eng
Содержание
Часть 1 .............................................................. 6
Курс 1. Правильная эксплуатация обращенно-фазо-
вых колонок............................................ 6
Курс 2. Работа с буферными растворами в ВЭЖХ ... 21
Курс 3. Состав подвижных фаз в обращенно-фазо-
вой ВЭЖХ. Особенности ион-парной обра-
щенно-фазовой хроматографии.................. 30
Часть 2 .............................................................. 44
Курс 4. Вопросы, наиболее часто задаваемые спе-
циалисту по методической поддержке......... 44
Курс 5. Вопросы, наиболее часто задаваемые спе-
циалисту по технической поддержке. Устра-
нение простых неполадок ВЭЖХ оборудо-
вания ..................................................... 71
Часть 3 .............................................................. 95
Курс 6. Неподвижные фазы для ВЭЖХ: основы. Об-
щий принцип выбора неподвижных фаз...... 95
Курс 7. ВЭЖХ колонка как промышленный продукт.
Качество колонки .................................... 103
Курс 8. Неподвижные фазы для обращенно-фазовой
ВЭЖХ ................................................... 114
Часть 4 .............................................................. 128
Курс 9. Стандартные ошибки, допускаемые при ра-
боте с ВЭЖХ оборудованием ..................... 128
Курс 10. Полезные подсказки для тех, кто хочет ра-
ботать эффективно и с удобством............... 139
Курс 11. Курьезы в ВЭЖХ. Организационные и неклас-
сифицируемые ошибки ............................. 148
CP1252CP1251
Константин Сергеевич Сычев начал профессиональную
карьеру как химик-аналитик в 1998 г., в 2001 г. окончил
химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, в 2004 г.
получил степень кандидата химических наук по специаль-
ности «хроматография и хроматографические приборы» под
руководством В.А. Даванкова (изобретателя хиральной ВЭЖХ,
лауреата золотой медалиМартина и медали Нернста –Цвета).
Направления научной работы (2001–2004 гг.): исследо-
вание механизмов удерживания и изучение новых адсорб-
ционных материалов для ВЭЖХ и ТФЭ. Основные дости-
жения — разработка методологии численного выделения
индивидуальных механизмов удерживания из данных по удер-
живанию в смешанных режимах, а также первое прямое
доказательство связи между удерживанием в режиме с пе-
реносом заряда и характеристиками пи-систем адсорбатов.
С 2004 г. продолжил профессиональную карьеру как раз-
работчик прикладных аналитических методик с примене-
нием ВЭЖХ и ТФЭ. В 2008 г. основал компанию «СКАН»
(ИП Сычев К.С.), специализирующуюся на разработке ком-
мерческих ВЭЖХ методик. В 2011 г. компания запустила
проект авторских ВЭЖХ курсов по различным програм-
мам, которые пользуются большим успехом и в настоящее
время.
В 2017 г. основал компанию Integrated BioSeparation Solutions
(Эстония), специализирующуюся на разработке ВЭЖХ
методик, проведении ВЭЖХ исследований, поставке и об-
служивании ВЭЖХ систем с предустановленными ВЭЖХ
методиками — фармакопейными и собственной разработки.
С 1998 по 2020 гг. опубликовал более 50 статей в рос-
сийских и международных реферируемых журналах, стал
автором пять книг по ВЭЖХ и подготовке пробы. Автор-
ские ВЭЖХ-курсы прослушали более 500 специалистов из
более чем 60 компаний.
В ближайших планах — развитие брендовой линейки
OEM колонок для ВЭЖХ, запуск новых линеек специа-
лизированных ВЭЖХ комплексов, работа над новой кни-
гой «Применение ВЭЖХ для решения задач фармацевти-
ческой, пищевой и аграрной индустрий» и запуск автор-
ских курсов на английском языке.
Часть 1
Курс 1. Правильная эксплуатация
обращенно-фазовых колонок
– Тема эксплуатации обращенно-фазовых колонок все-
гда вызывает наибольшее количество вопросов. В чем
здесь дело?
– Дело здесь не в самой обращенно-фазовой хромато-
графии, а в массовости ее применения. Кроме того,
другие виды хроматографии, как правило, применя-
ют уже достаточно опытные специалисты, а среди поль-
зователей обращенно-фазовой ВЭЖХ много новичков.
Что, конечно же, замечательно, но им требуется опре-
деленная помощь.
– Хорошо. Начнем с простого вопроса: как начинают
работу с новой обращенно-фазовой колонкой?
– Надо посмотреть на ее сертификат. Понять, силика-
гельная ли это колонка, или полимерная, или на ка-
кой-либо иной основе. Если что, не поленитесь от-
крыть описание этой колонки на сайте производителя.
Если колонка полимерная, то у нее есть ограничение по
давлению порядка 150 бар. Сразу выставьте максимальное
давление в настройках насоса, иначе потом забудете.
Как правило, новые обращенно-фазовые колонки запол-
нены либо метанолом, либо смесью ацетонитрил – вода. Уточ-
ните это. Есть третий вариант: колонка поставлена сухой,
т. е. незаполненной жидкостью. В принципе, это не очень
хорошо. Это значит, что колонка довольно долго лежала на
складе. Для силикагельных колонок это не очень принци-
пиально — высушивание колонки не приводит к потере ее
эффективности. А вот для полимерных колонок высуши-
вание может быть критичным фактором.
Дальше начинается начальная промывка колонки.
Не путайте промывку и кондиционирование.
– А чем промывка отличается от кондиционирова-
ния?
– Колонку промывают либо для ее очистки от остаточ-
ного загрязнения, либо для замены текущего раство-
рителя на какой-либо другой. Как правило, промывка
производится до момента полного удаления из колон-
ки остатков компонентов предыдущей подвижной фазы.
А кондиционирование колонки — это, по сути, выдер-
живание колонки в новой подвижной фазе до момента уста-
новления адсорбционного равновесия в системе, т. е. до ста-
билизации адсорбционных свойств неподвижной фазы —
удерживания и селективности. Проводить анализ можно
только после завершения кондиционирования колонки.
В этом смысле промывка и кондиционирование — это
не только не синонимы, а даже противоположные вещи:
по идее, любая промывка любым растворителем, кроме по-
движной фазы, нарушает адсорбционное равновесие, что
влечет за собой необходимость заново кондиционировать
колонку.
– Хорошо, теперь все понятно. Итак, как проводить
первоначальную промывку обращенно-фазовой ко-
лонки?
– Приготовьте подвижную фазу ацетонитрил – вода 1:1.
Ацетонитрил должен быть марки «для хроматографии»,
т. е. пригодным для работы на длине волны 200 нм.
Если к прибору в комплекте идет УФ детектор любо-
го типа, то заранее подготовьте его к работе. На детекторе
установите короткую длину волны, к примеру 210 нм. За-
полните его кювету подвижной фазой ацетонитрил – вода
1:1, которой будет промываться колонка.
Как это делается?
– Не ставьте колонку на прибор сразу, а сначала со-
едините инжектор и детектор обычным капилляром
диаметра порядка 150 мкм и более. Для этого на оба
конца капилляра надевают самые простые пластико-
вые фитинги и муфты (на английском — юнионы).
Включите поток, и кювета детектора заполнится на-
прямую подвижной фазой. Затем нажмите Auto Zero,
чтобы детектор принял за ноль поглощение чистой
подвижной фазы. Остановите поток.
– Хорошо. Дальше.
– Уберите капилляр, установите вместо него хромато-
графическую колонку. Запустите насос. Теперь не на-
жимайте на Auto Zero, т. е. не сбрасывайте показания
детектора, а наблюдайте за ними.
Установите объемную скорость потока, которая указа-
на в сертификате колонки в условиях проведения ее теста.
Промывайте колонку минут десять до стабилизации дав-
ления (допустим, плюс-минус две-три атмосферы). Если
колонка оказалось сухой, промывайте до тех пор, пока из
колонки перестанут выходить видимые глазом пузырьки
(для наблюдения за ними на сливе необходимо установить
прозрачный тефлоновый капилляр).
Если высота фона (т. е. показания детектора) через неко-
торое время после запуска потока (к примеру 15–20 ми-
нут) оказывается не выше 50 mAU (mV), значит, колонка
более-менее чистая. Дождитесь дрейфа менее 1–2 mAU
(mV) в минуту, и начальную промывку можно считать за-
конченной.
Далее переходите к тестированию колонки при помощи
того или иного теста. Приготовьте подвижную фазу, прове-
дите кондиционирование, проведите тестовый анализ, запишите результаты тестирования в журнал. Теперь обра-
щенно-фазовая колонка готова к работе.
– Какого объема подвижной фазы достаточно для кон-
диционирования новой обращенно-фазовой колонки?
– Для начала не следует путать кондиционирование ко-
лонки и ее промывку. Выше мы рассмотрели простой
способ промывки обращенно-фазовой колонки, и он
достаточно универсален.
А универсального рецепта кондиционирования колонки
не существует, поскольку кондиционирование — это подго-
товка колонки к проведению совершенно конкретного раз-
деления в определенных условиях. Проводится она про-
пусканием подвижной фазы через колонку.
Колонка считается откондиционированной тогда, когда
удерживание всех целевых компонентов становится ста-
бильным. Вам интересно узнать, какой объем подвижной
фазы необходимо пропустить через колонку чтобы удер-
живание стабилизировалось?
– Да.
– Дело не в объеме пропускаемой подвижной фазы, а во
времени кондиционирования. От объема пропускае-
мого через колонку растворителя зависит результат
промывки. А при кондиционировании все определяет
время, а не объем. Поэтому, если колонка надлежа-
щим образом промыта и заполнена применяемой по-
движной фазой, не имеет смысла включать слишком
высокую скорость потока.
– Хорошо, тогда какое время необходимо кондициони-
ровать новую обращенно-фазовую колонку?
– Вот это уже более корректно поставленный вопрос.
В общем случае ответ такой: время кондиционирова-
ния определяется временем установления адсорбци-
онного равновесия в хроматографической системе.
«классической» обращенно-фазовой хроматографии на
«стандартных» С18 и С8 фазах с неполярным энд-кеппин-
гом равновесие устанавливается очень быстро, поэтому на
кондиционирование таких фаз может уходить 10–15 ми-
нут, не более. Поэтому, кстати, именно эти колонки можно
спокойно промывать. И именно поэтому на них хорошо и
воспроизводимо получаются градиентные разделения.
– Мы коснемся этих вопросов отдельно?
– Да, и по градиенту, и по необходимости промывок —
обсудим все.
– Хорошо, дальше.
– Дальше начинаются некоторые сложности. Для об-
ращенных фаз с полярным энд-кеппингом или же с
более полярными, чем С18 и С8, прививками (напри-
мер для С16-амидных фаз) время кондиционирования
может составлять от получаса до нескольких часов.
Происходит это по той причине, что адсорбент теперь
содержит, кроме неполярных, еще и полярные группы; сле-
довательно, на нем организуется некоторый адсорбцион-
ный слой, который существует в равновесии с подвижной
фазой.
– И чем более полярна неподвижная фаза, тем дольше
она приходит в равновесие с подвижной?
– Совершенно верно. Еще это зависит от целевых со-
единений. Соединения, содержащие в своей структу-
ре гидрофильные нейтральные либо ионные фрагмен-
ты (например гликозиды, полярные метаболиты фар-
мацевтиков), более чувствительны к адсорбционно-
му равновесию, поэтому кондиционирование длится
дольше.
Вообще, при применении С16-амидных и подобных им
фаз я настоятельно рекомендую применять солевые буферы достаточно высокой концентрации (до 50 мМ). Это
помогает стабилизировать разделение и уменьшить про-
должительность кондиционирования.
В любом случае применение обращенно-фазовых коло-
нок с полярными группами накладывает некоторые огра-
ничения на возможность их промывки — ведь после про-
мывки их надо заново кондиционировать, т. е. тратить от
получаса и более.
– Есть ли случаи, когда кондиционирование обращен-
ных фаз занимает еще больше времени?
– Да, когда разделение ведется в ион-парном режиме.
Там кондиционирование может длиться от несколь-
ких часов до нескольких дней. Но ион-парные режи-
мы мы обсудим отдельно.
– Хорошо. Вот вопрос в продолжение темы промывок:
чем промывать обращенно-фазовые колонки?
– Для начала я хочу предостеречь от тяги промывать
колонку по любому поводу, а также совсем без по-
вода. Помните, что всякого рода промывки (особенно
скачанные с разных «умных» сайтов) могут убить ко-
лонку значительно быстрее, чем планомерная работа
с одной подвижной фазой. Особенно в том случае,
когда пользователь сам не совсем понимает, что он де-
лает и что хочет этой промывкой достичь.
– Бывает такое, что промывают колонку без повода?
– Конечно. Например, что-то в разделении не получа-
ется и, поскольку непонятно, что делать, промывают
колонку просто «на всякий случай».
Кроме того, в ВЭЖХ полно мифов, и один из них утвер-
ждает, что паразитные (лишние) пики возникают оттого,
что что-то «застряло в колонке». И вместо того чтобы ис-
кать причину в загрязненной пробе или загрязненном инжекторе (включая шприц), начинают интенсивно промы-
вать колонку. Которая вообще здесь ни при чем.
– Но есть же реальные случаи, когда колонку нужно
промыть от веществ, оставшихся в ней после про-
ведения изократического разделения?
– А это уже недостатки методики, которую плохо раз-
работали. В обращенно-фазовой хроматографии для
подобных разделений можно предусмотреть автома-
тическую промывку колонки более сильной подвиж-
ной фазой с последующим кондиционированием при-
меняемой подвижной фазой. Все программируется на
втором насосе, как будто это градиентное элюирование.
– То есть для промывки нужно использовать подвиж-
ную фазу с большим содержанием ацетонитрила?
– Да. Но если применяемая подвижная фаза содержит
соли, то лучше промывать колонку просто смесью аце-
тонитрила и воды — во избежание выпадения соли в
осадок. При этом ацетонитрила берут на 20–30% боль-
ше, чем в применяемой подвижной фазе.
Вообще, если концентрация солевого буфера достаточно
высока, то сначала лучше промыть колонку смесью аце-
тонитрил – вода 1:9 в воде для удаления соли. И только
затем применять промывочную смесь с высоким содержа-
нием ацетонитрила.
И не забудьте, что после промывки колонку необходимо
заново откондиционировать.
Одним словом, на эти промывки, по-моему, тратят слиш-
ком большое количество рабочего времени. . .
– А можно как-то сократить время, затрачиваемое
на промывки?
– Если колонка используется непрерывно, то ее нецеле-
сообразно промывать. Жидкостную систему прибора
промывать от солей в конце дня надо, а колонку —
совершенно необязательно. Ее же потом нужно опять
кондиционировать, а это опять время.
– Но промывки продлевают срок жизни колонки!
– Недоказанное утверждение. Смотря в каких услови-
ях. При экстремальных рН подвижной фазы — ско-
рее всего да, несколько продляют. Но тут уже надо
смотреть, какая цель стоит — нормально работать или
в ущерб нормальной работе беречь колонку.
Вот если колонку оставляют без работы на продолжитель-
ное время (хотя бы на выходные), то обращенно-фазовую
колонку можно промыть. Раз в неделю. Но не в случае ион-
парных разделений, разумеется.
– На многих предприятиях начальная и конечная про-
мывка колонок (start wash, end wash) является обя-
зательной процедурой. Выходит, что это неверно?
– Если такую процедуру предписано проводить каждый
день для колонок всех применяемых типов и без уче-
та агрессивности применяемых подвижных фаз, то,
безусловно, это неразумно. Бездумный подход здесь
крайне нежелателен.
Но промывать колонки можно, если это обращенно-фа-
зовые колонки на силикагельной основе с неполярной при-
вивкой типа С8 или С18, а также неполярным энд-кеппин-
гом. Для таких колонок правильная промывка безопасна,
а их повторное кондиционирование не занимает много вре-
мени.
– Какие предосторожности необходимо соблюдать при
промывке колонок?
– Вы будете смеяться над главной рекомендацией.
– Это уже интересно.
– Надо быть сытым и заниматься этим в спокойной об-
становке. То есть в идеале — после обеда.
Большая часть колонок была убита мной в голодном и нерв-
ном состоянии, когда все валится из рук. В таком состоя-
нии очень просто перепутать банки с растворителем или
подвижной фазой. Особенно если работа ведется очень быстро.
– Ценный совет. А чего не следует делать в частно-
сти?
– Не следует промывать колонку теми растворителя-
ми, с которыми она несовместима. Любые обращенно-
фазовые колонки — и на основе силикагеля, и поли-
мерные — несовместимы с любыми углеводородными
и хлорорганическими растворителями. Самые непо-
лярные подвижные фазы для обращенно-фазовых ко-
лонок — это смеси ацетонитрил –ТГФ 1:1, ацетонит-
рил – дихлорметан 80:20. Несколько более устойчивы
к неполярным растворителям С8 и С30 фазы, на них
можно работать на подвижных фазах с более высоким
содержанием ТГФ, но это уже экзотика.
И еще очень важный совет для тех, кто любит промы-
вать обращенно-фазовые колонки чистым изопропанолом.
Делайте это только путем промежуточного перехода на чи-
стый ацетонитрил. То есть не следует промывать колонку
сразу чистым изопропанолом, если она заполнена смесью
растворителей с долей воды, а тем более — чистой водой.
Это может привести к дестабилизации упаковки адсорбен-
та и уменьшению ее эффективности. Сначала вымойте из
колонки соли (например, смесью ацетонитрил – вода 9:1),
затем заполните ее чистым ацетонитрилом — и лишь затем
аккуратно чистым изопропанолом. После промывки изо-
пропанолом первым делом опять перезаполните колонку
ацетонитрилом.
– В чем следует хранить обращенно-фазовые колонки?
– В принципе, их можно хранить в той же смеси аце-
тонитрил – вода 1:9, которая применяется для ее про-
мывки. Но для длительного хранения лучше приме-
нять смесь ацетонитрил – вода 1:1.
Есть еще один способ консервации обращенно-фазовых ко-
лонок — в изопропаноле. Для полимерных обращенных фаз
этот способ лучше не применять, т. е. использовать его толь-
ко для фаз на основе силикагеля. В этом случае колон-
ка промывается последовательно смесью ацетонитрил – во-
да 1:9 и ацетонитрилом, и лишь заполненную ацетонитри-
лом колонку аккуратно перезаполняют изопропанолом на
небольшой объемной скорости.
– От чего обращенно-фазовые колонки выходят
из строя?
– От того же, что и все ВЭЖХ колонки. Напомню, что в
общем случае колонки выходят из строя по трем при-
чинам: неправильной эксплуатации пользователем, на-
личия скрытых дефектов в упаковке колонки, а так-
же по естественным причинам, т. е. в результате по-
степенного износа.
Среди причин неправильной эксплуатации обращенно-
фазовых колонок лидирует засорение фрита (входного филь-
тра) колонки. Засорение происходит либо механическими
загрязнениями, присутствующими в пробе, либо при вы-
падении в осадок на фрите неполярных компонентов мат-
рицы образца, нерастворимых в применяемой подвижной
фазе.
– Что можно сделать в этом случае?
– Кроме очевидной рекомендации готовить хорошие
пробы для ВЭЖХ?
– Да.
– Достаточно установить перед колонкой ин-лайн фильтр
или предколонку. Засорится картридж ин-лайн филь-
тра или фрит предколонки, но фрит самой колонки
останется в порядке. И колонка также останется цела.
– А номер два по популярности?
– Обращенно-фазовую колонку можно убить вводом про-
бы, которая содержит сильно гидрофобные соедине-
ния в значительных количествах: тяжелые углеводо-
роды, жиры (экстракты минеральных масел, продук-
тов питания), а также белки (неочищенные биологи-
ческие пробы). Еще один способ — пропустить через
колонку зацветший водный буфер, в котором полно
водорослей.
Во всех таких случаях колонку бывает очень тяжело
регенерировать, почти невозможно.
Полимерные обращенно-фазовые колонки часто убива-
ют по неосторожности, работая на давлении, которое зна-
чительно превышает предельные для них 150 бар. Либо не
знают об этом пределе, либо забывают.
– А как же такие факторы, как экстремальные рН,
температура?
На полимерные колонки они никак не воздействуют.
Разумный предел в 50–60 градусов для колонок на осно-
ве силикагеля, как правило, тоже соблюдают. Качествен-
ные силикагельные обращенные фазы достаточно устой-
чивы в области кислого рН вплоть до 2, а при аккуратной
работе — даже вплоть до рН 1.
В щелочной среде силикагельные колонки быстро раз-
рушаются. Существуют обращенные силикагельные фазы
с полимерным энд-кеппингом (когда вместо триметилхлор-
силана применяют полимеризующийся диметилдихлорси-
лан), которые более-менее устойчивы в щелочной среде, но
я бы в любом случае не рекомендовал бы работать на них
при рН более 8–9.
карьеру как химик-аналитик в 1998 г., в 2001 г. окончил
химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, в 2004 г.
получил степень кандидата химических наук по специаль-
ности «хроматография и хроматографические приборы» под
руководством В.А. Даванкова (изобретателя хиральной ВЭЖХ,
лауреата золотой медалиМартина и медали Нернста –Цвета).
Направления научной работы (2001–2004 гг.): исследо-
вание механизмов удерживания и изучение новых адсорб-
ционных материалов для ВЭЖХ и ТФЭ. Основные дости-
жения — разработка методологии численного выделения
индивидуальных механизмов удерживания из данных по удер-
живанию в смешанных режимах, а также первое прямое
доказательство связи между удерживанием в режиме с пе-
реносом заряда и характеристиками пи-систем адсорбатов.
С 2004 г. продолжил профессиональную карьеру как раз-
работчик прикладных аналитических методик с примене-
нием ВЭЖХ и ТФЭ. В 2008 г. основал компанию «СКАН»
(ИП Сычев К.С.), специализирующуюся на разработке ком-
мерческих ВЭЖХ методик. В 2011 г. компания запустила
проект авторских ВЭЖХ курсов по различным програм-
мам, которые пользуются большим успехом и в настоящее
время.
В 2017 г. основал компанию Integrated BioSeparation Solutions
(Эстония), специализирующуюся на разработке ВЭЖХ
методик, проведении ВЭЖХ исследований, поставке и об-
служивании ВЭЖХ систем с предустановленными ВЭЖХ
методиками — фармакопейными и собственной разработки.
С 1998 по 2020 гг. опубликовал более 50 статей в рос-
сийских и международных реферируемых журналах, стал
автором пять книг по ВЭЖХ и подготовке пробы. Автор-
ские ВЭЖХ-курсы прослушали более 500 специалистов из
более чем 60 компаний.
В ближайших планах — развитие брендовой линейки
OEM колонок для ВЭЖХ, запуск новых линеек специа-
лизированных ВЭЖХ комплексов, работа над новой кни-
гой «Применение ВЭЖХ для решения задач фармацевти-
ческой, пищевой и аграрной индустрий» и запуск автор-
ских курсов на английском языке.
Часть 1
Курс 1. Правильная эксплуатация
обращенно-фазовых колонок
– Тема эксплуатации обращенно-фазовых колонок все-
гда вызывает наибольшее количество вопросов. В чем
здесь дело?
– Дело здесь не в самой обращенно-фазовой хромато-
графии, а в массовости ее применения. Кроме того,
другие виды хроматографии, как правило, применя-
ют уже достаточно опытные специалисты, а среди поль-
зователей обращенно-фазовой ВЭЖХ много новичков.
Что, конечно же, замечательно, но им требуется опре-
деленная помощь.
– Хорошо. Начнем с простого вопроса: как начинают
работу с новой обращенно-фазовой колонкой?
– Надо посмотреть на ее сертификат. Понять, силика-
гельная ли это колонка, или полимерная, или на ка-
кой-либо иной основе. Если что, не поленитесь от-
крыть описание этой колонки на сайте производителя.
Если колонка полимерная, то у нее есть ограничение по
давлению порядка 150 бар. Сразу выставьте максимальное
давление в настройках насоса, иначе потом забудете.
Как правило, новые обращенно-фазовые колонки запол-
нены либо метанолом, либо смесью ацетонитрил – вода. Уточ-
ните это. Есть третий вариант: колонка поставлена сухой,
т. е. незаполненной жидкостью. В принципе, это не очень
хорошо. Это значит, что колонка довольно долго лежала на
складе. Для силикагельных колонок это не очень принци-
пиально — высушивание колонки не приводит к потере ее
эффективности. А вот для полимерных колонок высуши-
вание может быть критичным фактором.
Дальше начинается начальная промывка колонки.
Не путайте промывку и кондиционирование.
– А чем промывка отличается от кондиционирова-
ния?
– Колонку промывают либо для ее очистки от остаточ-
ного загрязнения, либо для замены текущего раство-
рителя на какой-либо другой. Как правило, промывка
производится до момента полного удаления из колон-
ки остатков компонентов предыдущей подвижной фазы.
А кондиционирование колонки — это, по сути, выдер-
живание колонки в новой подвижной фазе до момента уста-
новления адсорбционного равновесия в системе, т. е. до ста-
билизации адсорбционных свойств неподвижной фазы —
удерживания и селективности. Проводить анализ можно
только после завершения кондиционирования колонки.
В этом смысле промывка и кондиционирование — это
не только не синонимы, а даже противоположные вещи:
по идее, любая промывка любым растворителем, кроме по-
движной фазы, нарушает адсорбционное равновесие, что
влечет за собой необходимость заново кондиционировать
колонку.
– Хорошо, теперь все понятно. Итак, как проводить
первоначальную промывку обращенно-фазовой ко-
лонки?
– Приготовьте подвижную фазу ацетонитрил – вода 1:1.
Ацетонитрил должен быть марки «для хроматографии»,
т. е. пригодным для работы на длине волны 200 нм.
Если к прибору в комплекте идет УФ детектор любо-
го типа, то заранее подготовьте его к работе. На детекторе
установите короткую длину волны, к примеру 210 нм. За-
полните его кювету подвижной фазой ацетонитрил – вода
1:1, которой будет промываться колонка.
Как это делается?
– Не ставьте колонку на прибор сразу, а сначала со-
едините инжектор и детектор обычным капилляром
диаметра порядка 150 мкм и более. Для этого на оба
конца капилляра надевают самые простые пластико-
вые фитинги и муфты (на английском — юнионы).
Включите поток, и кювета детектора заполнится на-
прямую подвижной фазой. Затем нажмите Auto Zero,
чтобы детектор принял за ноль поглощение чистой
подвижной фазы. Остановите поток.
– Хорошо. Дальше.
– Уберите капилляр, установите вместо него хромато-
графическую колонку. Запустите насос. Теперь не на-
жимайте на Auto Zero, т. е. не сбрасывайте показания
детектора, а наблюдайте за ними.
Установите объемную скорость потока, которая указа-
на в сертификате колонки в условиях проведения ее теста.
Промывайте колонку минут десять до стабилизации дав-
ления (допустим, плюс-минус две-три атмосферы). Если
колонка оказалось сухой, промывайте до тех пор, пока из
колонки перестанут выходить видимые глазом пузырьки
(для наблюдения за ними на сливе необходимо установить
прозрачный тефлоновый капилляр).
Если высота фона (т. е. показания детектора) через неко-
торое время после запуска потока (к примеру 15–20 ми-
нут) оказывается не выше 50 mAU (mV), значит, колонка
более-менее чистая. Дождитесь дрейфа менее 1–2 mAU
(mV) в минуту, и начальную промывку можно считать за-
конченной.
Далее переходите к тестированию колонки при помощи
того или иного теста. Приготовьте подвижную фазу, прове-
дите кондиционирование, проведите тестовый анализ, запишите результаты тестирования в журнал. Теперь обра-
щенно-фазовая колонка готова к работе.
– Какого объема подвижной фазы достаточно для кон-
диционирования новой обращенно-фазовой колонки?
– Для начала не следует путать кондиционирование ко-
лонки и ее промывку. Выше мы рассмотрели простой
способ промывки обращенно-фазовой колонки, и он
достаточно универсален.
А универсального рецепта кондиционирования колонки
не существует, поскольку кондиционирование — это подго-
товка колонки к проведению совершенно конкретного раз-
деления в определенных условиях. Проводится она про-
пусканием подвижной фазы через колонку.
Колонка считается откондиционированной тогда, когда
удерживание всех целевых компонентов становится ста-
бильным. Вам интересно узнать, какой объем подвижной
фазы необходимо пропустить через колонку чтобы удер-
живание стабилизировалось?
– Да.
– Дело не в объеме пропускаемой подвижной фазы, а во
времени кондиционирования. От объема пропускае-
мого через колонку растворителя зависит результат
промывки. А при кондиционировании все определяет
время, а не объем. Поэтому, если колонка надлежа-
щим образом промыта и заполнена применяемой по-
движной фазой, не имеет смысла включать слишком
высокую скорость потока.
– Хорошо, тогда какое время необходимо кондициони-
ровать новую обращенно-фазовую колонку?
– Вот это уже более корректно поставленный вопрос.
В общем случае ответ такой: время кондиционирова-
ния определяется временем установления адсорбци-
онного равновесия в хроматографической системе.
«классической» обращенно-фазовой хроматографии на
«стандартных» С18 и С8 фазах с неполярным энд-кеппин-
гом равновесие устанавливается очень быстро, поэтому на
кондиционирование таких фаз может уходить 10–15 ми-
нут, не более. Поэтому, кстати, именно эти колонки можно
спокойно промывать. И именно поэтому на них хорошо и
воспроизводимо получаются градиентные разделения.
– Мы коснемся этих вопросов отдельно?
– Да, и по градиенту, и по необходимости промывок —
обсудим все.
– Хорошо, дальше.
– Дальше начинаются некоторые сложности. Для об-
ращенных фаз с полярным энд-кеппингом или же с
более полярными, чем С18 и С8, прививками (напри-
мер для С16-амидных фаз) время кондиционирования
может составлять от получаса до нескольких часов.
Происходит это по той причине, что адсорбент теперь
содержит, кроме неполярных, еще и полярные группы; сле-
довательно, на нем организуется некоторый адсорбцион-
ный слой, который существует в равновесии с подвижной
фазой.
– И чем более полярна неподвижная фаза, тем дольше
она приходит в равновесие с подвижной?
– Совершенно верно. Еще это зависит от целевых со-
единений. Соединения, содержащие в своей структу-
ре гидрофильные нейтральные либо ионные фрагмен-
ты (например гликозиды, полярные метаболиты фар-
мацевтиков), более чувствительны к адсорбционно-
му равновесию, поэтому кондиционирование длится
дольше.
Вообще, при применении С16-амидных и подобных им
фаз я настоятельно рекомендую применять солевые буферы достаточно высокой концентрации (до 50 мМ). Это
помогает стабилизировать разделение и уменьшить про-
должительность кондиционирования.
В любом случае применение обращенно-фазовых коло-
нок с полярными группами накладывает некоторые огра-
ничения на возможность их промывки — ведь после про-
мывки их надо заново кондиционировать, т. е. тратить от
получаса и более.
– Есть ли случаи, когда кондиционирование обращен-
ных фаз занимает еще больше времени?
– Да, когда разделение ведется в ион-парном режиме.
Там кондиционирование может длиться от несколь-
ких часов до нескольких дней. Но ион-парные режи-
мы мы обсудим отдельно.
– Хорошо. Вот вопрос в продолжение темы промывок:
чем промывать обращенно-фазовые колонки?
– Для начала я хочу предостеречь от тяги промывать
колонку по любому поводу, а также совсем без по-
вода. Помните, что всякого рода промывки (особенно
скачанные с разных «умных» сайтов) могут убить ко-
лонку значительно быстрее, чем планомерная работа
с одной подвижной фазой. Особенно в том случае,
когда пользователь сам не совсем понимает, что он де-
лает и что хочет этой промывкой достичь.
– Бывает такое, что промывают колонку без повода?
– Конечно. Например, что-то в разделении не получа-
ется и, поскольку непонятно, что делать, промывают
колонку просто «на всякий случай».
Кроме того, в ВЭЖХ полно мифов, и один из них утвер-
ждает, что паразитные (лишние) пики возникают оттого,
что что-то «застряло в колонке». И вместо того чтобы ис-
кать причину в загрязненной пробе или загрязненном инжекторе (включая шприц), начинают интенсивно промы-
вать колонку. Которая вообще здесь ни при чем.
– Но есть же реальные случаи, когда колонку нужно
промыть от веществ, оставшихся в ней после про-
ведения изократического разделения?
– А это уже недостатки методики, которую плохо раз-
работали. В обращенно-фазовой хроматографии для
подобных разделений можно предусмотреть автома-
тическую промывку колонки более сильной подвиж-
ной фазой с последующим кондиционированием при-
меняемой подвижной фазой. Все программируется на
втором насосе, как будто это градиентное элюирование.
– То есть для промывки нужно использовать подвиж-
ную фазу с большим содержанием ацетонитрила?
– Да. Но если применяемая подвижная фаза содержит
соли, то лучше промывать колонку просто смесью аце-
тонитрила и воды — во избежание выпадения соли в
осадок. При этом ацетонитрила берут на 20–30% боль-
ше, чем в применяемой подвижной фазе.
Вообще, если концентрация солевого буфера достаточно
высока, то сначала лучше промыть колонку смесью аце-
тонитрил – вода 1:9 в воде для удаления соли. И только
затем применять промывочную смесь с высоким содержа-
нием ацетонитрила.
И не забудьте, что после промывки колонку необходимо
заново откондиционировать.
Одним словом, на эти промывки, по-моему, тратят слиш-
ком большое количество рабочего времени. . .
– А можно как-то сократить время, затрачиваемое
на промывки?
– Если колонка используется непрерывно, то ее нецеле-
сообразно промывать. Жидкостную систему прибора
промывать от солей в конце дня надо, а колонку —
совершенно необязательно. Ее же потом нужно опять
кондиционировать, а это опять время.
– Но промывки продлевают срок жизни колонки!
– Недоказанное утверждение. Смотря в каких услови-
ях. При экстремальных рН подвижной фазы — ско-
рее всего да, несколько продляют. Но тут уже надо
смотреть, какая цель стоит — нормально работать или
в ущерб нормальной работе беречь колонку.
Вот если колонку оставляют без работы на продолжитель-
ное время (хотя бы на выходные), то обращенно-фазовую
колонку можно промыть. Раз в неделю. Но не в случае ион-
парных разделений, разумеется.
– На многих предприятиях начальная и конечная про-
мывка колонок (start wash, end wash) является обя-
зательной процедурой. Выходит, что это неверно?
– Если такую процедуру предписано проводить каждый
день для колонок всех применяемых типов и без уче-
та агрессивности применяемых подвижных фаз, то,
безусловно, это неразумно. Бездумный подход здесь
крайне нежелателен.
Но промывать колонки можно, если это обращенно-фа-
зовые колонки на силикагельной основе с неполярной при-
вивкой типа С8 или С18, а также неполярным энд-кеппин-
гом. Для таких колонок правильная промывка безопасна,
а их повторное кондиционирование не занимает много вре-
мени.
– Какие предосторожности необходимо соблюдать при
промывке колонок?
– Вы будете смеяться над главной рекомендацией.
– Это уже интересно.
– Надо быть сытым и заниматься этим в спокойной об-
становке. То есть в идеале — после обеда.
Большая часть колонок была убита мной в голодном и нерв-
ном состоянии, когда все валится из рук. В таком состоя-
нии очень просто перепутать банки с растворителем или
подвижной фазой. Особенно если работа ведется очень быстро.
– Ценный совет. А чего не следует делать в частно-
сти?
– Не следует промывать колонку теми растворителя-
ми, с которыми она несовместима. Любые обращенно-
фазовые колонки — и на основе силикагеля, и поли-
мерные — несовместимы с любыми углеводородными
и хлорорганическими растворителями. Самые непо-
лярные подвижные фазы для обращенно-фазовых ко-
лонок — это смеси ацетонитрил –ТГФ 1:1, ацетонит-
рил – дихлорметан 80:20. Несколько более устойчивы
к неполярным растворителям С8 и С30 фазы, на них
можно работать на подвижных фазах с более высоким
содержанием ТГФ, но это уже экзотика.
И еще очень важный совет для тех, кто любит промы-
вать обращенно-фазовые колонки чистым изопропанолом.
Делайте это только путем промежуточного перехода на чи-
стый ацетонитрил. То есть не следует промывать колонку
сразу чистым изопропанолом, если она заполнена смесью
растворителей с долей воды, а тем более — чистой водой.
Это может привести к дестабилизации упаковки адсорбен-
та и уменьшению ее эффективности. Сначала вымойте из
колонки соли (например, смесью ацетонитрил – вода 9:1),
затем заполните ее чистым ацетонитрилом — и лишь затем
аккуратно чистым изопропанолом. После промывки изо-
пропанолом первым делом опять перезаполните колонку
ацетонитрилом.
– В чем следует хранить обращенно-фазовые колонки?
– В принципе, их можно хранить в той же смеси аце-
тонитрил – вода 1:9, которая применяется для ее про-
мывки. Но для длительного хранения лучше приме-
нять смесь ацетонитрил – вода 1:1.
Есть еще один способ консервации обращенно-фазовых ко-
лонок — в изопропаноле. Для полимерных обращенных фаз
этот способ лучше не применять, т. е. использовать его толь-
ко для фаз на основе силикагеля. В этом случае колон-
ка промывается последовательно смесью ацетонитрил – во-
да 1:9 и ацетонитрилом, и лишь заполненную ацетонитри-
лом колонку аккуратно перезаполняют изопропанолом на
небольшой объемной скорости.
– От чего обращенно-фазовые колонки выходят
из строя?
– От того же, что и все ВЭЖХ колонки. Напомню, что в
общем случае колонки выходят из строя по трем при-
чинам: неправильной эксплуатации пользователем, на-
личия скрытых дефектов в упаковке колонки, а так-
же по естественным причинам, т. е. в результате по-
степенного износа.
Среди причин неправильной эксплуатации обращенно-
фазовых колонок лидирует засорение фрита (входного филь-
тра) колонки. Засорение происходит либо механическими
загрязнениями, присутствующими в пробе, либо при вы-
падении в осадок на фрите неполярных компонентов мат-
рицы образца, нерастворимых в применяемой подвижной
фазе.
– Что можно сделать в этом случае?
– Кроме очевидной рекомендации готовить хорошие
пробы для ВЭЖХ?
– Да.
– Достаточно установить перед колонкой ин-лайн фильтр
или предколонку. Засорится картридж ин-лайн филь-
тра или фрит предколонки, но фрит самой колонки
останется в порядке. И колонка также останется цела.
– А номер два по популярности?
– Обращенно-фазовую колонку можно убить вводом про-
бы, которая содержит сильно гидрофобные соедине-
ния в значительных количествах: тяжелые углеводо-
роды, жиры (экстракты минеральных масел, продук-
тов питания), а также белки (неочищенные биологи-
ческие пробы). Еще один способ — пропустить через
колонку зацветший водный буфер, в котором полно
водорослей.
Во всех таких случаях колонку бывает очень тяжело
регенерировать, почти невозможно.
Полимерные обращенно-фазовые колонки часто убива-
ют по неосторожности, работая на давлении, которое зна-
чительно превышает предельные для них 150 бар. Либо не
знают об этом пределе, либо забывают.
– А как же такие факторы, как экстремальные рН,
температура?
На полимерные колонки они никак не воздействуют.
Разумный предел в 50–60 градусов для колонок на осно-
ве силикагеля, как правило, тоже соблюдают. Качествен-
ные силикагельные обращенные фазы достаточно устой-
чивы в области кислого рН вплоть до 2, а при аккуратной
работе — даже вплоть до рН 1.
В щелочной среде силикагельные колонки быстро раз-
рушаются. Существуют обращенные силикагельные фазы
с полимерным энд-кеппингом (когда вместо триметилхлор-
силана применяют полимеризующийся диметилдихлорси-
лан), которые более-менее устойчивы в щелочной среде, но
я бы в любом случае не рекомендовал бы работать на них
при рН более 8–9.