фазы или колонки. Дисперсионные взаимодействия вносят вклад
в гидрофобные взаимодействия, которые так называются из-за того, что они обусловливают притяжения менее полярных соединений к неполярному обращенно-фазо-
вому сорбенту (или вытеснение гидрофобных молекул из полярной водной фазы).
С возрастанием силы дисперсионного взаимодействия (для более крупных и менее
полярных образцов) происходит существенный рост удерживания.
Диполь-дипольные взаимодействия возникают между молекулами, имеющими по-
стоянные или наведенные диполи. На рис. 2.8б изображено взаимодействие моле-
кулы ацетонитрила (CH3C N) и нитроалкана (R–NO2). У функциональных групп
(—C N и —NO2) этих двух молекул есть большой постоянный дипольный момент,
благодаря которому молекулы занимают такое положение, в котором электростати-
ческое взаимодействие максимально (положительно заряженный полюс одной моле-
кулы находится рядом с отрицательно заряженным полюсом другой). Сила диполь-
ного взаимодействия пропорциональна дипольному моменту каждой из двух
взаимодействующих групп, а не дипольному моменту целой молекулы (в которой мо-
жет быть много заместителей), так как дипольные взаимодействия возникают только
на очень близком расстоянии, например, между соседними атомами или групппами.
Водородные связи возникают в двух случаях: кислотный (или протон-донорный)
растворитель (метанол) взаимодействует с осноќвным (протон-акцепторным) веще-
ством (N,N-диметиланилин), или кислотное вещество (фенол) взаимодействует
с осноќвным растворителем (тетрагидрофуран, ТГФ) (рис. 2.8в). Сила взаимодей-
ствия увеличивается с увеличением кислотности и основности взаимодействую-
щих групп (табл. 2.3).
Пример ионных (кулоновских) взаимодействий между положительно заряженным
ионом образца (Х+) и окружающими его поляризуемыми молекулами растворителя
показан на рис. 2.8г. Под действием положительно заряженного иона в молекулах
растворителя смещается заряд, что приводит к максимальному электростатическому
взаимодействию. Сила ионных взаимодействий увеличивается с увеличением диэлек-
трической проницаемости е растворителя (табл. 2.3). Кроме того, ионные взаимодей-
ствия могут возникать между заряженными ионами образца и любыми ионами в по-
движной или стационарной фазе. Более подробно этот вопрос обсуждается в разделе
7.4.1 (ион-парная хроматография) и разделе 7.5.1 (ионообменная хроматография).
Перенос заряда или р-р взаимодействия показаны на рисунке 2.8д на примере
1,3-динитробензола (обедненная электронами р-кислота) и бензола (насыщенное
электронами р-основание). Взаимодействия такого рода возникают между любыми
ароматическими (или ненасыщенными) соединениями. Причем, чем сильнее
р-основания (такие как полициклические ароматические соединения, например,
нафталин и антрацен) и р-кислоты (например, ароматические соединения, замещен-
ные электронакцепторными нитрогруппами), тем сильнее р-р взаимодействия. Рас-
творитель ацетонитрил, являющийся р-кислотой, тоже может вступать в р-р взаимо-
действия с ароматическими образцами [10].
Полярные взаимодействия различных неионных алифатических растворителей,
применяемых в ВЭЖХ, можно представить в виде треугольника селективности рас-
творителей (рис. 2.9, [11]). Положение каждого растворителя в треугольнике указы-
вает на относительную кислотность его водородных связей б/ , основность его водо-
родных связей в/ и полярность */ . Амины, например, относительно сильные
основания (судя по положению в верхней части треугольника, большое значение в).
У нитроалканов, алифатических нитрилов, хлористого метилена есть группы с боль-
шими дипольными моментами, поэтому они располагаются в нижней правой части
треугольника. Перфторспирты — очень сильные доноры водорода (и одновременно
слабые акцепторы). Их, также как и карбоновые кислоты, можно найти в нижней
левой части треугольника (большие значения б). В таблице 2.3 приведены:
1. Относительные вклады дипольных взаимодействий, кислотности и осноќвности во-
дородных связей в общую полярность растворителя;
2. Мера общей полярности растворителя (P );
3. Диэлектрическая постоянная (е)
Чем больше е подвижной фазы, тем сильнее ионные взаимодействия в растворе
(рис. 2.8г), тем лучше ионные образцы растворяются в подвижной фазе и тем мень-
ше значения k для ионных образцов. Подробный обзор межмолекулярных взаимодей-
ствий в хроматографии см. [14].
Далее, в главах 6 и 8, мы еще раз вернемся к треугольнику селективности раство-
рителей (рис. 2.9). В разделе 5.4 о селективности колонки аналогичным образом объ-
яснены взаимодействия между образцом и сорбентом.
2.3.2.2. Температура
Температура — важный параметр в ВЭЖХ. Она оказывает существенное влияние
на коэффициент удерживания. Удерживание большинства образцов в привычных
условиях разделения зависит от температуры в соответствии с уравнением Ван-Гоффа:
см. уравнение в книге (2.8)
где А и В не зависящие от температуры константы для данного вещества, ТК — тем-
пература в градусах Кельвина (К). Обычно повышение температуры на один градус
снижает k на 1—2%, т.е. при увеличении температуры на 50 °С удерживание умень-
шается примерно в 2 раза. Повышение температуры зачастую негативно отражается
на разделении, хотя высота пиков растет (как при увеличении доли растворителя В
в элюенте, рис. 2.6). Следует отметить, что отклонения от уравнения (2.8) не так уж
и редки, в результате чего наблюдается криволинейный участок на графике зависи-
мости log k от 1/ТК. Повышение температуры очень редко увеличивает коэффициент
удерживания. Исключения из уравнения (2.8) возможны, если при изменении темпе-
ратуры:
1. происходит изменение ионизации образца [15, 16];
2. меняется конформация образца [17] или свойства стационарной фазы [18].
Кроме того, температура влияет на количество теоретических тарелок и на пере-
пад давления (раздел 2.4). Большинство термостатов хроматографических систем
имеют температурные ограничения: не более 80 °С (раздел 3.7.2). Период эксплуата-
ции колонки сокращается, если рабочая температура превышает 60 °С (раздел 5.8).
Более подробно о роли температуры в ВЭЖХ написано в разделе 2.5.3.1 и [19—20а].
2.4. Ширина пика и число теоретических
тарелок колонки N
Молекулы растворенного вещества (рис. 2.3), перемещаясь, распределяются по ко-
лонке и занимают объем, превышающий исходный (или образуют более широкую
полосу). Вещество, вымываясь из колонки, на хроматограмме регистрируется в виде
пика, ширину которого можно вычислить различными способами. На рис. 2.10а по-
казана ширина W первого пика i на уровне базовой линии. К каждой стороне пика про-
водят касательные (через точки перегиба), пересечение которых с базовой линией
образует отрезок W. Когда в этой книге упоминается ширина пика, предполагается,
что это значение W на уровне базовой линии. Относительная способность колонки
давать узкие пики называется эффективностью и определяется числом теоретических
тарелок N:
см.уравнение в книге. (2.9)
Например, ширина W пика i (рис. 2.10а) равна (4,00 3,85)
= 0,15 мин, время
удерживания tR = 3,93 мин, тогда N = 16 Ї (3,93/0,15)2 = 10980. Значения N могут ме-
няться в зависимости от образца, условий разделения и колонок (раздел 2.4.1). Чем
больше N, тем уІже пики на хроматограмме и тем лучше разделение.
Ширину пика удобнее (и точнее) определять по ширине пика на полувысоте W1/2
(показано для пика j на рисунке 2.10а). По данным систем сбора и обработки данных
ширина пика на полувысоте W1/2 0,588W. Величину W1/2 также используют для
см.уравнение в книге (2.9а).
Пик идеальной формы имеет вид Гауссовой кривой (раздел 2.4.2), и поэтому ширину
пика иногда выражают как стандартное отклонение у Гауссовой кривой, то есть
W = 4у. (2.9б)
см.уравнение в книге (2.9в)
Уравнение (2.9в) можно представить в другом виде, например: N = 25(tR/W5у)2, где
W5у = 1,25W так называемая ширина пика 5у.
Уравнение (2.9) можно записать в виде
см.уравнение в книге (2.10)
или (заменив tR уравнением (2.5))
см.уравнение в книге (2.10а)
Поскольку для разных пиков на хроматограмме значения N практически постоянны,
то уравнение (2.10) говорит о том, что ширина пика W увеличивается пропорциона-
льно времени удерживания. То есть на хроматограмме от ее начала и до ее конца
наблюдается непрерывное увеличение ширины пика (см. например, хроматограмму
на рис. 2.7в).
При изменении времени удерживания, которое меняется в зависимости от %В,
температуры или колонки, площадь пика, как правило, остается постоянной, поэто-
му и произведение высоты пика hp на ширину пика W тоже должно остаться посто-
янным. Таким образом
см.уравнение в книге. (2.11)
Следовательно, с увеличением tR, высота пика падает. Пример зависимости вы-
соты пика от %В показан на рисунке 2.10б для пика 3 рисунка 2.6. Видно, что при
варьировании %В высота и ширина пика изменяются обратно пропорционально (что
подтверждает уравнение (2.11)).
2.4.1. Зависимость N от условий разделения
Начнем этот раздел с обобщения некоторых практических выводов относительно за-
висимости числа теоретических тарелок N от колонки, образца и условий экспери-
мента. Теория следующего раздела 2.4.1.1 именно на них и основывается. Число та-
релок также можно описать следующим уравнением
см.уравнение в книге (2.12)
где H = L/N — высота теоретической тарелки. H показатель эффективности колонки
на единицу ее длины. Увеличение длины колонки (путем замены колонки длиной
150 мм на колонку длиной 250 мм) — очень удобный способ повысить N и улучшить
разделение (поскольку H постоянна, отличается только длина колонок).
Рассмотрим следующий график в двойном логарифмическом масштабе
(рис. 2.11а), на котором показана зависимость N от скорости потока F и диаметра
частиц dp (2, 5 или 10 мкм), при этом другие параметры разделения остаются посто-
янными. При увеличении скорости подвижной фазы F, начиная со значения
0,1 мл/мин, число теоретических тарелок N сначала увеличивается, а потом падает.
Так при данных условиях максимальное значение N (обозначено •) в зависимост от размера частиц dp наблюдается при значениях F = 0,2 1,0
мл/мин. Трехкратное
увеличение скорости потока относительно «оптимального» значения Fопт, при кото-
ром N максимально, почти никак не сказывается на самом разделении (только лишь
снижает N примерно на 20%), но сокращает его продолжительность в три раза. По-
этому на практике обычно используют скорость потока выше оптимального значе-
ния. Не рекомендуется устанавливать скорость потока ниже Fопт, поскольку помимо
снижения числа тарелок увеличивается продолжительность разделения.
Размер частиц влияет на число теоретических тарелок: чем меньше dp, тем боль-
ше N (рис. 2.11а). При уменьшении размера частиц максимальное значение N дости-
гается при более высокой скорости потока, что позволяет сократить продолжитель-
ность разделения (раздел 2.4.1.1). С маленькими частицами и высокими скоростями
потока перепад давления в колонке (будем его называть просто «давление» P) возра-
стает (штриховые линии на рисунке 2.11а при P = 136 бар (2000 psi), 340 бар
(5000 psi) и 1020 бар (15000 psi)). Давление (в psi) в упакованной колонке можно
определить по уравнению
см.уравнение в книге(2.13)
или из уравнений (2.7) и (2.13)
см.уравнение в книге (2.13а)
где L— длина колонки в мм, з — вязкость подвижной фазы в сП (значения з в за-
висимости от состава подвижной фазы и температуры приведены в Приложении I),
t0 в минутах, F — скорость потока в мл/мин, dс — внутренний диаметр колонки
в мм, dp — диаметр частиц в мкм. В ВЭЖХ, помимо psi, иногда используют другие
единицы измерения давления: бар атмосфера = 14,7 psi, мегапаскаль (МПа) =
= 10 бар = 147 psi.
На давление влияют также природа сорбента и качество упаковки колонки (раз-
дел 5.6). Капилляры от насоса до детектора, кран инжектора, ячейка детектора вно-
сят свой вклад в общее давление, определяемое на выходе из насоса. Однако сум-
марный их вклад невелик (10—20%) по сравнению с давлением, вычисленным
по уравнению (2.13). Исключение составляют ВЭЖХ-системы, предназначенные
для работы при давлении > 400 бар, с размером частиц сорбента менее 3 мкм, кото-
рые и в отсутствии колонки демонстрируют высокое сопротивление потоку (напри-
мер, 70 бар). В зависимости от ВЭЖХ-оборудования или проницаемости колонки
отклонение от давления, определенного по уравнениям (2.13) и (2.13а), может со-
ставлять ±20% и даже больше. Несмотря на способность большинства обычных
ВЭЖХ-систем работать в диапазоне 340—400 бар, рекомендуется ограничить перепад
давления до 200 бар (раздел 3.5). Со временем давление в колонке увеличивается,
поэтому давление на новой колонке, предназначенной для обычных анализов,
не должно превышать 150 бар. Впрочем последняя рекомендация устарела, так как
в настоящее время имеющиеся в продаже ВЭЖХ-системы для рутинных задач впол-
не выдерживают 600-1000 бар и даже больше (раздел 3.5.4.3, [21]).
Теперь рассмотрим рисунок 2.11б: разделение проводят на колонке 100 Ї 4,6 мм
с частицами 5 мкм, подвижная фаза содержит 50% ацетонитрила (обратите внимание
на двойной линейный масштаб и более узкий и типичный интервал значений F). Гра-
фики зависимости N от F построены для трех различных условий: 1) 30 °С и образец
с молекулярной массой 200 Да, 2) 30 °С и образец с молекулярной массой 6000 Да
(крупный пептид), 3) 80 °С и образец с молекулярной массой 200 Да. Эти графики
для каждого из образцов выглядят сходным образом, за исключением того, что макси-
мум N или оптимальная Fопт сдвигается вправо (к боќльшим значениям) при увеличе-
нии температуры, и влево (к меньшим значениям) при увеличении размера молекулы.
Из этого можно сделать следующее заключение: разделение при повышенной темпера-
туре лучше проводить при высокой скорости потока, что, в свою очередь, сокращает
продолжительность анализа (раздел 2.5.3.1). Похожие разделения образцов с большой
молекулярной массой при сравнимых значениях N, как правило, требуют уменьшения
скоростей потока, что удлинняет анализ. Зависимость N от геометрических размеров
колонки, молекулярной массы образца и других условий обобщена в таблице 2.4.
2.4.1.1. Процессы размывания пика, определяющие значения N
Ширина W и время удерживания tR пика определяют число теоретических тарелок N
колонки (уравнение 2.9). Различные процессы, протекающие внутри и снаружи колон-
ки, влияют на объем, в котором выходит пик, или его ширину W, как это показано на
рис. 2.12. Обратите внимание на уширение полосы, происходящее в результате каждо-
го процесса (рис. 2.12а-д). На это указывают скобки и стрелки около полосы образца.
Когда проба из инжектора попадает в систему, но еще не достигает колонки, она зани-
мает определенный, обычно небольшой, объем в капилляре (раздел 2.6.1). Это показа-
но на рисунке 2.12а, где каждая отдельная молекула образца обозначена •. Обычно
внеколоночное уширение полосы вещества можно не принимать во внимание (раздел
3.9), но эта возможность зависит от характеристик хроматографа и размеров колонки
(колонки небольшого объема, упакованные мелкозернистым сорбентом, больше всего
подвержены внеколоночному размыванию пика). Рассмотрим продольную диффузию
вещества в колонке (рис. 2.12б). Этот процесс вызывает увеличение ширины пика со
временем, и он возникает вне зависимости от того, течет подвижная фаза или нет.
Время, затрачиваемое веществом при его прохождении через колонку, обратно про-
порционально скорости потока, поэтому вклад в уширение полосы от продольной
диффузии уменьшается при большей скорости потока.
Вихревая диффузия вносит свой вклад в уширение пика (рис. 2.12в). Молекулы
вещества по мере передвижения по колонке переносятся между частицами сорбента
потоком подвижной фазы в различных направлениях (указано стрелками). Молеку-
лы, попадающие в более медленно движущиеся потоки в суженных каналах между
частицами, отстают, а быстрые потоки в более широких каналах уносят молекулы
вперед. Такое распределение молекул почти не зависит от скорости потока, а зави-
сит от взаимного расположения и размера частиц сорбента. В плохо упакованной ко-
лонке вихревая диффузия еще больше способствует размыванию полосы вещества.
Массообмен в подвижной фазе (рис. 2.12г) возникает вследстие неравномерной скоро-
сти потока (в центре потока она выше, чем на переферии). С увеличением скорости элюента молекулы в центральной части потока перемещаются быстрее, что вызывает
еще большее размывание пика.
Последний процесс, который вносит свой вклад в размывание полосы вещества
внутри колонки, — массоперенос в стационарной фазе (рис. 2.12д). Некоторые моле-
кулы образца попадают глубоко в поры частиц (благодаря диффузии) и застревают
там на какое-то время (например, молекула i на рис. 2.12д). В это время другие молекулы (например, j) неглубоко проникают в поры, надолго там не задерживаются и
быстро вымываются из них. Молекулы, проводящие мало времени в частицах сор-
бента, перемещаются быстрее внутри колонки, увеличивая тем самым размывание
полосы вещества. Чем выше скорость потока, тем больше размывание. В итоге пик
элюируется из колонки и проходит через детектор (рис. 2.12е), при этом происходит
дополнительное внеколоночное размывание, аналогичное размыванию на линии
в промежутке от инжектора до колонки (рис. 2.12а).
Каждый процесс вносит свой вклад в размывание пика (рис. 2.12) и влияет
на окончательную ширину пика W
см. уравнение в книге (2.14)
где Wi — вклад каждого (независимого) процесса i в окончательную ширину пика.
Можно разделить процессы, протекающие внутри колонки и вне ее. Пусть WEC —
суммарное внеколоночное размывание (рис. 2.12а и 2.12е), а W0 — суммарное внут-
риколоночное размывание, тогда
см. уравнение в книге. (2.14а)
В правильно собранной ВЭЖХ-системе внеколоночное размывание WEC должно
быть небольшим (раздел 3.9), поэтому далее это слагаемое не будет приниматься
во внимание при обсуждении. Величина WEC, в отличие от W0, не зависит от k (урав-
нение 2.10а), поэтому вклад внеколоночного размывания в общую ширину пика бу-
дет больше для раноэлюируемых соединений.
Оставшаяся часть этого раздела и раздел 2.4.1.2 могут оказаться очень полезными
для правильного понимания того, как величина N зависит от экспериментальных усло-
вий. Кроме того, этот материал закладывает основы, позволяющие, с одной стороны,
понять как разработать методы экспресс-разделения (раздел 2.5.3.2), а с другой сторо-
ны, правильно оптимизировать эффективность колонки и разделения. Информация, из-
ложенная ниже, не очень важна в повседневной работе, она может оказаться несколько
сложной и ее можно пропустить, перейдя сразу к разделу 2.4.2, а к разделам 2.4.1.1
и 2.4.1.2 вернуться позже. Тем не менее, материал, начинающийся с уравнения (2.17),
и особенно раздел 2.4.1.2 может оказаться полезным с практической точки зрения и за-
служивает внимания читателя. Развернутое обсуждение теории размывания пиков
также приводится в работах [22—25].
Величину W0 теперь будем считать эквивалентной ширине пика W (уравне-
ние 2.10), ее можно выразить через уравнение (2.14):
см. уравнение в книге фазе
(2.15)
Объединив уравнения (2.10) и (2.12), получим:
см. уравнение в книге 2.15а)
где значения H = L/N для разных веществ в одних и тех же экспериментальных усло-
виях практически не зависят от времени удерживания tR для колонки длиной L. По-
этому
см. уравнение в книге (2.15б)
Если вместо W2 подставить величину H из уравнения (2.15б), то уравнение (2.15) бу-
дет напрямую связано с N:
см. уравнение в книге, (2.16)
где HL, HE, HMP и HSP коррелируют с соответствующими W в уравнении (2.15), т.е.,
например, параметр HL соответствует продольной диффузии и вносит свой вклад в H
и т.д. Если мы вернемся к обсуждению рисунка 2.12, отметив, что значения W2 про-
порциональны значениям H (уравнение 2.15б), то исходя из теоретических уравне-
ний для каждого из четырех вкладов в величину W, можно получить следующее вы-
ражение:
см. уравнение в книге (2.16а)
где коэффициенты А, В и С — это константы для конкретных вещества, колонки
и экспериментальных условий. Если в уравнении (2.16а) вместо F подставить линей-
ную скорость подвижной фазы u, то получится уравнение Ван-Деемтера:
см. уравнение в книге (2.16б)
где параметры А, В и С обозначают различный набор констант, относящихся к конк-
ретному веществу, колонке и экспериментальным условиям.
Уравнения (2.16а и б) не совсем точны, поскольку допускают независимость всех
четырех слагаемых W друг от друга. Чего не скажешь о вихревой диффузии и массо-
переносе в подвижной фазе. Всякий раз, когда два потока, текущие между частица-
ми, встречаются, происходит смешивание и изменение профиля скоростей, возник-
шего вследствие массопереноса в подвижной фазе (так называемое сопряжение).
Поэтому и вихревую диффузию, и массоперенос в подвижной фазе следует рассмат-
ривать как единый процесс размывания полосы. Поскольку массоперенос в подвиж-
ной фазе зависит от скорости потока (F1), а вихревая диффузия — нет (F0), то
уширение пика под действием этих двух процессов будет описываться степенной за-
висимостью F с дробным показателем (F n). Эксперименты дают основание предпо-
лагать, что объединённая величина H для вихревой диффузии и массопереноса в по-
движной фазе зависит от скорости потока в степени 1/3. Тогда
см. уравнение в книге (А, В, С — константы). И, наконец, обобщенную взаимосвязь уширения пика и экс-
периментальных условий можно получить следующим образом: принять, что пара-
метры А, В и С в свою очередь в различной степени зависят от коэффициента диф-
фузии Dm и/или диаметра частиц dp, поэтому уравнение (2.16) будет выглядеть так:
см. уравнение в книге (2.17)
Это так называемое уравнение Нокса [25]. Для «усредненного» разделения коэффи-
циенты уравнения (2.17) можно принять равными А = 1, В = 2, С = 0,05 (эти значения
очень приблизительны и в некоторой степени зависят от k, природы колонки и каче-
ства ее упаковки). Теперь дадим определения приведенной высоты теоретической та-
релки h:
см. уравнение в книге (2.18)
и приведенной скорости v:
см. уравнение в книге( 2.18а)
ue — интерстициальная скорость подвижной фазы (скорость движения элюента меж-
ду частицами сорбента), которая отличается от средней линейной скорости подвижной фазы u; в уравнениях (2.18) и (2.18а) используются единицы измерения системы
СГС (см Ї г Ї с). Общая пористость колонки (доля свободного объема колонки) обо-
значается еТ и включает объем пор частиц еi и объем между частицами еe. При этом
ue равна (еT/еe)u, где (еT/еe) 1,6.
Коэффициент диффузии вещества Dm (см2/сек) зависит от его молекулярного
объема (VA, в мл), температуры (Т, в градусах Кельвина) и вязкости подвижной фазы
(з в сП). Это уравнение Вилки-Чанга[26]:
см. уравнение в книге (2.19)
где MВ — молекулярная масса растворителя, шВ — коэффициент ассоциации, равный
единице для большинства растворителей и больше единицы для растворителей, спо-
собных формировать сильные водородные связи. Например, шВ воды равен 2,6, а ме-
танола — 1,9 (в условиях обычной ОФХ можно принять значение шВ 2). Уравне-
ние (2.19) достаточно точно для веществ, молекулярные массы которых меньше
500 Да, и может оказаться полезным для приблизительной оценки величин Dm более
крупных молекул.
Уравнение Нокса (2.17) дает основу для оптимизации условий разделения,
то есть позволяет оценить, каким образом можно получить максимальное N за мини-
мальное время анализа. На результатах анализа этого уравнения также основаны
прогнозы, приведенные в таблице 2.4, и графики на рис. 2.11. Таким образом, можно
хотя бы приблизительно предположить, как будет меняться N при изменении тех или
иных экспериментальных условий. Для того, чтобы применить уравнение Нокса (2.17)
на практике, необходимо связать с объемной скоростью потока. Это можно сде-
лать, выразив F через уравнения (2.4а) и (2.7):
см. уравнение в книге (2.20)
где F — объемная скорость потока в мл/мин, dc — диаметр колонки в мм, линейная
скорость подвижной фазы u в мм/мин. Преобразуем уравнение (2.18а) с учетом того,
что u в мм/мин, dp в мкм, Dm в см2/с, а ue=1.6u:
см. уравнение в книге (2.20в)
На рис. 2.13а изображен график зависимости h(н) (—), построенный по уравне-
нию (2.17); при этом предполагается, что А = 1, В = 2, С = 0,05. Этот график не зави-
сит от экспериментальных условий, перечисленных в таблице 2.4, поэтому он при-
меним (приблизительно) ко всем условиям. Из рисунка 2.13а видно, что
минимальное значение h hопт Ј 2 соответствует значению опт Ј 3. («оптималь-
ные» h и н — это те значения, которые соответствуют максимальному N). Сплошная
кривая на рис. 2.13б повторяет сплошную кривую рис. 2.13а, за исключением того,
что по оси абсцисс отложена не приведенная скорость потока , а объемная скорость
F (при определенных условиях: 50% ацетонитрил-вода, 30 °С, диаметр колонки
4,6 мм, молекулярная масса образца 200 Да). Изменение любых условий, перечисленных в таблице 2.4, будет смещать график для данного образца (200 Да, 30 °С,
рис. 2.13б) влево или вправо. Характер смещения будет зависеть от скорости потока,
соответствующей максимальному N (Fопт соответствует нопт Ј 3). В соответствии
с прогнозами таблицы 2.4 Fопт растет с увеличением температуры, что мы и видим
на рис. 2.13б (прерывистая кривая), а с увеличением молекулярной массы происхо-
дит падение Fопт и график h(н) сдвигается влево (пунктирная кривая). Заменив
на оси ординат h на N (уравнения 2.12 и 2.18), мы из кривой на рис. 2.13б получим
график, изображенный на рис. 2.11б.
Как же зависит Fопт от условий, перечисленных в таблице 2.4? Любое изменение
условий разделения, которое влияет на размер частиц dp или коэффициент диффу-
зии Dm при неизменной линейной скорости u (или объемной скорости потока F),
влечет за собой изменение н. Чтобы компенсировать это влияние и сохранить
нопт Ј 3, при котором наблюдается минимальное h и максимальное N, надо коррек-
тировать скорость потока F. Например, при повышении температуры коэффициент
диффузии Dm увеличивается пропорционально некоторой величине x (уравне-
ние 2.19), и, следовательно, н снижается в x раз (уравнение 2.18а). Значит, чтобы
компенсировать повышение температуры и удерживать постоянное значение н = нопт,
надо скорость потока, соответствующую Fопт, также увеличить в x раз.
На рис. 2.13а изображены графики для каждого из трех компонентов уравне-
ния (2.17). Стрелкой указано значение н (н Ј 3, h Ј 2), соответствующее минимуму h
и максимуму N. Позже исходное уравнение Нокса было преобразовано, и были по-
лучены новые соотношения, которые, как утверждается, дают более точные резуль-
таты, пригодные для решения широкого спектра задач, и/или обеспечивают более
глубокое понимание основ эффективности колонки [27-32]. Кроме того, когда учи-
тывается диффузия в неподвижной фазе [35], параметры В и С будут зависеть от k
растворенного вещества [33, 34]. Следовательно, уравнение (2.17) полезно, главным
образом в практической полуколичественной работе. Его даже назвали «чисто эмпи-
рическим выражением» [36] (с чем авторы книги не согласны!). Тем не менее, ввиду
его простоты и удобства, а также фундаментальной теоретической базы это уравне-
ние по-прежнему рекомендуется использовать в повседневной работе.
2.4.1.2. Несколько рекомендаций по выбору колонки
Когда говорят о параметрах колонки, имеют в виду ее длину и диаметр, размер час-
тиц. При этом не забывают о скорости потока. Все вместе эти параметры определя-
ют число теоретических тарелок N, продолжительность эксперимента и перепад дав-
ления на колонке P. Чем больше нужно теоретических тарелок, тем, как правило,
продолжительнее разделение. Однако в случае, если колонка и система способны
выдерживать большой перепад давления, повышение давления решает проблему вы-
бора между числом теоретических тарелок и временем анализа: либо повышаем N
при неизменном времени анализа, либо сокращаем время анализа, не меняя N. Вы-
бор диаметра колонки зависит от задачи: в препаративных разделениях используют
больший диаметр (глава 15), а с колонками меньшего диаметра работают, если:
1. необходимо повысить чувствительность, но при этом количество образца ограни-
чено;
2. необходимо снизить объемную скорость потока в ЖХ-МС (раздел 4.14);
3. необходимо сократить потребление растворителей;
4. разделение проходит при очень высоком давлении (что позволяет свести к мини-
муму проблемы, вызванные нагревом внутри колонки, раздел 3.5.4.3).
Диаметр колонки dc напрямую не оказывает какого-либо влияния на соотноше-
ние между N, продолжительностью разделения и P. Однако, чем уІже колонка, тем
меньше объем пика и тем больше вклад внеколоночного размывания. Значит, чем
меньше диаметр колонки, тем больше возникает требований непосредственно к са-
мому хроматографу. Равно как и работа при высоком давлении (больше чем 400 бар)
требует наличия специального оборудования (раздел 3.3.5.4) и специальных колонок.
Когда принято решение относительно диаметра колонки, подобрать остальные
параметры колонки поможет теория, изложенная в разделе 2.4.1.1. Далее будем счи-
тать, что в разделении участвуют небольшие молекулы массой менее 1000 Да. Как
разделять более крупные молекулы описано в разделе 13.3.1 (см. также материал
к рис. 2.11б). Рассмотрим три варианта:
А. в наличии есть колонки только одного типа (например, размером 150 Ї 4,6 мм,
упакованные частицами диаметром 5 мкм)
Б. в наличии есть колонки одного типа с одинаковым диаметром, но разной длины
В. широкий выбор колонок разной длины, упакованных частицами разного размера.
Рассмотрим вариант А. Можно менять только скорость потока (как
на рис. 2.11а), но существует максимально возможная скорость потока, которая
определяется максимальными возможностями хроматографической системы или
максимально возможным давлением для данной колонки (хотя часто желательно ра-
ботать при более низком давлении). То есть подбирают такое значение F, которому
будет соответствовать необходимое число теоретических тарелок N, но при этом не
будет превышено некое максимальное давление. Например, предположим, что для
колонки 150 Ї 4,6 мм (рис. 2.11а) требуется N более 10000, при этом давление не дол-
жно превышать 136 бар. Видно, что скорость потока должна составлять примерно
2 мл/мин, что соответствует N = 10000 и P < 136 бар.
Вариант Б: можно менять скорость потока и длину колонки. Максимальное N
за минимальное время будет тогда, когда комбинация F и L приведет к максималь-
ному допустимому давлению. Из уравнения (2.13а) видно, что это эквивалентно
тому, что произведение FL должно оставаться постоянным. На рис. 2.14а показана
получающаяся зависимость N от времени анализа (для значений t0) для трех разных
размеров частиц 2, 5 и 10 мкм. Из данных, представленных на этом рисунке, можно
сделать следующий вывод: меньший размер частиц (2 мкм) позволяет сократить
время анализа (и, соответственно, меньше требуемое N). Таким образом, для t0 = 1
мин наибольшее N будет у колонки, упакованной частицами 2 мкм, а для t0 =
= 1000 мин — у колонки с частицами 10 мкм. То есть, чем большее число теоретиче-
ских тарелок требуется, тем крупнее должны быть частицы в колонке. Если для ана-
лиза достаточно небольшого числа теоретических тарелок, то лучше всего выбирать
колонку, упакованную частицами малого диаметра — это приведет к более коротко-
му времени анализа. Для анализов средней продолжительности (например, t0 > 5 ми-
нут) соответственно подойдут колонки с частицами промежуточного размера
(5 мкм), которые, по сравнению с частицами меньшего размера, дают требуемое чис-
ло теоретических тарелок за более короткое время.
По данным рис. 2.14а построен кинетический график или график Поппе [37, 38]
(рис. 2.14б). Это график зависимости времени, необходимого для образования одной
теоретической тарелки (t0/N), от величины N. Видно, что величина «время на теоре-
тическую тарелку» растет с увеличением N. Кроме того, согласно этому графику,
если для разделения требуется небольшое число теоретических тарелок, то лучше ис-
пользовать сорбент с малыми частицами, и наоборот, если большое, то предпочтите-
лен сорбент с крупными частицами. Пунктирные линии, обозначенные «10 с»,
«100 с» и «1000 с», соответствуют условиям постоянного t0. Чтобы определить другие
значения t0, проводят прямые, параллельные этим линиям. В настоящее время гра-
фики Поппе широко используют для сравнения характеристик колонок, поскольку
они учитывают и эффективность и проницаемость колонок.
В варианте В допускается изменение длины колонки и размера частиц. Этот ва-
риант полезен, когда надо разработать либо очень быстрое разделение, либо требует-
ся очень большое число тарелок (экстремальные условия разделения). Последние
10 лет говорят о растущей потребности в очень быстрых ВЭЖХ-разделениях продол-
жительностью минута и даже меньше (раздел 2.5.3.2). С другой стороны, сейчас био-
химики столкнулись с проблемой разделения образцов, содержащих тысячи компо-
нентов (раздел 13.4.5). В таких случаях важнее большее число N. Вне зависимости
от того, является ли целью сложного разделения минимальная продолжительность
или максимальное число теоретических тарелок, лучше подбирать условия, при ко-
торых N в единицу времени будет максимальным (как на рис. 2.14б). Можно показать, что выбор оптимальных длины колонки, размера частиц и скорости потока все-
гда будет соответствовать минимальному значению h Ј 2 (или н Ј 3). Поскольку
имеющиеся в продаже колонки ограничены в длине и размере частиц, можно только
подобрать приблизительные условия для н Ј 3 одновременно с требуемым значением
N за минимальное время анализа. К счастью, увеличение н в 2—3 раза слабо влияет
на h или N, что существенно расширяет возможность выбора размера частиц или ко-
лонки желаемого размера. См. также [38а].
График на рис. 2.15 построен по уравнению (2.17) при v = 3 и служит примером,
как можно подобрать условия, при которых достигается максимальное N для опреде-
ленного времени разделения при некотором заданном максимальном P. Предполо-
жим, максимальное давление составляет 136 бар (2000 psi), а k последнего пика
на хроматограмме равно 3 (для других значений k нужно подбирать время по
рис. 2.15 и уравнению (2.5)). В этих условиях, если требуется N = 5000, продолжи-
тельность анализа может составить 15 секунд (на рисунке обозначено • и стрелкой),
а 300000 теоретических тарелок требуют 17-часового анализа (60000 с, на рисунке
обозначено и стрелкой). В первом случае (N = 5000) необходимо использовать час-
тицы размером 1 мкм, во втором (N = 300000) — 9 мкм. То есть для быстрых разделе-
ний лучше всего использовать колонки с малым размером частиц, если же требуется много теоретических тарелок, то подойдут и крупные частицы, но при этом увели-
чится время анализа (см. предыдущее обсуждение рисунка 2.14). Увеличение допус-
тимого давления дает возможность либо сократить время анализа (при неизменном
N), либо увеличить N (при неизменном времени анализа). В этом можно убедиться,
сравнив графики на рис. 2.15 для P = 1360 бар (20000 psi) и P = 68 бар (1000 psi). По-
вышение допустимого давления способствует использованию малых частиц для бо-
лее быстрого разделения или большего числа N. Очень большое количество теоре-
тических тарелок или очень быстрые разделения требуют экстремальных условий,
о чем свидетельствует рис. 2.15.
По разным причинам графики, изображенные на рис. 2.11 и 2.13—2.15, носят
приблизительный характер, и при варьировании условий, перечисленных в табли-
це 2.4 (например, вязкости подвижной фазы, молекулярной массы компонентов об-
разца, температуры) они будут изменяться. Поэтому эти графики могут служить
прежде всего качественными ориентирами для выбора экспериментальных условий,
а не для количественных расчетов какого-то конкретного разделения.
Скорость потока и длину колонки, соответствующие графикам на рис. 2.15,
можно определить по уравнению (2.18), учитывая что H = L/N и h = 2:
L = NH = Nhdp = 2Ndp. (2.21)
Здесь L и dp выражено в сантиметрах. По уравнению (2.18а) для v Ј 3
см. уравнение в книге (2.21а)
а F определяют по уравнению:
см. уравнение в книге ( (2.21б)
где Vm — мертвый объем колонки (равный t0F, уравнение (2.7а)). Единицы измере-
ния в уравнении (2.21б) следующие: мл/с(F), мл (Vm), см2/с(Dm), см (L), см (dp).
2.4.2. Форма пика
До сих пор мы предполагали, что на окончательной хроматограмме у нас получатся
симметричные пики. В идеальных условиях пик имеет форму кривой Гаусса
см. уравнение в книге ( (2.22)
Здесь x = (t tR)/
у, где t — это время, у = W/4, а y — это высота пика. Форма настоя-
щих пиков на хроматограмме, как правило, немного отличается от симметричной
кривой Гаусса, в большей или меньшей степени пикам свойственно размывание зад-
него фронта (рис. 2.16а). Размывание заднего фронта пика можно охарактеризовать
двумя параметрами: коэффициентом асимметрии As (на рис. 2.16а показан слева) или
фактором размывания TF (tailing factor) (на рисунке справа). Величины As и TF взаи-
мосвязаны следующим образом:
см. уравнение в книге ( (2.22а)
то есть значения As, как правило, немного больше TF (таблица 2.5).
На рис. 2.16б показано, как в зависимости от значений As и TF меняется форма
пика. У идеально симметричного пика As = TF = 1,0. Влияние размывания на разде-
ление двух соседних пиков продемонстрировано на рис. 2.16в, где изменяется только
размывание, охарактеризованное TF. Два пика с As = TF = 1,0 хорошо отделяются
друг от друга, но чем больше размывание, тем хуже разделение. Во многих случаях размывание пика (TF < 1,2) мало и поэтому им можно пренебречь. Исключением яв-
ляется ситуация, когда сразу же за большим пиком элюируется малый (сравните
рис. 2.17г и д). Гораздо реже встречается размывание переднего фронта пика (TF <
< 1,0, рис. 2.16г), которое оказывает аналогичное, потенциально отрицательное вли-
яние на разделение. Когда пик подвергается сильному размыванию TF > 2, это ска-
зывается не только на разделении, но и на количественном анализе, поэтому в ру-
тинных анализах рекомендуется придерживаться общего правила — показатель TF
всех пиков должен быть меньше 2. Количественная оценка по площади пика (гла-
ва 11) требует интегрирования всего пика, что, в свою очередь, зависит от задания
правильных пределов интегрирования, а это осложняется для пиков с значительной
асимметрией.
Если на хроматограмме (неважно, во время рутинного анализа или в процессе раз-
работки метода) появились сильно размытые пики (TF 2), то рекомендуется незамед-
лительно решить эту проблему. Далее будем считать, что у нас симметричные пики,
если не оговорено иное. Можно выделить ряд причин, приводящих к неправильной
или размытой форме пика:
• «некачественная» колонка (загрязнен фильтр или в колонке между фильтром и
сорбентом образовалось пустое пространство, раздел 5.8);
• засорившаяся колонка (накопление на сорбенте сильно удерживаемых примесей,
раздел 5.8);
• перегрузка колонки (слишком много образца, раздел 2.6.2);
• образец растворен в слишком полярном растворителе (раздел 2.6.1);
• внеколоночное размывание пика (раздел 2.4.1, 3.9);
• силанольные взаимодействия (включая загрязнение сорбента следовыми количест-
вами металла, раздел 5.4.4.1, 7.3.4.2);
• неправильно выбран буфер или недостаточна его буферная емкость (раздел 7.2.1.1);
• прокачивание холодной подвижной фазы через нагретую колонку (неправильное
термостатирование, раздел 2.5.3.1).
См. также раздел 17.4.5.3. Прежде чем решать проблему размывания, надо опре-
делить: это экспоненциальное размывание или размывание в результате перегрузки.
Экспоненциальное размывание характеризуется постепенным возращением пика
к базовой линии (рис. 2.16а). При перегрузке колонки пик имеет форму прямо-
угольного треугольника (рис. 2.16д). В последнем случае (рис. 2.16д) уменьшить раз-
мывание можно, введя меньшее количество образца. Однако, при экспоненциальном
размывании этот способ не решает проблему, а может ее даже усугубить [39, 40]. Во-
обще размывание пиков желательно сокращать до значения TF 1,5.
Были предприняты попытки математически описать форму размытого пика раз-
ными способами [41, 42] и дать такое определение числа теоретических тарелок N,
которое бы включало негативное влияние размывания на разделение. Значения N
размытых пиков, вычисленные по уравнению (2.9) (и особенно по уравнению (2.9а)),
завышают эффективность колонки. Реальная эффективность, которую определяли
по фактическому разделению пиков на хроматограмме, говорит о меньшем числе те-
оретических тарелок. Уравнение Дорси-Фоли широко используется для определения
скорректированного значения N для пиков с размыванием заднего фронта [43]:
см. уравнение в книге (2.22б)
Параметры А и В определяют как показано на рисунке 2.16а (на высоте, равной 10%
высоты пика от базовой линии), W0,1 — это величина W, измеренная на той же вы-
соте.
Существует еще один способ определения скорректированного значения N для
асимметричного пика с помощью так называемого значения 5-у:
см. уравнение в книге (2.22в)
Здесь W5у — ширина пика на высоте, равной 4,5% высоты его максимума. Такой
способ вычисления N похожна вычисление числа теоретических тарелок по ширине
пика на его полувысоте (уравнение 2.9а). Чем ближе к базовой линии определяют
ширину пика, тем сильнее влияет размывание пика на число теоретических тарелок,
т.е. W1/2 (незначительное влияние) < W < W5у (существенное влияние). Когда в раз-
делении присутствуют ассиметричные пики, уравнения (2.22б) и (2.22в), также как и
другие способы [41], могут в лучшем случае дать лишь приблизительную оценку эф-
фективности колонки. При сравнении двух пиков на рисунках 2.16а и е можно ви-
деть, что асимметричные пики нельзя описать одной общей формулой (в отличие
от симметричных пиков, для которых есть уравнение (2.22)), и для описания пиков
при TF > 1,2 одного значения N недостаточно. Для характеризации таких пиков
рекомендуется использовать N, вычисленное по уравнению (2.9а), вкупе со значения-
ми As или TF. Во многих случаях уширение заднего фронта пика — один из парамет-
ров, измеряемых при определении пригодности системы, чтобы отследить ухудшение
эффективности колонки. Для этих целей подойдет практически любой метод, кото-
рый позволит отслеживать изменения формы пика, происходящие со временем.
2.5. Разрешение и разработка метода
Разработка метода ВЭЖХ предполагает подбор хроматографических условий, обес-
печивающих приемлемое разделение данного образца. Более подробная информация
(но не такая современная, как в этой книге) дана в работе [44]. Разделение двух пи-
ков i и j (рис. 2.10а) обычно описывается их разрешением Rs, которое можно опреде-
лить по формуле (разность времен удерживания)/(средняя ширина пика) или:
см. уравнение в книге (2.23)
Wi и Wj — ширина пиков i и j, соответственно, на уровне базовой линии. Чем боль-
ше разность времен удерживания пиков и/или уІже пики, тем лучше разделение (бо-
льше разрешение). Для проведения точного количественного анализа разделений,
подобных представленным на рис. 2.17а, предпочтительно иметь разрешение пиков
до базовой линии, т.е. впадина между двумя пиками должна находиться на уровне
базовой линии. Два пика примерно одинакового размера будут иметь разрешение
до базовой линии (рис. 2.17а) при Rs > 1,5. В препаративной хроматографии (раз-
дел 15.3.2) разрешение до базовой линии позволяет полностью выделить каждый пик
со 100%-ной чистотой.
На рис. 2.17 изображены примеры различного разрешения (Rs = 1,0, 1,5, 2,0)
при разном соотношении размеров пиков (1:1, 10:1, 100:1, 1000:1). Когда разрешение
двух симметричных пиков (TF =1,0) больше 1,5, то видно, что перекрывание достаточ-
но мало вне зависимости от их относительных размеров. Небольшое размывание за-
днего фронта пика (TF = 1,2, рис. 2.17д) может приводить к значительной потере
разрешения, если следом за крупным пиком элюируется малый пик. В этом случае
нужно подбирать условия, чтоб разрешение было больше двух. С практической точки
зрения уменьшить размывание пика до TF Ј 1,0 очень сложно. Следовательно, если Существует еще один способ определения скорректированного значения N для
асимметричного пика с помощью так называемого значения 5-у:
см. уравнение в книге (2.22в)
Здесь W5у — ширина пика на высоте, равной 4,5% высоты его максимума. Такой
способ вычисления N похожна вычисление числа теоретических тарелок по ширине
пика на его полувысоте (уравнение 2.9а). Чем ближе к базовой линии определяют
ширину пика, тем сильнее влияет размывание пика на число теоретических тарелок,
т.е. W1/2 (незначительное влияние) < W < W5у (существенное влияние). Когда в раз-
делении присутствуют ассиметричные пики, уравнения (2.22б) и (2.22в), также как и
другие способы [41], могут в лучшем случае дать лишь приблизительную оценку эф-
фективности колонки. При сравнении двух пиков на рисунках 2.16а и е можно ви-
деть, что асимметричные пики нельзя описать одной общей формулой (в отличие
от симметричных пиков, для которых есть уравнение (2.22)), и для описания пиков
при TF > 1,2 одного значения N недостаточно. Для характеризации таких пиков
рекомендуется использовать N, вычисленное по уравнению (2.9а), вкупе со значения-
ми As или TF. Во многих случаях уширение заднего фронта пика — один из парамет-
ров, измеряемых при определении пригодности системы, чтобы отследить ухудшение
эффективности колонки. Для этих целей подойдет практически любой метод, кото-
рый позволит отслеживать изменения формы пика, происходящие со временем.
2.5. Разрешение и разработка метода
Разработка метода ВЭЖХ предполагает подбор хроматографических условий, обес-
печивающих приемлемое разделение данного образца. Более подробная информация
(но не такая современная, как в этой книге) дана в работе [44]. Разделение двух пи-
ков i и j (рис. 2.10а) обычно описывается их разрешением Rs, которое можно опреде-
лить по формуле (разность времен удерживания)/(средняя ширина пика) или:
см. уравнение в книге (2.23)
Wi и Wj — ширина пиков i и j, соответственно, на уровне базовой линии. Чем боль-
ше разность времен удерживания пиков и/или уІже пики, тем лучше разделение (бо-
льше разрешение). Для проведения точного количественного анализа разделений,
подобных представленным на рис. 2.17а, предпочтительно иметь разрешение пиков
до базовой линии, т.е. впадина между двумя пиками должна находиться на уровне
базовой линии. Два пика примерно одинакового размера будут иметь разрешение
до базовой линии (рис. 2.17а) при Rs > 1,5. В препаративной хроматографии (раз-
дел 15.3.2) разрешение до базовой линии позволяет полностью выделить каждый пик
со 100%-ной чистотой.
На рис. 2.17 изображены примеры различного разрешения (Rs = 1,0, 1,5, 2,0)
при разном соотношении размеров пиков (1:1, 10:1, 100:1, 1000:1). Когда разрешение
двух симметричных пиков (TF =1,0) больше 1,5, то видно, что перекрывание достаточ-
но мало вне зависимости от их относительных размеров. Небольшое размывание за-
днего фронта пика (TF = 1,2, рис. 2.17д) может приводить к значительной потере
разрешения, если следом за крупным пиком элюируется малый пик. В этом случае
нужно подбирать условия, чтоб разрешение было больше двух. С практической точки
зрения уменьшить размывание пика до TF Ј 1,0 очень сложно. Следовательно, если концентрация примеси в образце низкая относительно ближайшего основного пика,
то желательно, если вообще возможно, чтобы первым элюировался пик примеси, а по-
сле него шел целевой пик. Это необходимо сделать для того, чтобы минимизировать
влияние размывания заднего фронта пика на разрешение (сравните рис. 2.17д и е).
Изменить порядок элюирования пиков, т.е. сделать так, чтобы первым выходил не-
большой пик, а потом уже большой, иногда можно в процессе разработки метода раз-
деления, варьируя условия, влияющие на селективность (раздел 2.5.2).
Обычно при разработке ВЭЖХ-метода стоит задача отделить каждый интересую-
щий нас пик от соседних до базовой линии (Rs 2) с коэффициентом запаса, рав-
ным 1/3 (а не задача разделения до базовой линии пиков примерно одинакового раз-
мера с Rs Ј 1,5). Подбор условий для получения Rs 2 проводится для того, чтобы
компенсировать незначительное размывание фронта пика, умеренное отличие пиков
по размеру и обычное медленное ухудшение эффективности колонки, которое также
приводит к размыванию и уширению пиков. В некоторых случаях может потребова-
ться даже большее значение Rs. В разделах 2.5.1 и 2.5.3 даны рекомендации по улуч-
шению Rs.
Когда требуется разделить больше двух пиков, подбирают такие условия, в кото-
рых разрешение наименее разделяющейся пары пиков было бы не менее двух. Такая
пара пиков называется критической, а их разрешение — критическим разрешением
разделения. Примером могут служить соседние пики 1 и 2 с разрешением Rs = 0,8
(рис. 2.18а) или пики с разрешением Rs = 3,9 (рис. 2.18г). Разрабатывая метод, стара-
ются, чтобы разрешение критической пары пиков было приемлемым. Это значит,
что разделение остальных пиков также будет удовлетворительным с Rs 2. В этой
книге при упоминании разрешения Rs имеется в виду разрешение критической пары пи-
ков (если не оговорено иное).
При разработке метода удобно использовать другое, приближенное выражение
для разрешения, полученное из уравнений (2.5а) и (2.10а) (при условии равенства
ширины двух пиков):
см. уравнение в книге (2.24)
Из уравнения видно, что разрешение зависит от удерживания k первого пика i
(член а), коэффициента селективности б (член б) и эффективности колонки или числа теоретических тарелок N (член в). Коэффициент селективности б (его еще на-
зывают селективностью разделения или относительным удерживанием) можно вы-
числить по формуле:
(2.24а)
Значения ki и kj — это удерживание k соседних пиков i и j (рис. 2.10а). Для этого
разделения k k1 = 1,55, б = 1,12, N = 11000, следовательно, Rs = (1/4)[1,55/2,55] Ї
Ї (1,12 1)
110000,5 = 1,9. На основании уравнения (2.24) можно сделать вывод: разре-
шение можно улучшить изменяя k, б или N, однако наиболее эффективно улучшение
селективности разделения (параметр б).
Хотя уравнение (2.24) дает не такие точные результаты, как уравнение (2.23), все
же оно более полезно в процессе разработки метода. Все численные значения Rs
в этой книге всегда определяли по уравнению (2.23). Уравнение (2.24) необходимо,
главным образом, для понимания того, как разрешение зависит от эксперименталь-
ных условий, а также в качестве инструкции по системной разработке метода. Разре-
шение Rs можно также выразить следующим образом:
см. уравнение в книге (2.25)
Производные формулы (2.24) и (2.25) получены при разной аппроксимации ширины
двух пиков. Вычисленные по обоим уравнениям значения Rs одинаково точны.
Единственное преимущество уравнения (2.24) — простота в использовании при раз-
работке метода.
Разработка изократического ВЭЖХ-метода разделения заключается в пошаговом
изменении («оптимизации») экспериментальных условий до тех пор, пока разделе-
ние не станет приемлемым с критическим разрешением, желательно, больше двух.
В разделах 2.5.1—2.5.3 показано, что уравнение (2.24) служит удобным руководством
по разработке изократического метода. Каждый из членов а-в уравнения (2.24) мож-
но контролировать, изменяя определенные условия разделения (табл. 2.2). Обычно
сначала выбирают колонку с достаточным числом теоретических тарелок, способную
разделить образец указанной сложности. В большинстве случаев лучше начинать
с N Ј 10000. Такой эффективностью обладают колонки длиной 150 мм, упакованные
частицами 5 мкм, либо колонки длиной 100 мм с 3 мкм частицами. Затем подбирают
долю растворителя В в подвижной фазе. Она должна быть такой, чтобы коэффици-
ент удерживания укладывался в соответствующий интервал (например, 1 k 10),
после чего оптимизируют б. На последнем этапе корректируют число теоретических
тарелок колонки, пытаясь найти компромисс между несовместимыми параметрами:
приемлемым разрешением и небольшим временем анализа.
Финальные условия разделения вряд ли можно назвать действительно оптималь-
ными, но они лучшие из возможных. Тем не менее в литературе часто встречается
термин «оптимизированный», который означает относительно улучшенные или ре-
комендуемые условия, но не абсолютно идеальные. Кроме того, следует отметить
разницу между «локальной» и «глобальной» оптимизациями. Локальная оптимиза-
ция — это улучшение одного или двух (редко больше) условий разделения в ограни-
ченном интервале значений каждого из этих условий. При этом все остальные усло-
вия, обычно не оптимальные, такими же и остаются. Глобальная оптимизация
предполагает подбор всех условий, от которых зависит разделение. Когда говорят об
«оптимизированной» методике, в большинстве случаев имеют ввиду улучшенное раз-
деление или локальный оптимум. Будем и далее в этой книге придерживаться этой
формулировки: «оптимум» не есть синоним глобально лучшего разрешения.
2.5.1. Оптимизация фактора удерживания k
(член а в уравнении (2.24))
В изократических методах удерживание вещества обычно контролируют путем изме-
нения доли растворителя В в подвижной фазе (%В). На первом этапе подбирают та-
кое значение k, которое было бы не слишком большим, но и не слишком малым. За-
висимости относительных значений разрешения Rs (уравнение 2.24) и высоты пика
(уравнение 2.11) от коэффициента удерживания изображены на рис. 2.19, чтобы по-
казать, как они влияют на k (предполагается, что k не влияет на ". В нижней части
рис. 2.19 наглядно представлено как меняется разрешение и высота пиков при изме-
нении %В в интервале значений k от 1 до 10.
Как правило, стремятся к тому, чтобы удерживание всех пиков на хроматограмме
было # 10, т.к. это условие соответствует более высоким и узким пикам, что улучшает
их детектирование, а также приводит к уменьшению времени анализа, следовательно,
в день можно анализировать больше образцов. Значения k K 1 могут приводить к пло-
хому разрешению, особенно из-за возможного наложения зон анализируемых веществ
на зоны скапливающихся в области t0 компонентов матрицы (см. «мусорный» пик
на рис. 2.5б). Следовательно, после завершения разработки разделения, в окончатель-
ной методике времена удерживания всех пиков должны находиться в интервале 1 # k # 10.
Впрочем, по выбору хроматографиста этот интервал значений k можно несколько рас-
ширить, например, от 0,5 до 20. С другой стороны, органы контроля могут рекомендо-
вать значение k не менее двух для всех целевых пиков на хроматограмме [46], чтобы
уменьшить влияние вспомогательных веществ или других неустановленных пиков
(«мусор»), элюируемых с колонки вблизи t0. Если для детектирования используется
масс-спектрометр (ЖХ-МС), то из-за возможных эффектов подавления ионов подби-
рают k 3. Когда понятно, что все интересующие нас пики не помещаются в некото-
рый максимальный интервал (т.е. 0,5 # k # 20), переходят к градиентному элюирова-
нию (раздел 2.7.2, глава 9).На рис. 2.18 показано, как изменение доли органического растворителя в по-
движной фазе влияет на обращенно-фазовое разделение. При 80% метанола в воде
(80 %В) значения k слишком малы: 0,3 # k # 0,8 и, как следствие, разрешение низкое
(рис. 2.18а). Снижение доли растворителя В до 50% (рис. 2.18г, 4 # k # 19) приводит
к очень хорошему разрешению (Rs = 3,9), но время разделения слишком велико, и
последние пики стаовятся широкими и низкими, что понижает чувствительность де-
тектирования. К разумному компромиссу между разрешением (Rs = 2,6), чувствитель-
ностью детектирования и продолжительностью анализа (6 минут), удается прийти,
установив промежуточное значение В (60%, рис. 2.18в). При этом и удерживание
укладывается в приемлемый диапазон 1,8 # k # 6,6. Подвижная фаза, содержащая
60—70 %В, возможно, будет даже лучше, так как достигается разрешение Rs > 2,0, за-
трачивается еще меньше времени на анализ и ещё повышается чувствительность.
В ОФХ удерживание зависит от доли органического растворителя (как показано
на рис. 2.18) и эта зависимость описывается эмпирическим уравнением [47]
см. уравнение в книге (2.26)
где $ — объемная доля растворителя В (равная 0,01 Ї%В), kw — экстраполированное
значение k соединения X в подвижной фазе, состоящей из чистой воды, т.е. при $ =
= 0, а S — константа для соединения X, когда изменяется только $. Вывод уравне-
ния (2.26) приведен в работе [48]. Для «малых» молекул с молекулярным весом
100—500 Да константа S Ј 4 [49], поэтому увеличение $ на 0,1, т.е. изменение по-
движной фазы на +10 %В, приведет к среднему уменьшению k всех пиков в образце
примерно в 10(0,1Ї4) раз или в 2,5 раза. Поэтому уравнение (2.26) подразумевает по-
следовательный порядок действий, в ходе которых осуществляется поиск удовлетво-
рительного %В — такого, чтобы k находился в диапазоне от 1 до 10 (или в любом
другом желательном интервале).
В соответствии с этим порядком действий первое разделение выполняется с 80%
или 90 %В. Такое высокое содержание органического растворителя в подвижной
фазе гарантирует полное элюирование всего образца с колонки за короткое время.
Например, в первом эксперименте с 80 %В (рис. 2.18а) был получен интервал удер-
живания 0,3 # k # 0,8. Применив правило 2,5-кратного увеличения k при снижении
на каждые 10 %В, можно оценить k для меньших долей растворителя В: для 70%
2,5 Ї 0,3 Ј 0,8 (k первого пика), 2,5 Ї 0,8 Ј 2,0 (k последнего пика), т.е. 0,8 # k # 2,0.
Аналогично рассчитываем для 60 %В и получаем 2,0 # k # 5. Этот интервал вполне
соответствует требуемому 1,0 # k # 10 (как и наблюдаемый 1,8 # k # 6,6). Поэтому
в качестве подвижной фазы во втором эксперименте по разработке метода лучше ис-
пользовать 60 %В (остальные условия разделения остаются неизменными).
Для образца, содержащего соединения, удерживающиеся слабее, чем представ-
ленные на рис. 2.18, начальное элюирование 80 %В, приведет к тому, что все пики
на хроматограмме будут иметь k Ј 0 (т.е. все вещества в образце выйдут в одном
пике). Чтобы подобрать приемлемые значения k, необходимо существенно сократить
долю органического растворителя по крайней мере на 30%. Поэтому второй экспе-
римент целесообразно проводить с (80 %В 30
%В) = 50 %В. Затем, как в приведен-
ном выше примере (рис. 2.18), следует изменять %В до тех пор, пока 1 # k # 10. По-
скольку «правило 2,5» носит приблизительный характер, то между экспериментами
нежелательно изменять %В более чем на 30%, иначе при маленькой доле органиче-
ского растворителя можно упустить поздноэлюируемые пики. Существует и другой
способ подбора %В (обычно предпочтитают его): разрабатывая методику, первый эк-
сперимент проводят в градиентном режиме (раздел 9.3.1).
2.5.2. Оптимизация селективности б
(член б в уравнении (2.24))
Если и дальше требуется улучшение разделения, то следующим шагом является регу-
лирование относительного удерживания (расстояние между пиками на хроматограм-
ме, селективность или коэффициент селективности б) путем изменения любого
из первых семи параметров таблицы 2.2: %В, растворитель В (обычно метанол или
ацетонитрил), температура, тип колонки или — если в образце есть кислоты или
основания — рН, концентрация буфера, концентрация ион-парного агента. Заметим,
что любое изменение каждого из параметров таблицы 2.2 влияет на значение k, по-
этому необходимо одновременно корректировать %В, чтобы коэффициент удержива-
ния оставался в допустимом диапазоне (как правило, не более 0,5 # k # 20).
На рис. 2.20 показано изменение селективности при разделении образца, содер-
жащего 6 соединений. Первоначально %В был подобран так, чтобы коэффициент
удерживания находился в интервале 2 # k # 4 (рис. 2.20а). Для улучшения селектив-
ности и разрешения будем далее изменять %В и температуру. В условиях 45 %В и
Т = 30 °С (рис. 2.20а) пики 1-3 и 5/6 плохо разрешены (Rs = 0,3). Снижение доли
органического растворителя в элюенте до 30% (рис. 2.20б) положительно отразилось
на разделении всех 6 пиков с подходящим интервалом удерживания (4 # k # 12),
но разрешение пиков 3 и 4 стало предельно допустимым, в то время как в пер-
вом эксперименте (рис. 2.20а) они разделились хорошо. Кроме того, при 30 %В
(рис. 2.20б) пики 5 и 6 поменялись местами. По этим двум хроматограммам можно
сделать вывод: промежуточная доля растворителя В, вероятно, улучшит разрешение,
т.е. увеличится расстояние между пиками 3 и 4, а пики 1/2 и 5/6 не слишком сблизятся. На самом деле подвижная фаза с 33 %В и температура 30 °С значительно улуч-
шают разрешение (Rs = 2,1, хроматограмма не показана).
Если не менять состав подвижной фазы (оставить такой как на рисунке 2.20а),
но увеличить температуру с 30 до 45 °С (рис. 2.20в), относительное удерживание (или
селективность) изменятся, но в целом разделение останется неприемлемым (Rs =
= 0,4). Можно путем проб и ошибок найти подходящие %В и температуру и опреде-
лить максимальное разрешение. Оно будет составлять Rs = 4,0 при 20 %В и 47 °С
(рис. 2.20в), но значение k при этом достигнет 20. Целью повышения селективности
является либо увеличение разрешения или сокращение продолжительности анализа,
либо одновременное изменение обоих параметров. При выборе условий приемлемого
разделения (например, во время разработки метода) следует отдать предпочтение из-
менению селективности, поскольку она одновременно влияет и на разрешение, и на про-
должительность анализа. Это в первую очередь справедливо для трудноразделимых
образцов с большим количеством компонентов (когда на хроматограмме наблюдает-
ся очень много пиков) или с компонентами, чьи времена удерживания очень близки
(например, изомеры).
2.5.2.1. «Правильные» и «неправильные» образцы
Настоящий раздел поможет понять как и почему меняется разделение в зависимости
от %В, особенно в градиентном режиме. Тем не менее, этот материал не так важен
в повседневной работе или при разработке методов разделения в ОФХ. Поэтому его
можно пропустить, перейти к разделу 2.5.3, а сюда вернуться, если возникнет необхо-
димость.
В обращенно-фазовых разделениях образцы можно поделить на «правильные»
или «неправильные» [52]. При изменении только лишь %В хроматограмма «правиль-
ных» образцов как аккордеон, либо сжимается, либо растягивается с минимальным
изменением относительного удерживания пиков на хроматограмме. Хороший при-
мер «правильного» образца (смесь гербицидов) дан на рис. 2.18, а на рис. 2.20 изоб-
ражено разделение «неправильного» образца. Об этом говорит инверсия пиков 5 и 6
при изменении %В (сравните рис. 2.20б и 2.20а), а также небольшое изменение в от-
носительном удерживании пиков 1 и 4. Относительное удерживание (или селектив-
ность) «неправильного» образца зависит от %В, «правильного» — нет. Пики «непра-
вильного» образца отслеживать сложнее из-за возможного изменения порядка
элюирования и ошибочного распознавания пиков (раздел 2.6.4).
Обычно компоненты «правильных» образцов имеют родственную структуру, тог-
да как «неправильные» образцы, такие как на рисунке 2.20, являются смесями соеди-
нений различной структуры. Тем не менее, очень сложно заранее сказать какой об-
разец «правилен», а какой «неправилен». Более или менее точный ответ дают
эксперименты с разной долей растворителя В в элюенте (рис. 2.18). Кроме того,
можно по уравнению (2.26) определить, к какой группе отнести образец. У правиль-
ных образцов наблюдается сильная корреляция между значениями S и log kw (напри-
мер, графики зависимости этих величин смещены друг относительно друга и прак-
тически параллельны), в то время как у неправильных образцов такая корреляция
не наблюдается (т.е. графики зависимости S от log kw пересекаются). Многие образ-
цы демонстрируют промежуточное поведение (среднее между тем, что изображено
на рис. 2.18 и 2.20), у них менее выражены изменения в относительном удерживании
при разном %В. Более подробно правильные и неправильные образцы еще раз обсу-
дим в разделе 6.3.1 (изократическое элюирование) и разделе 9.2.3 (градиентное элю-
ирование).