eng
Содержание
Содержание
Предисловие автора .................................................................................. 11
Предисловие научного редактора .............................................................. 13
Отзывы ..................................................................................................... 14
Глава 1. Что такое хроматография? ......................................................... 19
1.1.
Физико химический анализ. Адсорбция. Твердофазная
экстракция и хроматография. Проведение
хроматографического определения ............................................ 19
1.2.
Жидкостная хроматография низкого и высокого давления.
Схема жидкостного хроматографа высокого давления ............. 24
1.3.
Как улучшить разделение? .......................................................... 28
1.3.1.
Удерживание. Разрешение .................................................. 29
1.3.2.
Селективность – параметр, отражающий
физико химические взаимодействия
в хроматографической системе ........................................... 31
1.3.3.
Эффективность хроматографической колонки.
Пиковая плотность. Асимметрия пика ............................... 33
1.3.4.
Связь разрешения с селективностью, эффективностью
и фактором удерживания (основная формула
хроматографии) ................................................................... 35
Глава 2. Начинаем работать на жидкостном хроматографе ................... 38
2.1.
Как управлять временем удерживания? ..................................... 39
2.1.1.
Полярность. Полярные и неполярные
растворители и адсорбенты................................................. 39
2.1.2.
Как происходит удерживание. Что значит
«нормальная фаза» и «обращенная фаза»?
Элюирующая сила растворителя. Применение
для элюирования смесей растворителей
различной полярности. Компоненты элюента:
основа, добавка и модификатор ......................................... 42
2.1.3.
Зависимость удерживания от состава элюента.
Уравнение Скотта ................................................................ 48
2.1.4.
Удерживание ионных соединений на обращенной фазе.
Модификатор в обращенно фазовых системах.
Универсальные ОФ системы. Примеры
универсальных систем......................................................... 50
2.2.
Принципы работы основных узлов хроматографа ..................... 56
2.2.1.
Насос плунжерного типа. Изократическое
и градиентное элюирование. Градиентные системы
смешивания при высоком и низком давлении .................. 56
2.2.2.
Инжектор ............................................................................. 616 Содержание
2.2.3.
Фотометрический и флуориметрический детекторы.
Поглощение УФ излучения растворителями.
Другие детекторы для ВЭЖХ .............................................. 62
2.2.4.
Соединение блоков в единую жидкостную систему .......... 69
2.3.
Общие рекомендации к проведению хроматографического
анализа. Рабочее место. Приготовление элюента.
Заполнение насосной системы элюентом. Замена одного
элюента на другой, смешивающийся или несмешивающийся
с предыдущим. Фильтрация пробы. Применение ин лайн
фильтров и предколонок. Промывка узлов хроматографа ........ 70
2.4.
Изократическое и градиентное элюирование. Применение
рецикла элюента при изократическом элюировании.
Техника градиентного элюирования, «вогнутые» и «выпуклые»
профили градиента. Общие рекомендации
к проведению градиентного элюирования ................................. 73
2.5.
Выбор растворителя для приготовления пробы ......................... 81
Глава 3. Обработка хроматографических данных ................................... 84
3.1.
Базовая линия. Высокочастотные и низкочастотные шумы.
Сжатие и сглаживание хроматограммы. Отношение
сигнал/шум. Предел детектирования (LOD) и предел
определения (LLOQ). Дрейф базовой линии ............................. 84
3.2.
Разметка хроматограммы ............................................................ 89
3.3.
Основы качественного анализа. Способы идентификации
соединений. Арбитражный метод. Ложноположительный
и ложноотрицательный результаты идентификации ................. 92
3.4.
Основы количественного анализа ............................................. 102
3.4.1.
Градуировка. Метод внешнего стандарта.
Метод внутреннего стандарта, его преимущества
и ограничения ..................................................................... 102
3.4.2.
Погрешность измерения. Случайная и систематическая
погрешности. Термины по ГОСТ ИСО 5725: точность
(accuracy), правильность (trueness), прецизионность
(precision), повторяемость (repeatability),
воспроизводимость (reproducibility). Вычисление
доверительного интервала. Источники случайной
погрешности. Вклад влияния шума детектора в общую
погрешность измерения. Источники систематической
погрешности. Что такое «неопределенность
измерения»? ........................................................................ 107
3.4.3.
Одноточечная градуировка ................................................ 111
3.4.4.
Многоточечная градуировка.
Применение линейной и нелинейной регрессии;
критерии приемлемости аппроксимации ......................... 114
3.4.5.
Полуколичественные измерения ....................................... 1188 Содержание
3.4.6.
Контроль коэффициентов извлечения при помощи
метода внутреннего стандарта. Применение стандартов
суррогатов (surrogate standard) и стандартов выхода
(recovery standard) ............................................................... 119
3.4.7.
Валидация хроматографических методик ......................... 121
Глава 4. Оптимизация хроматографического определения .................. 123
4.1.
Основы теории процесса разделения в ВЭЖХ.......................... 123
4.1.1.
Теория скоростей и уравнение Ван Деемтера. Кинетика
массопередачи в хроматографической системе.
Зависимость Энделя и Халаша .......................................... 123
4.1.2.
Уравнение Дарси ................................................................ 127
4.2.
Регулирование основных параметров хроматографического
анализа ........................................................................................ 128
4.2.1.
Способы увеличения эффективности разделения ............ 128
4.2.2.
Способы сокращения времени анализа ............................ 132
4.2.3.
Способы повышения чувствительности анализа
(уменьшения предела определения целевых
соединений) ........................................................................ 134
4.3.
Алгоритмы оптимизации хроматографического разделения ... 137
Глава 5. Виды жидкостной хроматографии. Управление
селективностью разделения. Неподвижные фазы для ВЭЖХ.............. 142
5.1.
Неподвижные фазы (НФ) для жидкостной хроматографии ........ 142
5.1.1.
Архитектура (физическая структура) современных
неподвижных фаз (НФ) для жидкостной
хроматографии ................................................................... 142
5.1.2.
Особенности строения современных
обращенно фазовых НФ на основе силикагеля. Способы
улучшения химической инертности, гидролитической
стабильности, устойчивости к фазовому коллапсу.
Высокий и низкий ценовые сегменты для обращенных фаз.
Тестирование неподвижных фаз, тестовые смеси
для обращенно фазовых НФ. Крэш тесты ....................... 144
5.1.3.
Перспективные направления синтеза новых НФ.
Фазы, устойчивые в широком диапазоне рН.
Фазы с ограниченно доступной поверхностью.
Фазы для высокотемпературной хроматографии ............. 151
5.2.
Обращенно фазовая хроматография (ОФ ВЭЖХ),
ее преимущества и закономерности. Модель удерживания
в ОФ ВЭЖХ ................................................................................ 153
5.3.
Нормально фазовая хроматография (НФ ВЭЖХ)
и ее основные закономерности. «Диполь полевая» модель
удерживания в НФ ВЭЖХ. Неподвижные фазы
для НФ ВЭЖХ ............................................................................ 160
5.4.
Гидрофильная хроматография (HILIC). ДИРФ режим ............ 17110 Содержание
5.5.
Ионная хроматография .............................................................. 176
5.6.
Хроматография с переносом заряда .......................................... 180
5.7.
Эксклюзионная хроматография ................................................ 185
5.8.
Ион парные режимы хроматографии. Мицеллярная
хроматография ............................................................................ 192
Приложение A. Метод жидкостной хроматографии
как объект исследования ........................................................................ 198
A.1. Вводный курс лекций по общей химии .................................... 198
А.1.1. Модель как способ познания мира ................................... 198
А.1.2. Модель химии как науки ...................................................200
А.1.3. Понятие о веществе. Силы, приводящие
к образованию макротел ...................................................202
А.2. Физико химические взаимодействия
в хроматографической системе ..................................................205
А.2.1. Дипольные взаимодействия ..............................................208
A.2.2. Водородная связь ............................................................... 210
A.2.3. Модель выталкивания из структурированной среды .......... 213
A.2.4. Ионные взаимодействия ................................................... 213
A.2.5. Дисперсионные взаимодействия ...................................... 214
A.2.6. Взаимодействия с переносом заряда
(π взаимодействия) ............................................................ 215
А.2.7. Координационные взаимодействия ................................. 216
А.3. Типы удерживания в жидкостной хроматографии ................... 216
А.3.1. Логическая связь между типом удерживания
и видом хроматографии .................................................... 219
А.3.2. Расчет количественных характеристик
типов удерживания (дескрипторов удерживания)
при помощи метода факторного анализа .........................222
Приложение Б. Хиральная высокоэффективная
жидкостная хроматография ...................................................................226
Б.1. Основные типы хиральных неподвижных фаз .........................226
Б.2. Закономерности хиральной ВЭЖХ........................................... 231
Приложение В. Список международных сокращений,
принятых в хроматографии ....................................................................238
Высокоэффективная жидкостная хроматография
и масс спектрометрия компании Waters ...................................................243
Возможности хромато масс спектрометрометров
корпорации Termo Fisher Scientific ...........................................................248
LaChrom Elite – решение Hitachi High Technologies
для высокоэффективной жидкостной хроматографии .............................262
Жидкостные хроматографы «Стайер»: этапы создания
и современный взгляд ...............................................................................267
ГЛАВА 1
ЧТО ТАКОЕ ХРОМАТОГРАФИЯ?
Это первая глава книги, которая доступно отвечает на вопросы «Что такое физикохимический анализ?» и «Что такое хроматография?»
Сложные термины я старался вводить постепенно, по ходу текста, каждый раз комментируя их значение. Отмечу, что не только все термины, но
и просто слова из специфического лексикона при первом их появлении в
тексте выделялись курсивом. Так, выделения удостоились не только су
ществительное «адсорбция» (это термин), но и глагол «переносить». Это
потому, что вещество в стакан не засыпается, насыпается или кладется, а
«навеска вещества переносится в стакан». И привыкать к этому лучше
сразу – переучиваться сложнее. Некоторые важные термины будут сразу
даваться на русском и английском языках.
1.1. Физико химический анализ. Адсорбция.
Твердофазная экстракция и хроматография.
Проведение хроматографического
определения
Начнем с «физико химического анализа». Ключевое слово здесь – «анализ», что в переводе с греческого обозначает «разделение». Другими словами, анализ проводится с целью чтото разобрать и выяснить, что из чего
состоит. Нас интересует конкретно анализ вещества, причем вещество
может быть каким угодно. К примеру, сладким чаем. Здесь сладкий чай –
это объект анализа.
Вот, допустим, на столе стоит стакан с жидкостью (я знаю, что там налито, но вам пока не скажу). На стакане написано «№ 043». Это образец
номер 043, или проба номер 043 (на английском оба термина обозначаются словом sample). Посмотрим на жидкость. Она коричневая (это свойство «заварки»). На запах – пахнет чаем (свойство «заварки»). Возьмем
стакан и немного взболтаем жидкость. По плотности и вязкости можно
предположить, что основа жидкости – вода. Попробуем жидкость на вкус
и окончательно убедимся, что основа жидкости – действительно вода.
Также мы почувствуем, что жидкость сладкая (свойство сахара) и имеет
вкус чая (свойство «заварки»). Вывод: в стакан налит сладкий чай.
Только что мы провели простейший анализ вещества, а именно: образца объекта «сладкий чай» с номером 043. В результате анализа мы поняли, что оно собой представляет, то есть мы идентифицировали объект.
Это удалось сделать благодаря тому, что мы изучали его физические и химические свойства. Поэтому этот анализ с полным правом можно назвать
физико химическим. По отдельным свойствам мы сначала догадались,
какие именно составляющие компоненты присутствуют в жидкости. А уже
по списку составляющих компонентов догадались (сделали заключение) о
том, что есть эта жидкость.
В этом случае, однако, мы не разделяли компоненты фактически. Мы
всего лишь замечали индивидуальные свойства компонентов, наблюдая
за их смесью. Но можно все сделать иначе. К примеру, методами перегонки, экстракции и осаждения действительно разделить сладкий чай на составляющие его воду, сахар и «заварку». Это будет гораздо сложнее, но
зато надежнее и информативнее. Мы будем иметь не косвенные, а прямые доказательства своей правоты – выделенные в чистом виде компоненты, которые раньше находились в смеси.
По такому принципу, в частности, работает и хроматографический
метод. В этом физико-химическом методе вещество также разделяется на
составляющие компоненты, но не за счет перегонки, экстракции или
осаждения. Хроматография основана на явлении распределения вещества
между двумя несмешивающимися фазами. В том случае, когда одна из
фаз является твердым веществом, процесс распределения называют адсорбцией (adsorption).
Адсорбция – это процесс преимущественного концентрирования вещества твердой фазой, которую в этом случае называют адсорбентом
(adsorbent). Разные химические вещества концентрируются адсорбентами в разной степени, что и положено в основу их разделения.
Для иллюстрации адсорбции можно провести очень простой опыт. Для
этого всего лишь нужно пропустить крепкий сладкий чай через любой
бытовой фильтр для очистки воды со свежей кассетой. Раствор, прошед
ший через фильтр, (фильтрат), будет почти бесцветным, но не менее сладким, чем исходный чай. Все дело в том, что кассета бытового фильтра заполнена смесью двух адсорбентов: активированного угля и ионообменного
пористого полимера. Они достаточно эффективно адсорбируют из воды
пигменты (красители) чая, а вот удалить из воды сахар им не по силам.
Так что условно можно считать, что нам удалось адсорбционно разделить
сладкий чай на сладкую воду и «заварку».
Только что мы провели типичный эксперимент по твердофазной экстракции (solidphase extraction), или сокращенно ТФЭ (SPE). Как правило, ТФЭ
применяется не для анализа непосредственно, а для предварительной очиcтки
(sample clean up) или концентрирования компонентов образца перед анализом, то есть для подготовки пробы (sample preparation). Кассета с адсорбентом в случае ТФЭ называется адсорбционным картриджем (cartridge).
Но, разумеется, разделить все компоненты смеси таким образом
нельзя, поскольку на картридж постоянно подается раствор со смесью
веществ. Провести полное разделение становится возможным, если через слой адсорбента с нанесенной смесью веществ пропускать чистый
растворитель. Такой вариант адсорбционного разделения представляет
собой один из подвидов хроматографии (chromatography). В хроматографии кассету с адсорбентом принято называть хроматографической колон
кой (column), а наполняющий ее адсорбент (packing) неподвижной фазой
(stationary phase). Чистый растворитель или смесь растворителей, которые пропускаются через колонку, называют элюентом или подвижной фазой (mobile phase). Сам процесс пропускания элюента через хроматографическую колонку называется элюированием (elution).
Чтобы все стало понятно, предлагаю провести небольшой мысленный
эксперимент по хроматографическому разделению. К примеру, нам надо
полностью разделить смесь трех красителей: зеленого, синего и красного. Разумеется, смесь этих красителей – черного цвета. Пусть у нас будут
в распоряжении хроматографическая колонка из стекла (чтобы было можно наблюдать за разделением) с подходящим адсорбентом и подходящая
смесь растворителей, то есть элюент.
Аккуратно нанесем часть образца (пробу) в верхнюю часть хроматографической колонки и начнем пропускать через колонку приготовленный элюент (см. рис. 1.1). Если адсорбент не очень мелкий, с зернением
не менее 100 микрометров (100 мкм = 0,1 мм), то элюент будет проходить
через слой адсорбента просто под собственной тяжестью. Таким образом,
мы пока избежим необходимости насосной системы (pump).
Мы будем наблюдать как за колонкой, так и за вытекающим из хроматографической колонки фильтратом, который называется элюатом. Причем попытаемся сделать наше наблюдение если не количественным, то
хотя бы полуколичественным. Используя зрение как детектор (detector),
мы будем строить график насыщенности цвета капель элюата от времени
с момента начала анализа.
Итак, анализ начинается в момент подачи элюента (рис. 1.1а). Через
некоторое время t1 (рис. 1.1б) мы наблюдаем следующую картину: проба
разделилась в колонке на три хроматографических зоны – зеленую, си
нюю и красную – по числу компонентов в образце. Это значит, что смесь
красителей разделилась полностью. Ближе к началу колонки (то есть в ее
верхней части) находится зона зеленого красителя, в середине – зона синего красителя и уже в самом конце колонки – зона красного красителя.
Такая картина наблюдается потому, что зеленый краситель адсорбируется сильнее всего (говорят, что он сильнее всего удерживается адсорбен
том), в результате чего его хроматографическая зона передвигается вдоль
колонки с наименьшей скоростью. Красный же краситель слабо удержи
вается адсорбентом, поэтому он выходит из колонки (элюируется) первым.
Факт элюирования красного красителя с колонки следует надлежащим
образом зафиксировать на графике. Сначала мы увидим, что цвет первых
капель очень слабый. Он будет нарастать, и в какой-то момент насыщен
ность цвета будет максимальной. Затем цвет капель опять пойдет на убыль.
В результате, сигнал от красного компонента образца на графике будет
иметь форму колокола. Такой сигнал называется пиком (peak). Время, со
ответствующее максимуму пика красного красителя, будет называться
временем удерживания (retention time) красного красителя.
Рис. 1.1. Хроматографическое разделение смеси трех красителей
а) б) в)
t0 t1 t2
К некоторому моменту времени t2 (см. рис. 1.1в) красный и синий краси
тели уже вышли из колонки, а зеленый только начинает выходить. На гра
фике, соответственно, видны два пика – и третий только начинает прописы
ваться. График с пиками называется хроматограммой (chromatogram). Хро
матограмма является основным результатом хроматографического анализа.
Как показывает практика, в большинстве случаев совсем необязатель
но разделять все компоненты сложной смеси, число которых может дости
гать сотен и тысяч. Достаточно выделить из исследуемого вещества лишь
интересующие нас компоненты. Такие компоненты называют аналитами
(analyts), или целевыми соединениями, а сам анализ конкретных компонен
тов – определением. Допустим, в приведенном выше примере нас интересо
вало определение только зеленого красителя. Тогда было бы совершенно
неважно, отделился ли красный краситель от синего – главное, чтобы пик
зеленого красителя хорошо отделился от всех остальных. Таким образом,
все компоненты, которые элюируются рядом с целевыми соединениями
и могут помешать правильному определению, называются мешающими
соединениями (contaminants). Если в образце присутствует множество ме
шающих соединений, то либо от них надо избавляться на стадии очистки
пробы, либо подбирать такие условия разделения и детектирования, чтобы
гарантировать правильность выполнения определения.
Определение может быть качественным и количественным. Результа
ты качественного определения (identification) отвечают на вопрос: «Есть ли
целевое соединение в образце или нет?» (на нижнем пределе детектиро
вания для данного метода анализа). Для хроматографии этот вопрос мож
но перефразировать так: «Есть ли пик целевого соединения на хроматог
рамме или нет?»
Результаты количественного определения (quantification) отвечают на
вопрос: «Какое количество целевого соединения находится в данном ко
личестве образца?» (другими словами: «Какова концентрация целевого со
единения в образце?»). В хроматографии концентрация вещества в пробе
тем больше, чем больше площадь, ограниченная пиком этого вещества
на хроматограмме. Другими словами, концентрация вещества в пробе про
порциональна площади пика (peak area) этого вещества.
Вообще, время удерживания и площадь пика являются одними из ос
новных параметров пика. По времени удерживания соединения в выбран
ных условиях проводят идентификацию этого соединения, то есть каче
ственный анализ. Когда соединение идентифицировано, знание площади
пика необходимо уже для количественного анализа.
Кроме того, в зависимости от типа применяемого детектора у пика
могут быть индивидуальные спектральные характеристики, которые значительно облегчают идентификацию соединений и делают ее значитель
но более надежной. Опять обратимся к примеру с разделением трех кра
сителей. Допустим, необходимо доказать отсутствие в пробе токсичного
красного красителя амаранта, который в выбранных условиях должен элю
ироваться в начале хроматограммы. Мы видим, что на хроматограмме дей
ствительно есть пик красного красителя, причем время удерживания очень
похоже на ожидаемое для амаранта. Однако всегда есть вероятность, что
это пик не амаранта, а другого, неизвестного красного красителя (а их
существуют десятки) с практически совпадающим временем удержива
ния. Выйти из затруднения можно, применяя в качестве детектора не зре
ние, а фотометр – прибор, позволяющий измерить для соединения его
спектр поглощения, к примеру, в видимой области. Сравнив известный
спектр амаранта и полученный спектр неизвестного красного красителя,
можно выяснить, действительно ли последний является амарантом или нет.
Все параметры пика: время удерживания, спектральные характерис
тики, площадь пика – неразрывно связаны с условиями, в которых полу
чена хроматограмма. Их можно формально разделить на условия разде
ления и условия детектирования. Все условия разделения в совокупности:
тип адсорбента, габариты хроматографической колонки, состав элюента,
скорость подачи элюента (flow rate), температура – называются хроматог
рафическими параметрами разделения.
1.2. Жидкостная хроматография
низкого и высокого давления.
Схема жидкостного хроматографа
высокого давления
Все приведенные до сих пор примеры касались жидкостной хроматографии
(liquid chromatography, LC), где подвижной фазой является жидкость. Исто
рически все основные закономерности хроматографии были исследованы
именно на примере жидкостной хроматографии. Эту работу провел россий
ский ученый Михаил Семенович Цвет в начале двадцатого века. Однако, се
рьезное развитие хроматографических методов последовало лишь в середи
не прошлого века благодаря работам американских и английских ученых в
области газовой хроматографии (gas chomatography, GC). Подвижной фазой в
газовой хроматографии служит инертный газ: азот, гелий или водород.
Первые установки для проведения экспериментов по жидкостной хроматографии были очень простыми. Фактически, они состояли из одной хро
матографической колонки. Поскольку в то время были доступны только ад
сорбенты с достаточно крупными частицами, элюент мог свободно проходить
через слой адсорбента под собственной тяжестью. Таким образом, необхо
1.2. Жидкостная хроматография низкого и высокого давления.
димость использования насоса для подачи элюента под значительным дав
лением отсутствовала. Поскольку первые эксперименты по разделению про
водились на образцах смесей натуральных пигментов (красителей), видимых
глазом, то в этом случае можно было обойтись без детектора.
Описанные устройства относятся к хроматографическим системам низ
кого давления (low pressure liquid chromatography, LPLC). Разумеется, со
временные специализированные системы жидкостной хроматографии под
низким давлением могут представлять собой сложные и дорогостоящие
приборы. Но их объединяет использование адсорбентов с достаточно
крупными частицами, в результате чего давление в таких системах не пре
вышает нескольких атмосфер.
Техника проведения эксперимента по разделению при низком давле
нии достаточно проста. Можно сказать, что она уже была частично опи
сана в предыдущей главе.
Сначала берут специальную стеклянную трубку (вообще говоря, она
называется колонкой, как ни странно) длиной около 20 см и диаметром
1–2 см с пористым стеклянным фильтром на дне и сужающимся горлыш
ком (см. рис. 1.2а). Закрепляют ее на штативе в вертикальном положе
нии. Аккуратно переносят в колонку 5–8 см адсорбционного материала –
пористого порошка с зернением (средним диаметром частиц) порядка
100 микрометров, то есть 0,1 мм. Колонка готова.
Обычно на такую колонку пробу не наносят в жидком состоянии – поступают несколько иначе. Жидкую пробу смешивают с адсорбентом и с ми
нимальным нагреванием отгоняют растворитель. Высушенный адсорбент
с нанесенной пробой переносят в колонку и тонким слоем (0,1–0,5 см) рас
пределяют поверх слоя адсорбента. Смешиванием растворителей готовят
необходимый объем элюента. И, наконец, проводят элюирование, время
от времени добавляя элюент через верхнюю открытую часть колонки.
Фракции элюата отбирают в пронумерованные градуированные стакан
чики или колбы. Хроматограмму можно построить, измеряя какое-либо
свойство каждой из фракций: поглощение света в видимом или ультра
фиолетовом (УФ) диапазоне, показатель преломления света, электропро
водность (если разделяется смесь ионных соединений), активность (если
разделяется смесь ферментов), радиоактивность (если разделяются ме
ченные радиоактивными изотопами соединения) и т.д. Все перечисленные методы относятся к методам детектирования. Величина измеряемо
го свойства откладывается по оси у, номер фракции – по оси х.
Системы низкого давления позволяют работать с большими объема
ми адсорбента, что является необходимым условием для хроматографи
ческого выделения больших количеств целевых веществ высокой чистоты.
Хроматография, целью которой является не анализ, а выделение чистых
веществ из содержащих их субстанций, называется препаративной хроматографией (preparative chromatography). Колонки для промышленных уста
новок препаративной хроматографии могут достигать 0,5–3 м (!) в диамет
ре и длины в несколько метров.
Но для целей аналитической химии хроматография низкого давления
непригодна. У нее есть существенный недостаток: сравнительно низкая
разрешающая способность. Это значит, что хроматографические зоны
компонентов получаются очень широкими, и для полного разделения ком
понентов требуется очень большое различие во времени удерживания. Что
на практике, вообще говоря, встречается совсем нечасто. Пример раз
деления, типичного для хроматографии низкого давления, приведен на
рис. 1.2в. Очевидно, что в этом варианте сложно достичь очень хорошего
разделения. Кроме того, для элюирования компонентов требуется доволь
но значительное время.
Рис. 1.2. Колонки для хроматографии низкого и высокого давления, а так
же вид типичных хроматограмм, получаемых на подобных уста
новках: а – колонка для разделения при низком давлении, б –
колонка для разделения при высоком давлении, в – типичная хро
матограмма разделения трехкомпонентной смеси при низком дав
лении, г – типичная хроматограмма разделения трехкомпонент
ной смеси при высоком давлении
а) б)
в)
г)
5 фракция 15 фракция
(25 мин) (75 мин)
1 мин 3 мин
1.3. Как улучшить разделение? 27
Причина невысокой разрешающей способности – применение адсорбентов с крупными частицами. Для того, чтобы жидкостная хроматогра
фия могла выполнять задачи аналитической химии, необходимо уменьшить
средний диаметр частиц адсорбента по крайней мере до 10 микрометров,
то есть до 0,01 мм. Подобные адсорбционные материалы стали широко доступны только в начале 70 х годов прошлого века. Переход на новые мел
козернистые адсорбенты повлек за собой революционные изменения в тех
нике для проведения разделений методом жидкостной хроматографии.
Для того, чтобы жидкость (элюент) могла пройти через трубку длиной
15–25 см, плотно упакованную мелким порошком со средним размером
частиц 3–5 микрометров (то есть колонку для аналитической хроматогра
фии), необходимо создать значительное давление порядка 100–200 атмосфер. Создать такое давление можно лишь при помощи специального и притом достаточно дорогостоящего насоса высокого давления. Жидкостная
хроматография высокого давления получила название высокоэффективная
жидкостная хроматография, ВЭЖХ (high performance liquid chromatography,
HPLC). ВЭЖХ широко применяется как один из наиболее универсаль
ных методов физико химического анализа вещества.
Колонка для ВЭЖХ, заполненная определенным адсорбентом, явля
ется, по сути, промышленно выпускаемым изделием. Она представляет
собой стальную (как правило) трубку длиной от 5 до 25 см и внутренним
диаметром от 2 до 4,6 мм, которая заполнена адсорбентом определен
ной марки. Колонка симметрична; с каждой стороны на нее устанави
ливают пористый фильтр из губчатого титана и съемную (как правило)
уплотнительную гайку. Циркулирующая жидкость подводится к колонке
и отводится от нее по пластиковым капиллярам, которые закрепляются
на концах колонки при помощи специальных уплотнительных винтов –
фитингов (см. рис. 1.2б). Типичная для ВЭЖХ хроматограмма приведена
на рис. 1.2г. На современных аналитических колонках для жидкостной
хроматографии можно полностью разделить до двух-трех десятков ком
понентов за 10–15 мин.
Но за все хорошее, как известно, надо платить: для проведения опре
делений методом ВЭЖХ одной колонки уже недостаточно – здесь требу
ется целый прибор, который называется жидкостным хроматографом
(liquid chromatograph). Схема самого простого варианта жидкостного
хроматографа приведена на рис. 1.3. Как мы уже выяснили, для ВЭЖХ
нужен насос высокого давления. Кроме того, для ввода (инжектирова
ния) пробы под давлением также необходимо специальное устройство, ко
торое называется инжектором (injector). Наконец, аналитический при
бор не может обойтись без высокочувствительного детектора (detector).
28 Глава 1. Что такое хроматография?
Задача детектора состоит в том, чтобы «замечать» самые различные веще
ства, выходящие из хроматографической колонки, даже в наинизшей кон
центрации, и количественно отображать сигналы от компонентов разде
ленной смеси на хроматограмме.
1.3. Как улучшить разделение?
Возможности хроматографии как метода анализа вещества очень сильно
зависят от ее способности обеспечивать как можно лучшее разделение
сложных смесей на индивидуальные компоненты. От этого зависит пра
вильность анализа или даже вообще возможность проведения определе
ния. И, разумеется, совсем немаловажно время анализа – никому не ну
жен метод, требующий часы на простейшее определение. Одним словом,
каждый хроматографист мечтает (но только в рабочее время) как бы раз
делить свои образцы получше и поскорее. Процесс улучшения методик
разделения называется оптимизацией разделения. В этой главе мы нач
нем обсуждение вопросов оптимизации. Заодно пополним лексикон не
достающими терминами. Двигаться будем постепенно, так что советую
запастись терпением.
Подведем некоторые итоги предыдущих двух разделов. Итак, графичес
ким представлением результата разделения является хроматограмма – за
висимость сигнала детектора от времени элюирования. Хроматограмма
начинается в момент ввода пробы и может быть остановлена, в принци
пе, в любой момент.
Каждое вещество, регистрируемое детектором, отображается на хро
матограмме в виде пика – зависимости концентрации этого вещества в
элюате от времени элюирования. Площадь пика пропорциональна кон
центрации вещества в пробе; коэффициент пропорциональности зави
сит как от самого вещества, так и от типа применяемого детектора.
Рис. 1.3. Схема устройства жидкостного хроматографа: 1 – емкость для за
бора элюента, 2 – насосная система, 3 – система инжекции (вво
да пробы), 4 – хроматографическая колонка, 5 – система детек
тирования, 6 – емкость для слива элюата
Основной характеристикой вещества в данной хроматографической
системе является его удерживание в хроматографической колонке, кото
рое может быть выражено несколькими величинами.
Непосредственно из хроматограммы, по положению максимума пика
вещества, определяется его время удерживания tR. Объем удерживания
(retention volume) VR равен произведению времени удерживания на объем
ную скорость подачи подвижной фазы: VR = tR × v.
1.3.1. Удерживание. Разрешение
Теперь, если здесь все ясно, будем двигаться дальше. Представьте, что в
пробе есть вещество, которое совсем не адсорбируется, то есть совсем не
удерживается в выбранных условиях. Оно, надо сказать, не выйдет из ко
лонки сразу в момент старта анализа. Ему надо, пусть даже не задержива
ясь, пройти через колонку вместе с элюентом, на что нужно определенное
время. Это время называется нулевым (мертвым). Итак, нулевым временем
t0 называется время, затрачиваемое полностью несорбируемым веществом
на прохождение по хроматографической колонке от узла ввода пробы до
кюветы детектора. Нулевое время определяется экспериментально вводом
в колонку заведомо неудерживаемого компонента. Нулевой объем V0 при
условии пренебрежимо малого объема подводящих капилляров равен объе
му подвижной фазы внутри хроматографической колонки, то есть около
70% ее общего объема VС. Нулевой объем определяется как произведение
нулевого времени на объемную скорость подачи элюента V0 = t0 × v.
Приведенным временем удерживания t′R называется разница между вре
менем удерживания вещества и нулевым временем t′R = tR – t0 (см. рис. 1.4).
Фактором удерживания (retention factor), или, в старой номенклатуре,
фактором емкости (capacity factor), k′, называется отношение приведен
ного времени удерживания вещества к нулевому времени k′ = t′R/t0.
Зачем нужны такие сложности? Не проще было бы просто ограничить
ся одним параметром пика – временем удерживания?
Все дело в том, что время удерживания tR – это величина, которая изме
ряется в секундах (минутах, часах), и она строго привязана к габаритам хро
матографической колонки и объемной скорости подачи подвижной фазы.
Фактор емкости k′ никак он них не зависит. Эта безразмерная величина
является мерой удерживания данного вещества на данном адсорбенте при
применении данного элюента. И если для целей аналитической химии нам
будет вполне достаточно знать tR, то для сравнения разных результатов на
разных колонках мы будем пользоваться исключительно величинами k′.
Для современных аналитических колонок размера 250 × 4,6 (длиной
250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм) при скорости подачи элюента
30 Глава 1. Что такое хроматография?
1 мл/мин нулевое время составляет величину порядка t0 ≈ 2,5 мин, а опти
мальное время элюирования целевых соединений 2 < k′ < 5 изменяется от
7,5 до 15 мин.
Фактор емкости пика с точностью до постоянного для каждой хро
матографической колонки множителя равен константе адсорбции ве
щества в хроматографической системе (строго говоря, при условии
предельно низкой концентрации вещества в пробе, то есть в области
линейности изотермы адсорбции):
K = (V0/(VС – V0)) × k′,
где К – константа адсорбции вещества в хроматографической системе,
k′ – фактор емкости пика, VС – общий объем колонки, V0 – нулевой объем.
Задачей хроматографии является разделение веществ за счет разности в
их удерживании. Степень разделения двух веществ называется разрешением
Рис. 1.4. Основные параметры, непосредственно выделяемые из хроматог
раммы:
t0 – нулевое время;
tR (1) – время удерживания для первого пика;
t′R (1) – исправленное время удерживания для первого пика;
w (1) – ширина первого пика у основания;
w1/2 (2) – ширина второго пика на половине его высоты
tR (2)
tR (1)
t′R (2)
t′R (1)
t0
w1/2 (2)
w (1)
1/10 Ka = A/B
1.3. Как улучшить разделение? 31
(resolution). Непосредственно из хроматограммы разрешение двух пиков
вычисляется как отношение разницы во временах удерживания к поло
вине суммы ширин пиков на уровне базовой линии:
R = 2 × (tR (1) – tR (2))/(w (1) + w (2)).
Если вещества не разделяются, то разрешение равно нулю. При разре
шении, равном единице, перекрываются лишь порядка 2% площадей двух
пиков. Именно такая ситуация изображена на рис. 1.4. Можно считать,
что при R ≥ 1 пики разделяются «до базовой линии» (baseline separation).
Базовой линией (baseline) называется линия фонового сигнала детектора.
Базовая линия прописывается на хроматограмме, когда никакие компо
ненты не элюируются с колонки.
Термин «разрешение» нужен для того, чтобы выразить степень разделения двух пиков количественно: мы знаем, как рассчитать эту величину,
держа хроматограмму перед глазами.
Теперь можно перейти к самому главному – к вопросу, какие факторы
оказывают влияние на разрешение. Назову их сразу: это селективность,
эффективность, а также удерживание (с последним мы уже знакомы).
1.3.2. Селективность – параметр, отражающий
физико химические взаимодействия
в хроматографической системе
Величина, отражающая способность хроматографической системы к раз
делению веществ, называется селективностью (selectivity) системы по от
ношению к этим веществам. «Селективность» в переводе означает «изби
рательность».
Для двух пиков селективность можно вычислить непосредственно из
хроматограммы как отношение фактора удерживания более удерживаемого
пика к фактору удерживания менее удерживаемого: α = k′2/ k′1. При α = 1
(полное отсутствие избирательности хроматографической системы) разде
ления не происходит. Более того, его невозможно добиться применением
более качественной хроматографической колонки или любым другим спо
собом, кроме как изменить саму хроматографическую систему: подвижную
и/или неподвижную фазу. Разделение на данном адсорбенте при примене
нии данного элюента принципиально возможно, только если α > 1.
Есть такая характеристика разделения как сложность разделения –
пока я могу лишь посоветовать воспринять ее интуитивно. Так вот, слож
ность разделения очень быстро уменьшается с ростом селективности. Та
ким образом, селективность является ключевым фактором, влияющим на
разрешение. Управление селективностью – это искусство подбора опти
32 Глава 1. Что такое хроматография?
мального адсорбента и оптимального элюента для данного разделения.
Этому искусству нужно учиться.
Одним из преимуществ жидкостной хроматографии является возмож
ность улучшения селективности без замены неподвижной фазы, путем гра
мотного изменения состава подвижной фазы и соотношения ее компо
нентов. Это свойство жидкостных хроматографических систем называется
гибкостью (flexibility).
Термин «селективность» может также применяться в более общем
значении – как свойство хроматографической системы успешно справ
ляться с разделением сложного многокомпонентного объекта. Так,
хроматограмма из n пиков характеризуется 1/2n (n – 1) частными зна
чениями селективности α. Но, понимая селективность как общее свой
ство хроматографической системы, этим термином можно назвать всю
совокупность значений α.
а)
б)
в)
г)
д)
е)
Рис. 1.5. Разделения с различной и одинаковой селективностью: а, б, в –
разделение трехкомпонентной смеси в системах с различной се
лективностью: б – селективность отлична от а), но порядок элю
ирования сохраняется, в – селективность отлична от а), причем
изменяется и сам порядок элюирования; г, д, е – разделения че
тырехкомпонентной смеси в системах с одинаковой селективно
стью: д – при отличной от г) эффективности, е – при отличном от
г) удерживании
1.3. Как улучшить разделение? 33
В этом случае «селективность» подразумевает типичный для дан
ной хроматографической системы порядок элюирования компонентов. При постоянной селективности хроматограмма всегда выглядит
одинаково: пики могут быть шире или уже, анализ может занимать
разное время, но последовательность элюирования, пропорции меж
ду факторами удерживания компонентов будут также всегда оставать
ся постоянными (см. рис. 1.5г, д, е).
Селективность данной хроматографической системы является суммар
ной характеристикой физико химических взаимодействий в хроматогра
фической системе: вещества с адсорбентом, вещества с элюентом и элю
ента с адсорбентом. Для изменения селективности надо либо заменить
применяемый адсорбент, либо поменять состав элюента. Селективность
также зависит от температуры, при которой проводится разделение.
1.3.3. Эффективность хроматографической колонки.
Пиковая плотность. Асимметрия пика
Помимо других факторов, разрешение пиков зависит от того, насколько
сильно размываются хроматографические зоны веществ при продвиже
нии вдоль колонки. Чем сильнее их размывание, тем шире оказываются
пики (при условии, что их времена удерживания не изменяются), и тем
хуже они разрешаются.
Величина размывания хроматографической зоны определяется характеристикой, которая называется эффективностью. Чем выше эффек
тивность, тем уже хроматографическая зона. Эффективность целиком и
полностью является свойством хроматографической колонки и опреде
ляется: размером частиц адсорбента, качеством изготовления адсорбен
та, качеством упаковки колонки адсорбентом и т.д. На рис. 1.6а, б пока
заны хроматограммы с одинаковым удерживанием компонентов и
селективностью, но различной эффективностью (на 1.6б эффективность
ниже). Конечно же, на колонках с высокой эффективностью разреше
ние выше.
Эффективность можно вычислить по любому пику на хроматограмме:
N = 5,545 × (tR/w1/2)2,
где N – эффективность, w1/2 – ширина пика на половине высоты, мин, tR –
время удерживания, мин.
Это вычисление основано на предположении, что форма пика описы
вается кривой Гаусса, то есть кривой нормального распределения случай
ной величины.
34 Глава 1. Что такое хроматография?
Вообще говоря, эффективность – это безразмерная величина, но в хро
матографии принято приписывать ей единицу измерения с довольно экзо
тическим названием: количеством теоретических тарелок, т.т. (plate number).
Когда речь идет об аналитических применениях, любят характеризовать
колонку именно эффективностью (количеством теоретических тарелок).
Когда же речь заходит о теории хроматографии, то пользоваться предпочи
тают обратной ей величиной, которая называется высотой, эквивалентной
теоретической тарелке, ВЭТТ (height equivalent to theoretical plate, HETP, H):
H = L/N,
где H – ВЭТТ, мм, L – длина колонки, мм, N – эффективность колонки, т.т.
Хотя величина эффективности определяется только хроматографичес
кой колонкой, ее конкретное значение зависит от скорости подачи элю
ента, а также немного от температуры системы и адсорбата, по пику кото
рого проводится расчет. Поэтому тестирование колонки (определение
эффективности) проводится при общепринятой скорости подвижной
фазы (1 мл/мин для колонок с диаметром 4,6 мм) и по определенным ад
сорбатам (к примеру, по толуолу или нафталину). Зависимость эффектив
ности (точнее, ВЭТТ) от скорости подвижной фазы называется зависи
мостью Ван Деемтера; она обсуждается в гл. 4.
Эффективность хроматографической колонки в первом приближении
пропорциональна ее длине; таким образом, при оценке качества упакова)
б)
в)
Рис. 1.6. Разделение трехкомпонентной смеси с варьируемой эффективностью или асим
метрией: б – эффективность ниже, чем в случае а); в – эффективность одинакова с а), но
асимметрия пиков значительно выше
1.3. Как улучшить разделение? 35
ки колонки адсорбентом принято использовать значение удельной эффективности, то есть эффективности, отнесенной к единице длины. Для
современных высокоэффективных колонок значения удельной эффек
тивности лежат в интервале 80–230 тысяч теоретических тарелок на метр.
Выше мы описывали пик «колоколообразной», симметричной фор
мой кривой Гаусса. На практике, однако, пики бывают разными, в том
числе асимметричными. Коэффициент асимметрии Ка вычисляется как
отношение «правой» полуширины пика к «левой» на одной десятой его
высоты (см. рис. 1.4). При одинаковой эффективности асимметричные
пики разрешаются хуже (см. рис. 1.6а, в). Таким образом, асимметрич
ность пиков является нежелательным явлением, с которым хроматографисты и производители колонок активно борются.
Неудобство применения эффективности как величины для оценки разрешающей способности колонки связано с тем, что разреше
ние, как будет показано далее, пропорционально не прямо эффективности, а квадратному корню из нее. Вероятно, более удобна в этом
отношении другая величина, которая называется пиковой плотностью
(peak capacity). Она определяется как число пиков, которые могут быть
расположены на хроматограмме (до произвольно выбранного k′) друг
за другом с разрешением, равном единице. Пиковая плотность связана с эффективностью колонки:
n = 1 + 0,6 × √N × lg (1 + k′),
где n – пиковая плотность, N – эффективность, k′ – фактор удерживания последнего компонента.
1.3.4. Связь разрешения с селективностью,
эффективностью и фактором удерживания
(основная формула хроматографии)
Подведем итоги. Есть три фактора, влияющих на разрешение двух пиков:
селективность хроматографической системы, эффективность колонки и
величина удерживания данных двух веществ.
Самым важным фактором является селективность системы α. Изменить
ее не так то просто – часто для этого нужно либо заменить неподвижную
фазу (выбрать колонку с другой маркой адсорбента), либо серьезно изме
нить состав элюента (не просто изменить соотношение смешиваемых растворителей, а, например, заменить один растворитель на другой). Тем
более непросто ее не ухудшить, а улучшить, причем целенаправленно –
для этого необходимо хорошее знание хроматографических закономер36
Глава 1. Что такое хроматография?
ностей. Но дело того стоит: ведь даже небольшой рост селективности приводит к серьезному улучшению разрешения.
Вторым по значимости фактором является эффективность колонки N.
Увеличить эффективность достаточно просто – необходимо взять более
эффективную колонку – но у этого подхода есть свои ограничения, подробно обсуждаемые в разд. 4.3.
Наименее значимый эффект на разрешение оказывает величина удерживания k′. Только для наименее удерживаемых компонентов с k′ < 2 увеличение удерживания приводит к видимому улучшению разрешения. При
k′ порядка 3–5 уже можно считать, что удерживание практически никак
не сказывается на разрешении. Из этого надо сделать всего один вывод:
удерживание целевых соединений (аналитов) по возможности не должно
быть менее k′ = 2.
Эти эмпирические правила просто выражаются количественно. Формулу, связывающую разрешение R со значениями α, N и k′, иногда назы
вают основной формулой хроматографии:
R = 1/4 × (α – 1)/α × √N × k′2/(k′2 + 1),
где R – разрешение, α – селективность, N – эффективность, k′2 – фактор
удерживания второго пика.
Для каждого конкретного случая можно назвать свой наиболее оптимальный путь улучшения разделения. Если плохое разрешение – следствие
слишком слабого удерживания (см. рис. 1.7а), то удерживание следует не
много увеличить (см. рис. 1.7б). Но не слишком: разрешение останется практически неизменным, а вот время анализа сильно возрастет (см. рис. 1.7в).
Рис. 1.7. Разделение при увеличении удерживания k′
а) б)
в)
1.3. Как улучшить разделение? 37
а)
б)
Рис. 1.8. Разделение при увеличении эффективности N
Рис. 1.9. Разделение при улучшении селективности α
а)
б)
На хроматограмме, приведенной на рис. 1.8а, недостаточное разреше
ние связано, очевидно, с низкой эффективностью, поскольку и с удер
живанием, и с селективностью проблем нет. То есть, надо взять более эф
фективную колонку (см. рис. 1.8б).
Конечно же, если при хороших эффективности и удерживании на хро
матограмме все равно есть критические пары (см. рис. 1.9а), то улучшить
ситуацию можно, лишь изменив селективность (см. рис. 1.9б).
ЧТО ТАКОЕ ХРОМАТОГРАФИЯ?
Это первая глава книги, которая доступно отвечает на вопросы «Что такое физикохимический анализ?» и «Что такое хроматография?»
Сложные термины я старался вводить постепенно, по ходу текста, каждый раз комментируя их значение. Отмечу, что не только все термины, но
и просто слова из специфического лексикона при первом их появлении в
тексте выделялись курсивом. Так, выделения удостоились не только су
ществительное «адсорбция» (это термин), но и глагол «переносить». Это
потому, что вещество в стакан не засыпается, насыпается или кладется, а
«навеска вещества переносится в стакан». И привыкать к этому лучше
сразу – переучиваться сложнее. Некоторые важные термины будут сразу
даваться на русском и английском языках.
1.1. Физико химический анализ. Адсорбция.
Твердофазная экстракция и хроматография.
Проведение хроматографического
определения
Начнем с «физико химического анализа». Ключевое слово здесь – «анализ», что в переводе с греческого обозначает «разделение». Другими словами, анализ проводится с целью чтото разобрать и выяснить, что из чего
состоит. Нас интересует конкретно анализ вещества, причем вещество
может быть каким угодно. К примеру, сладким чаем. Здесь сладкий чай –
это объект анализа.
Вот, допустим, на столе стоит стакан с жидкостью (я знаю, что там налито, но вам пока не скажу). На стакане написано «№ 043». Это образец
номер 043, или проба номер 043 (на английском оба термина обозначаются словом sample). Посмотрим на жидкость. Она коричневая (это свойство «заварки»). На запах – пахнет чаем (свойство «заварки»). Возьмем
стакан и немного взболтаем жидкость. По плотности и вязкости можно
предположить, что основа жидкости – вода. Попробуем жидкость на вкус
и окончательно убедимся, что основа жидкости – действительно вода.
Также мы почувствуем, что жидкость сладкая (свойство сахара) и имеет
вкус чая (свойство «заварки»). Вывод: в стакан налит сладкий чай.
Только что мы провели простейший анализ вещества, а именно: образца объекта «сладкий чай» с номером 043. В результате анализа мы поняли, что оно собой представляет, то есть мы идентифицировали объект.
Это удалось сделать благодаря тому, что мы изучали его физические и химические свойства. Поэтому этот анализ с полным правом можно назвать
физико химическим. По отдельным свойствам мы сначала догадались,
какие именно составляющие компоненты присутствуют в жидкости. А уже
по списку составляющих компонентов догадались (сделали заключение) о
том, что есть эта жидкость.
В этом случае, однако, мы не разделяли компоненты фактически. Мы
всего лишь замечали индивидуальные свойства компонентов, наблюдая
за их смесью. Но можно все сделать иначе. К примеру, методами перегонки, экстракции и осаждения действительно разделить сладкий чай на составляющие его воду, сахар и «заварку». Это будет гораздо сложнее, но
зато надежнее и информативнее. Мы будем иметь не косвенные, а прямые доказательства своей правоты – выделенные в чистом виде компоненты, которые раньше находились в смеси.
По такому принципу, в частности, работает и хроматографический
метод. В этом физико-химическом методе вещество также разделяется на
составляющие компоненты, но не за счет перегонки, экстракции или
осаждения. Хроматография основана на явлении распределения вещества
между двумя несмешивающимися фазами. В том случае, когда одна из
фаз является твердым веществом, процесс распределения называют адсорбцией (adsorption).
Адсорбция – это процесс преимущественного концентрирования вещества твердой фазой, которую в этом случае называют адсорбентом
(adsorbent). Разные химические вещества концентрируются адсорбентами в разной степени, что и положено в основу их разделения.
Для иллюстрации адсорбции можно провести очень простой опыт. Для
этого всего лишь нужно пропустить крепкий сладкий чай через любой
бытовой фильтр для очистки воды со свежей кассетой. Раствор, прошед
ший через фильтр, (фильтрат), будет почти бесцветным, но не менее сладким, чем исходный чай. Все дело в том, что кассета бытового фильтра заполнена смесью двух адсорбентов: активированного угля и ионообменного
пористого полимера. Они достаточно эффективно адсорбируют из воды
пигменты (красители) чая, а вот удалить из воды сахар им не по силам.
Так что условно можно считать, что нам удалось адсорбционно разделить
сладкий чай на сладкую воду и «заварку».
Только что мы провели типичный эксперимент по твердофазной экстракции (solidphase extraction), или сокращенно ТФЭ (SPE). Как правило, ТФЭ
применяется не для анализа непосредственно, а для предварительной очиcтки
(sample clean up) или концентрирования компонентов образца перед анализом, то есть для подготовки пробы (sample preparation). Кассета с адсорбентом в случае ТФЭ называется адсорбционным картриджем (cartridge).
Но, разумеется, разделить все компоненты смеси таким образом
нельзя, поскольку на картридж постоянно подается раствор со смесью
веществ. Провести полное разделение становится возможным, если через слой адсорбента с нанесенной смесью веществ пропускать чистый
растворитель. Такой вариант адсорбционного разделения представляет
собой один из подвидов хроматографии (chromatography). В хроматографии кассету с адсорбентом принято называть хроматографической колон
кой (column), а наполняющий ее адсорбент (packing) неподвижной фазой
(stationary phase). Чистый растворитель или смесь растворителей, которые пропускаются через колонку, называют элюентом или подвижной фазой (mobile phase). Сам процесс пропускания элюента через хроматографическую колонку называется элюированием (elution).
Чтобы все стало понятно, предлагаю провести небольшой мысленный
эксперимент по хроматографическому разделению. К примеру, нам надо
полностью разделить смесь трех красителей: зеленого, синего и красного. Разумеется, смесь этих красителей – черного цвета. Пусть у нас будут
в распоряжении хроматографическая колонка из стекла (чтобы было можно наблюдать за разделением) с подходящим адсорбентом и подходящая
смесь растворителей, то есть элюент.
Аккуратно нанесем часть образца (пробу) в верхнюю часть хроматографической колонки и начнем пропускать через колонку приготовленный элюент (см. рис. 1.1). Если адсорбент не очень мелкий, с зернением
не менее 100 микрометров (100 мкм = 0,1 мм), то элюент будет проходить
через слой адсорбента просто под собственной тяжестью. Таким образом,
мы пока избежим необходимости насосной системы (pump).
Мы будем наблюдать как за колонкой, так и за вытекающим из хроматографической колонки фильтратом, который называется элюатом. Причем попытаемся сделать наше наблюдение если не количественным, то
хотя бы полуколичественным. Используя зрение как детектор (detector),
мы будем строить график насыщенности цвета капель элюата от времени
с момента начала анализа.
Итак, анализ начинается в момент подачи элюента (рис. 1.1а). Через
некоторое время t1 (рис. 1.1б) мы наблюдаем следующую картину: проба
разделилась в колонке на три хроматографических зоны – зеленую, си
нюю и красную – по числу компонентов в образце. Это значит, что смесь
красителей разделилась полностью. Ближе к началу колонки (то есть в ее
верхней части) находится зона зеленого красителя, в середине – зона синего красителя и уже в самом конце колонки – зона красного красителя.
Такая картина наблюдается потому, что зеленый краситель адсорбируется сильнее всего (говорят, что он сильнее всего удерживается адсорбен
том), в результате чего его хроматографическая зона передвигается вдоль
колонки с наименьшей скоростью. Красный же краситель слабо удержи
вается адсорбентом, поэтому он выходит из колонки (элюируется) первым.
Факт элюирования красного красителя с колонки следует надлежащим
образом зафиксировать на графике. Сначала мы увидим, что цвет первых
капель очень слабый. Он будет нарастать, и в какой-то момент насыщен
ность цвета будет максимальной. Затем цвет капель опять пойдет на убыль.
В результате, сигнал от красного компонента образца на графике будет
иметь форму колокола. Такой сигнал называется пиком (peak). Время, со
ответствующее максимуму пика красного красителя, будет называться
временем удерживания (retention time) красного красителя.
Рис. 1.1. Хроматографическое разделение смеси трех красителей
а) б) в)
t0 t1 t2
К некоторому моменту времени t2 (см. рис. 1.1в) красный и синий краси
тели уже вышли из колонки, а зеленый только начинает выходить. На гра
фике, соответственно, видны два пика – и третий только начинает прописы
ваться. График с пиками называется хроматограммой (chromatogram). Хро
матограмма является основным результатом хроматографического анализа.
Как показывает практика, в большинстве случаев совсем необязатель
но разделять все компоненты сложной смеси, число которых может дости
гать сотен и тысяч. Достаточно выделить из исследуемого вещества лишь
интересующие нас компоненты. Такие компоненты называют аналитами
(analyts), или целевыми соединениями, а сам анализ конкретных компонен
тов – определением. Допустим, в приведенном выше примере нас интересо
вало определение только зеленого красителя. Тогда было бы совершенно
неважно, отделился ли красный краситель от синего – главное, чтобы пик
зеленого красителя хорошо отделился от всех остальных. Таким образом,
все компоненты, которые элюируются рядом с целевыми соединениями
и могут помешать правильному определению, называются мешающими
соединениями (contaminants). Если в образце присутствует множество ме
шающих соединений, то либо от них надо избавляться на стадии очистки
пробы, либо подбирать такие условия разделения и детектирования, чтобы
гарантировать правильность выполнения определения.
Определение может быть качественным и количественным. Результа
ты качественного определения (identification) отвечают на вопрос: «Есть ли
целевое соединение в образце или нет?» (на нижнем пределе детектиро
вания для данного метода анализа). Для хроматографии этот вопрос мож
но перефразировать так: «Есть ли пик целевого соединения на хроматог
рамме или нет?»
Результаты количественного определения (quantification) отвечают на
вопрос: «Какое количество целевого соединения находится в данном ко
личестве образца?» (другими словами: «Какова концентрация целевого со
единения в образце?»). В хроматографии концентрация вещества в пробе
тем больше, чем больше площадь, ограниченная пиком этого вещества
на хроматограмме. Другими словами, концентрация вещества в пробе про
порциональна площади пика (peak area) этого вещества.
Вообще, время удерживания и площадь пика являются одними из ос
новных параметров пика. По времени удерживания соединения в выбран
ных условиях проводят идентификацию этого соединения, то есть каче
ственный анализ. Когда соединение идентифицировано, знание площади
пика необходимо уже для количественного анализа.
Кроме того, в зависимости от типа применяемого детектора у пика
могут быть индивидуальные спектральные характеристики, которые значительно облегчают идентификацию соединений и делают ее значитель
но более надежной. Опять обратимся к примеру с разделением трех кра
сителей. Допустим, необходимо доказать отсутствие в пробе токсичного
красного красителя амаранта, который в выбранных условиях должен элю
ироваться в начале хроматограммы. Мы видим, что на хроматограмме дей
ствительно есть пик красного красителя, причем время удерживания очень
похоже на ожидаемое для амаранта. Однако всегда есть вероятность, что
это пик не амаранта, а другого, неизвестного красного красителя (а их
существуют десятки) с практически совпадающим временем удержива
ния. Выйти из затруднения можно, применяя в качестве детектора не зре
ние, а фотометр – прибор, позволяющий измерить для соединения его
спектр поглощения, к примеру, в видимой области. Сравнив известный
спектр амаранта и полученный спектр неизвестного красного красителя,
можно выяснить, действительно ли последний является амарантом или нет.
Все параметры пика: время удерживания, спектральные характерис
тики, площадь пика – неразрывно связаны с условиями, в которых полу
чена хроматограмма. Их можно формально разделить на условия разде
ления и условия детектирования. Все условия разделения в совокупности:
тип адсорбента, габариты хроматографической колонки, состав элюента,
скорость подачи элюента (flow rate), температура – называются хроматог
рафическими параметрами разделения.
1.2. Жидкостная хроматография
низкого и высокого давления.
Схема жидкостного хроматографа
высокого давления
Все приведенные до сих пор примеры касались жидкостной хроматографии
(liquid chromatography, LC), где подвижной фазой является жидкость. Исто
рически все основные закономерности хроматографии были исследованы
именно на примере жидкостной хроматографии. Эту работу провел россий
ский ученый Михаил Семенович Цвет в начале двадцатого века. Однако, се
рьезное развитие хроматографических методов последовало лишь в середи
не прошлого века благодаря работам американских и английских ученых в
области газовой хроматографии (gas chomatography, GC). Подвижной фазой в
газовой хроматографии служит инертный газ: азот, гелий или водород.
Первые установки для проведения экспериментов по жидкостной хроматографии были очень простыми. Фактически, они состояли из одной хро
матографической колонки. Поскольку в то время были доступны только ад
сорбенты с достаточно крупными частицами, элюент мог свободно проходить
через слой адсорбента под собственной тяжестью. Таким образом, необхо
1.2. Жидкостная хроматография низкого и высокого давления.
димость использования насоса для подачи элюента под значительным дав
лением отсутствовала. Поскольку первые эксперименты по разделению про
водились на образцах смесей натуральных пигментов (красителей), видимых
глазом, то в этом случае можно было обойтись без детектора.
Описанные устройства относятся к хроматографическим системам низ
кого давления (low pressure liquid chromatography, LPLC). Разумеется, со
временные специализированные системы жидкостной хроматографии под
низким давлением могут представлять собой сложные и дорогостоящие
приборы. Но их объединяет использование адсорбентов с достаточно
крупными частицами, в результате чего давление в таких системах не пре
вышает нескольких атмосфер.
Техника проведения эксперимента по разделению при низком давле
нии достаточно проста. Можно сказать, что она уже была частично опи
сана в предыдущей главе.
Сначала берут специальную стеклянную трубку (вообще говоря, она
называется колонкой, как ни странно) длиной около 20 см и диаметром
1–2 см с пористым стеклянным фильтром на дне и сужающимся горлыш
ком (см. рис. 1.2а). Закрепляют ее на штативе в вертикальном положе
нии. Аккуратно переносят в колонку 5–8 см адсорбционного материала –
пористого порошка с зернением (средним диаметром частиц) порядка
100 микрометров, то есть 0,1 мм. Колонка готова.
Обычно на такую колонку пробу не наносят в жидком состоянии – поступают несколько иначе. Жидкую пробу смешивают с адсорбентом и с ми
нимальным нагреванием отгоняют растворитель. Высушенный адсорбент
с нанесенной пробой переносят в колонку и тонким слоем (0,1–0,5 см) рас
пределяют поверх слоя адсорбента. Смешиванием растворителей готовят
необходимый объем элюента. И, наконец, проводят элюирование, время
от времени добавляя элюент через верхнюю открытую часть колонки.
Фракции элюата отбирают в пронумерованные градуированные стакан
чики или колбы. Хроматограмму можно построить, измеряя какое-либо
свойство каждой из фракций: поглощение света в видимом или ультра
фиолетовом (УФ) диапазоне, показатель преломления света, электропро
водность (если разделяется смесь ионных соединений), активность (если
разделяется смесь ферментов), радиоактивность (если разделяются ме
ченные радиоактивными изотопами соединения) и т.д. Все перечисленные методы относятся к методам детектирования. Величина измеряемо
го свойства откладывается по оси у, номер фракции – по оси х.
Системы низкого давления позволяют работать с большими объема
ми адсорбента, что является необходимым условием для хроматографи
ческого выделения больших количеств целевых веществ высокой чистоты.
Хроматография, целью которой является не анализ, а выделение чистых
веществ из содержащих их субстанций, называется препаративной хроматографией (preparative chromatography). Колонки для промышленных уста
новок препаративной хроматографии могут достигать 0,5–3 м (!) в диамет
ре и длины в несколько метров.
Но для целей аналитической химии хроматография низкого давления
непригодна. У нее есть существенный недостаток: сравнительно низкая
разрешающая способность. Это значит, что хроматографические зоны
компонентов получаются очень широкими, и для полного разделения ком
понентов требуется очень большое различие во времени удерживания. Что
на практике, вообще говоря, встречается совсем нечасто. Пример раз
деления, типичного для хроматографии низкого давления, приведен на
рис. 1.2в. Очевидно, что в этом варианте сложно достичь очень хорошего
разделения. Кроме того, для элюирования компонентов требуется доволь
но значительное время.
Рис. 1.2. Колонки для хроматографии низкого и высокого давления, а так
же вид типичных хроматограмм, получаемых на подобных уста
новках: а – колонка для разделения при низком давлении, б –
колонка для разделения при высоком давлении, в – типичная хро
матограмма разделения трехкомпонентной смеси при низком дав
лении, г – типичная хроматограмма разделения трехкомпонент
ной смеси при высоком давлении
а) б)
в)
г)
5 фракция 15 фракция
(25 мин) (75 мин)
1 мин 3 мин
1.3. Как улучшить разделение? 27
Причина невысокой разрешающей способности – применение адсорбентов с крупными частицами. Для того, чтобы жидкостная хроматогра
фия могла выполнять задачи аналитической химии, необходимо уменьшить
средний диаметр частиц адсорбента по крайней мере до 10 микрометров,
то есть до 0,01 мм. Подобные адсорбционные материалы стали широко доступны только в начале 70 х годов прошлого века. Переход на новые мел
козернистые адсорбенты повлек за собой революционные изменения в тех
нике для проведения разделений методом жидкостной хроматографии.
Для того, чтобы жидкость (элюент) могла пройти через трубку длиной
15–25 см, плотно упакованную мелким порошком со средним размером
частиц 3–5 микрометров (то есть колонку для аналитической хроматогра
фии), необходимо создать значительное давление порядка 100–200 атмосфер. Создать такое давление можно лишь при помощи специального и притом достаточно дорогостоящего насоса высокого давления. Жидкостная
хроматография высокого давления получила название высокоэффективная
жидкостная хроматография, ВЭЖХ (high performance liquid chromatography,
HPLC). ВЭЖХ широко применяется как один из наиболее универсаль
ных методов физико химического анализа вещества.
Колонка для ВЭЖХ, заполненная определенным адсорбентом, явля
ется, по сути, промышленно выпускаемым изделием. Она представляет
собой стальную (как правило) трубку длиной от 5 до 25 см и внутренним
диаметром от 2 до 4,6 мм, которая заполнена адсорбентом определен
ной марки. Колонка симметрична; с каждой стороны на нее устанави
ливают пористый фильтр из губчатого титана и съемную (как правило)
уплотнительную гайку. Циркулирующая жидкость подводится к колонке
и отводится от нее по пластиковым капиллярам, которые закрепляются
на концах колонки при помощи специальных уплотнительных винтов –
фитингов (см. рис. 1.2б). Типичная для ВЭЖХ хроматограмма приведена
на рис. 1.2г. На современных аналитических колонках для жидкостной
хроматографии можно полностью разделить до двух-трех десятков ком
понентов за 10–15 мин.
Но за все хорошее, как известно, надо платить: для проведения опре
делений методом ВЭЖХ одной колонки уже недостаточно – здесь требу
ется целый прибор, который называется жидкостным хроматографом
(liquid chromatograph). Схема самого простого варианта жидкостного
хроматографа приведена на рис. 1.3. Как мы уже выяснили, для ВЭЖХ
нужен насос высокого давления. Кроме того, для ввода (инжектирова
ния) пробы под давлением также необходимо специальное устройство, ко
торое называется инжектором (injector). Наконец, аналитический при
бор не может обойтись без высокочувствительного детектора (detector).
28 Глава 1. Что такое хроматография?
Задача детектора состоит в том, чтобы «замечать» самые различные веще
ства, выходящие из хроматографической колонки, даже в наинизшей кон
центрации, и количественно отображать сигналы от компонентов разде
ленной смеси на хроматограмме.
1.3. Как улучшить разделение?
Возможности хроматографии как метода анализа вещества очень сильно
зависят от ее способности обеспечивать как можно лучшее разделение
сложных смесей на индивидуальные компоненты. От этого зависит пра
вильность анализа или даже вообще возможность проведения определе
ния. И, разумеется, совсем немаловажно время анализа – никому не ну
жен метод, требующий часы на простейшее определение. Одним словом,
каждый хроматографист мечтает (но только в рабочее время) как бы раз
делить свои образцы получше и поскорее. Процесс улучшения методик
разделения называется оптимизацией разделения. В этой главе мы нач
нем обсуждение вопросов оптимизации. Заодно пополним лексикон не
достающими терминами. Двигаться будем постепенно, так что советую
запастись терпением.
Подведем некоторые итоги предыдущих двух разделов. Итак, графичес
ким представлением результата разделения является хроматограмма – за
висимость сигнала детектора от времени элюирования. Хроматограмма
начинается в момент ввода пробы и может быть остановлена, в принци
пе, в любой момент.
Каждое вещество, регистрируемое детектором, отображается на хро
матограмме в виде пика – зависимости концентрации этого вещества в
элюате от времени элюирования. Площадь пика пропорциональна кон
центрации вещества в пробе; коэффициент пропорциональности зави
сит как от самого вещества, так и от типа применяемого детектора.
Рис. 1.3. Схема устройства жидкостного хроматографа: 1 – емкость для за
бора элюента, 2 – насосная система, 3 – система инжекции (вво
да пробы), 4 – хроматографическая колонка, 5 – система детек
тирования, 6 – емкость для слива элюата
Основной характеристикой вещества в данной хроматографической
системе является его удерживание в хроматографической колонке, кото
рое может быть выражено несколькими величинами.
Непосредственно из хроматограммы, по положению максимума пика
вещества, определяется его время удерживания tR. Объем удерживания
(retention volume) VR равен произведению времени удерживания на объем
ную скорость подачи подвижной фазы: VR = tR × v.
1.3.1. Удерживание. Разрешение
Теперь, если здесь все ясно, будем двигаться дальше. Представьте, что в
пробе есть вещество, которое совсем не адсорбируется, то есть совсем не
удерживается в выбранных условиях. Оно, надо сказать, не выйдет из ко
лонки сразу в момент старта анализа. Ему надо, пусть даже не задержива
ясь, пройти через колонку вместе с элюентом, на что нужно определенное
время. Это время называется нулевым (мертвым). Итак, нулевым временем
t0 называется время, затрачиваемое полностью несорбируемым веществом
на прохождение по хроматографической колонке от узла ввода пробы до
кюветы детектора. Нулевое время определяется экспериментально вводом
в колонку заведомо неудерживаемого компонента. Нулевой объем V0 при
условии пренебрежимо малого объема подводящих капилляров равен объе
му подвижной фазы внутри хроматографической колонки, то есть около
70% ее общего объема VС. Нулевой объем определяется как произведение
нулевого времени на объемную скорость подачи элюента V0 = t0 × v.
Приведенным временем удерживания t′R называется разница между вре
менем удерживания вещества и нулевым временем t′R = tR – t0 (см. рис. 1.4).
Фактором удерживания (retention factor), или, в старой номенклатуре,
фактором емкости (capacity factor), k′, называется отношение приведен
ного времени удерживания вещества к нулевому времени k′ = t′R/t0.
Зачем нужны такие сложности? Не проще было бы просто ограничить
ся одним параметром пика – временем удерживания?
Все дело в том, что время удерживания tR – это величина, которая изме
ряется в секундах (минутах, часах), и она строго привязана к габаритам хро
матографической колонки и объемной скорости подачи подвижной фазы.
Фактор емкости k′ никак он них не зависит. Эта безразмерная величина
является мерой удерживания данного вещества на данном адсорбенте при
применении данного элюента. И если для целей аналитической химии нам
будет вполне достаточно знать tR, то для сравнения разных результатов на
разных колонках мы будем пользоваться исключительно величинами k′.
Для современных аналитических колонок размера 250 × 4,6 (длиной
250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм) при скорости подачи элюента
30 Глава 1. Что такое хроматография?
1 мл/мин нулевое время составляет величину порядка t0 ≈ 2,5 мин, а опти
мальное время элюирования целевых соединений 2 < k′ < 5 изменяется от
7,5 до 15 мин.
Фактор емкости пика с точностью до постоянного для каждой хро
матографической колонки множителя равен константе адсорбции ве
щества в хроматографической системе (строго говоря, при условии
предельно низкой концентрации вещества в пробе, то есть в области
линейности изотермы адсорбции):
K = (V0/(VС – V0)) × k′,
где К – константа адсорбции вещества в хроматографической системе,
k′ – фактор емкости пика, VС – общий объем колонки, V0 – нулевой объем.
Задачей хроматографии является разделение веществ за счет разности в
их удерживании. Степень разделения двух веществ называется разрешением
Рис. 1.4. Основные параметры, непосредственно выделяемые из хроматог
раммы:
t0 – нулевое время;
tR (1) – время удерживания для первого пика;
t′R (1) – исправленное время удерживания для первого пика;
w (1) – ширина первого пика у основания;
w1/2 (2) – ширина второго пика на половине его высоты
tR (2)
tR (1)
t′R (2)
t′R (1)
t0
w1/2 (2)
w (1)
1/10 Ka = A/B
1.3. Как улучшить разделение? 31
(resolution). Непосредственно из хроматограммы разрешение двух пиков
вычисляется как отношение разницы во временах удерживания к поло
вине суммы ширин пиков на уровне базовой линии:
R = 2 × (tR (1) – tR (2))/(w (1) + w (2)).
Если вещества не разделяются, то разрешение равно нулю. При разре
шении, равном единице, перекрываются лишь порядка 2% площадей двух
пиков. Именно такая ситуация изображена на рис. 1.4. Можно считать,
что при R ≥ 1 пики разделяются «до базовой линии» (baseline separation).
Базовой линией (baseline) называется линия фонового сигнала детектора.
Базовая линия прописывается на хроматограмме, когда никакие компо
ненты не элюируются с колонки.
Термин «разрешение» нужен для того, чтобы выразить степень разделения двух пиков количественно: мы знаем, как рассчитать эту величину,
держа хроматограмму перед глазами.
Теперь можно перейти к самому главному – к вопросу, какие факторы
оказывают влияние на разрешение. Назову их сразу: это селективность,
эффективность, а также удерживание (с последним мы уже знакомы).
1.3.2. Селективность – параметр, отражающий
физико химические взаимодействия
в хроматографической системе
Величина, отражающая способность хроматографической системы к раз
делению веществ, называется селективностью (selectivity) системы по от
ношению к этим веществам. «Селективность» в переводе означает «изби
рательность».
Для двух пиков селективность можно вычислить непосредственно из
хроматограммы как отношение фактора удерживания более удерживаемого
пика к фактору удерживания менее удерживаемого: α = k′2/ k′1. При α = 1
(полное отсутствие избирательности хроматографической системы) разде
ления не происходит. Более того, его невозможно добиться применением
более качественной хроматографической колонки или любым другим спо
собом, кроме как изменить саму хроматографическую систему: подвижную
и/или неподвижную фазу. Разделение на данном адсорбенте при примене
нии данного элюента принципиально возможно, только если α > 1.
Есть такая характеристика разделения как сложность разделения –
пока я могу лишь посоветовать воспринять ее интуитивно. Так вот, слож
ность разделения очень быстро уменьшается с ростом селективности. Та
ким образом, селективность является ключевым фактором, влияющим на
разрешение. Управление селективностью – это искусство подбора опти
32 Глава 1. Что такое хроматография?
мального адсорбента и оптимального элюента для данного разделения.
Этому искусству нужно учиться.
Одним из преимуществ жидкостной хроматографии является возмож
ность улучшения селективности без замены неподвижной фазы, путем гра
мотного изменения состава подвижной фазы и соотношения ее компо
нентов. Это свойство жидкостных хроматографических систем называется
гибкостью (flexibility).
Термин «селективность» может также применяться в более общем
значении – как свойство хроматографической системы успешно справ
ляться с разделением сложного многокомпонентного объекта. Так,
хроматограмма из n пиков характеризуется 1/2n (n – 1) частными зна
чениями селективности α. Но, понимая селективность как общее свой
ство хроматографической системы, этим термином можно назвать всю
совокупность значений α.
а)
б)
в)
г)
д)
е)
Рис. 1.5. Разделения с различной и одинаковой селективностью: а, б, в –
разделение трехкомпонентной смеси в системах с различной се
лективностью: б – селективность отлична от а), но порядок элю
ирования сохраняется, в – селективность отлична от а), причем
изменяется и сам порядок элюирования; г, д, е – разделения че
тырехкомпонентной смеси в системах с одинаковой селективно
стью: д – при отличной от г) эффективности, е – при отличном от
г) удерживании
1.3. Как улучшить разделение? 33
В этом случае «селективность» подразумевает типичный для дан
ной хроматографической системы порядок элюирования компонентов. При постоянной селективности хроматограмма всегда выглядит
одинаково: пики могут быть шире или уже, анализ может занимать
разное время, но последовательность элюирования, пропорции меж
ду факторами удерживания компонентов будут также всегда оставать
ся постоянными (см. рис. 1.5г, д, е).
Селективность данной хроматографической системы является суммар
ной характеристикой физико химических взаимодействий в хроматогра
фической системе: вещества с адсорбентом, вещества с элюентом и элю
ента с адсорбентом. Для изменения селективности надо либо заменить
применяемый адсорбент, либо поменять состав элюента. Селективность
также зависит от температуры, при которой проводится разделение.
1.3.3. Эффективность хроматографической колонки.
Пиковая плотность. Асимметрия пика
Помимо других факторов, разрешение пиков зависит от того, насколько
сильно размываются хроматографические зоны веществ при продвиже
нии вдоль колонки. Чем сильнее их размывание, тем шире оказываются
пики (при условии, что их времена удерживания не изменяются), и тем
хуже они разрешаются.
Величина размывания хроматографической зоны определяется характеристикой, которая называется эффективностью. Чем выше эффек
тивность, тем уже хроматографическая зона. Эффективность целиком и
полностью является свойством хроматографической колонки и опреде
ляется: размером частиц адсорбента, качеством изготовления адсорбен
та, качеством упаковки колонки адсорбентом и т.д. На рис. 1.6а, б пока
заны хроматограммы с одинаковым удерживанием компонентов и
селективностью, но различной эффективностью (на 1.6б эффективность
ниже). Конечно же, на колонках с высокой эффективностью разреше
ние выше.
Эффективность можно вычислить по любому пику на хроматограмме:
N = 5,545 × (tR/w1/2)2,
где N – эффективность, w1/2 – ширина пика на половине высоты, мин, tR –
время удерживания, мин.
Это вычисление основано на предположении, что форма пика описы
вается кривой Гаусса, то есть кривой нормального распределения случай
ной величины.
34 Глава 1. Что такое хроматография?
Вообще говоря, эффективность – это безразмерная величина, но в хро
матографии принято приписывать ей единицу измерения с довольно экзо
тическим названием: количеством теоретических тарелок, т.т. (plate number).
Когда речь идет об аналитических применениях, любят характеризовать
колонку именно эффективностью (количеством теоретических тарелок).
Когда же речь заходит о теории хроматографии, то пользоваться предпочи
тают обратной ей величиной, которая называется высотой, эквивалентной
теоретической тарелке, ВЭТТ (height equivalent to theoretical plate, HETP, H):
H = L/N,
где H – ВЭТТ, мм, L – длина колонки, мм, N – эффективность колонки, т.т.
Хотя величина эффективности определяется только хроматографичес
кой колонкой, ее конкретное значение зависит от скорости подачи элю
ента, а также немного от температуры системы и адсорбата, по пику кото
рого проводится расчет. Поэтому тестирование колонки (определение
эффективности) проводится при общепринятой скорости подвижной
фазы (1 мл/мин для колонок с диаметром 4,6 мм) и по определенным ад
сорбатам (к примеру, по толуолу или нафталину). Зависимость эффектив
ности (точнее, ВЭТТ) от скорости подвижной фазы называется зависи
мостью Ван Деемтера; она обсуждается в гл. 4.
Эффективность хроматографической колонки в первом приближении
пропорциональна ее длине; таким образом, при оценке качества упакова)
б)
в)
Рис. 1.6. Разделение трехкомпонентной смеси с варьируемой эффективностью или асим
метрией: б – эффективность ниже, чем в случае а); в – эффективность одинакова с а), но
асимметрия пиков значительно выше
1.3. Как улучшить разделение? 35
ки колонки адсорбентом принято использовать значение удельной эффективности, то есть эффективности, отнесенной к единице длины. Для
современных высокоэффективных колонок значения удельной эффек
тивности лежат в интервале 80–230 тысяч теоретических тарелок на метр.
Выше мы описывали пик «колоколообразной», симметричной фор
мой кривой Гаусса. На практике, однако, пики бывают разными, в том
числе асимметричными. Коэффициент асимметрии Ка вычисляется как
отношение «правой» полуширины пика к «левой» на одной десятой его
высоты (см. рис. 1.4). При одинаковой эффективности асимметричные
пики разрешаются хуже (см. рис. 1.6а, в). Таким образом, асимметрич
ность пиков является нежелательным явлением, с которым хроматографисты и производители колонок активно борются.
Неудобство применения эффективности как величины для оценки разрешающей способности колонки связано с тем, что разреше
ние, как будет показано далее, пропорционально не прямо эффективности, а квадратному корню из нее. Вероятно, более удобна в этом
отношении другая величина, которая называется пиковой плотностью
(peak capacity). Она определяется как число пиков, которые могут быть
расположены на хроматограмме (до произвольно выбранного k′) друг
за другом с разрешением, равном единице. Пиковая плотность связана с эффективностью колонки:
n = 1 + 0,6 × √N × lg (1 + k′),
где n – пиковая плотность, N – эффективность, k′ – фактор удерживания последнего компонента.
1.3.4. Связь разрешения с селективностью,
эффективностью и фактором удерживания
(основная формула хроматографии)
Подведем итоги. Есть три фактора, влияющих на разрешение двух пиков:
селективность хроматографической системы, эффективность колонки и
величина удерживания данных двух веществ.
Самым важным фактором является селективность системы α. Изменить
ее не так то просто – часто для этого нужно либо заменить неподвижную
фазу (выбрать колонку с другой маркой адсорбента), либо серьезно изме
нить состав элюента (не просто изменить соотношение смешиваемых растворителей, а, например, заменить один растворитель на другой). Тем
более непросто ее не ухудшить, а улучшить, причем целенаправленно –
для этого необходимо хорошее знание хроматографических закономер36
Глава 1. Что такое хроматография?
ностей. Но дело того стоит: ведь даже небольшой рост селективности приводит к серьезному улучшению разрешения.
Вторым по значимости фактором является эффективность колонки N.
Увеличить эффективность достаточно просто – необходимо взять более
эффективную колонку – но у этого подхода есть свои ограничения, подробно обсуждаемые в разд. 4.3.
Наименее значимый эффект на разрешение оказывает величина удерживания k′. Только для наименее удерживаемых компонентов с k′ < 2 увеличение удерживания приводит к видимому улучшению разрешения. При
k′ порядка 3–5 уже можно считать, что удерживание практически никак
не сказывается на разрешении. Из этого надо сделать всего один вывод:
удерживание целевых соединений (аналитов) по возможности не должно
быть менее k′ = 2.
Эти эмпирические правила просто выражаются количественно. Формулу, связывающую разрешение R со значениями α, N и k′, иногда назы
вают основной формулой хроматографии:
R = 1/4 × (α – 1)/α × √N × k′2/(k′2 + 1),
где R – разрешение, α – селективность, N – эффективность, k′2 – фактор
удерживания второго пика.
Для каждого конкретного случая можно назвать свой наиболее оптимальный путь улучшения разделения. Если плохое разрешение – следствие
слишком слабого удерживания (см. рис. 1.7а), то удерживание следует не
много увеличить (см. рис. 1.7б). Но не слишком: разрешение останется практически неизменным, а вот время анализа сильно возрастет (см. рис. 1.7в).
Рис. 1.7. Разделение при увеличении удерживания k′
а) б)
в)
1.3. Как улучшить разделение? 37
а)
б)
Рис. 1.8. Разделение при увеличении эффективности N
Рис. 1.9. Разделение при улучшении селективности α
а)
б)
На хроматограмме, приведенной на рис. 1.8а, недостаточное разреше
ние связано, очевидно, с низкой эффективностью, поскольку и с удер
живанием, и с селективностью проблем нет. То есть, надо взять более эф
фективную колонку (см. рис. 1.8б).
Конечно же, если при хороших эффективности и удерживании на хро
матограмме все равно есть критические пары (см. рис. 1.9а), то улучшить
ситуацию можно, лишь изменив селективность (см. рис. 1.9б).