eng
Содержание
Содержание
Предисловие ко второму изданию ............................................................................ 11
Предисловие ............................................................................................................. 13
Введение ................................................................................................................... 17
Глава 1. Система ввода образца .............................................................................. 19
1.1.
Баллон напуска ........................................................................................... 19
1.2.
Прямой ввод ............................................................................................... 20
1.3.
Мембранный ввод (Membrane inlet mass spectrometry, MIMS) ................. 21
1.4.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия .......................................... 23
1.4.1.
Ввод пробы в систему ГХ/МС .......................................................... 23
1.4.2.
Запись масс-спектров в режиме ГХ/МС .......................................... 26
1.4.3.
ГХ×ГХ/МС ....................................................................................... 30
1.5.
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
(ЖХ/МС, LC/MS) ...................................................................................... 34
1.5.1.
Ленточный транспортер (moving belt) .............................................. 35
1.5.2.
Прямой ввод жидкости (direct liquid introduction, DLI) .................. 36
1.5.3.
Поток частиц (particle beam) ............................................................. 36
1.5.4.
Термораспыление, термоспрей (thermospray, TSP),
плазмораспыление, плазмаспрей (plasmaspray) ............................... 37
1.6.
Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия
(СФХ/МС) .................................................................................................. 38
1.7.
Капиллярный электрофорез /масс-спектрометрия, КЭ/МС
(Capillary Electrophoresis/Mass spectrometry, CE/MS) ................................ 41
1.8.
Ионная хроматография/масс-спектрометрия (ИХ/МС) ......................... 42
1.9.
Атмосферный ввод ..................................................................................... 42
Глава 2. Физические основы процессов масс-спектрометрической
фрагментации .......................................................................................................... 44
2.1.
Электронная ионизация (Electron Ionization, EI) ..................................... 44
2.2.
Физические основы масс-спектрометрической фрагментации ............... 49
2.2.1.
Квазиравновесная теория ................................................................. 50
2.2.2.
Фотодиссоциация, разрешенная во времени ................................... 54
2.3.
Метастабильные ионы ............................................................................... 55
2.4.
Полуколичественная теория фрагментации ............................................. 58
Глава 3. Основные правила и подходы к интерпретации масс-спектров ............. 59
3.1.
Стабильность ионов и нейтральных частиц .............................................. 59
3.1.1.
Правило выброса максимального алкильного радикала ................. 61
3.1.2.
Правило Стивенсона (Стивенсона – Одье) ..................................... 63
3.1.3.
Правило четноэлектронных ионов ................................................... 65
3.1.4.
Правило степеней свободы ............................................................... 66
3.1.5.
Прочность химических связей .......................................................... 67
3.1.6.
Структурные и стереохимические факторы ..................................... 68
3.1.7.
Орто-эффект ...................................................................................... 70
3.1.8.
Масс-спектрометрия хиральных соединений .................................. 72
3.2.
Концепция локализации заряда и неспаренного электрона .................... 73
3.2.1.
Фрагментация, удаленная от места локализации заряда ................. 77
Глава 4. Практические основы интерпретации масс-спектров ............................. 79
4.1.
Молекулярный ион .................................................................................... 79
4.2.
Определение элементного состава ионов на основании
изотопных пиков ........................................................................................ 82
4.2.1.
Азотное правило ................................................................................ 90
4.2.2.
Определение содержания изотопа 13С в природных образцах......... 93
4.2.3.
Расчет изотопной чистоты соединений ........................................... 94
4.3.
Область молекулярных ионов высокомолекулярных соединений .......... 96
4.4.
Фрагментные ионы .................................................................................... 99
4.4.1.
Гомологические серии ионов ............................................................ 99
4.4.2.
Выбросы простейших нейтральных частиц ....................................102
4.4.3.
Наиболее интенсивные пики в спектре ..........................................102
4.5.
Библиотеки масс-спектров .......................................................................103
4.6.
Использование для интерпретации дополнительной
масс-спектральной информации ..............................................................108
4.7.
Схема фрагментации .................................................................................112
Глава 5. Альтернативные методы ионизации образца ..........................................115
5.1.
Ионизация фотонами (Photoionization) ...................................................115
5.2.
Химическая ионизация (Chemical Ionization, CI) ....................................116
5.3.
Химическая ионизация отрицательных ионов (Negative ion
chemical ionization, NICI) ..........................................................................119
5.4.
Пульсирующая химическая ионизация (Pulsed positive,
negative ion chemical ionization mass spectrometry) ....................................121
5.5.
Десорбционная (прямая) химическая ионизация, ДХИ
(Direct (Desorption) Chemical Ionization, DCI) .........................................121
5.6.
Полевая ионизация (Field Ionization, FI) .................................................122
5.7.
Полевая десорбция (Field Desorption, FD) ...............................................123
5.8.
Тлеющий разряд (Glow discharge) .............................................................124
5.9.
Плазменная десорбционная масс-спектрометрия (Plasma desorption
mass spectrometry, PDMS) ..........................................................................125
5.10.
Бомбардировка быстрыми атомами, ББА (Fast Аtom Вombardment,
FAB); вторичноионная масс-спектрометрия, ВИМС (Secondary Ion
Mass Spectrometry, SIMS) ...........................................................................125
5.10.1.
Проточный (динамический) вариант бомбардировки
быстрыми атомами (Continuous Flow or Dinamic Fast Atom
Bombardment) .................................................................................128
5.11.
Химическая ионизация при атмосферном давлении (Atmospheric
pressure Chemical Ionization, APCI) .........................................................129
5.12.
Фотоионизация при атмосферном давлении (ФИАД)
и фотохимическая ионизация при атмосферном давлении (ФХИАД),
Atmospheric pressure photoionization (APPI), Atmospheric pressure
photochemical ionization (APPCI) .............................................................131
5.13.
Ионизация электрораспылением, электроспрей (ИЭР) .......................134
5.14.
Ионизация акустическим распылением .................................................140
5.15.
Матрично активированная лазерная десорбция/ионизация
(МАЛДИ) .................................................................................................141
5.16.
Лазерная десорбционная масс-спектрометрия (Laser desorption
mass spectrometry, LDMS) ........................................................................151
Глава 6. Разделение и регистрация ионов .............................................................154
6.1.
Магнитный секторный масс-спектрометр ...............................................154
6.2.
Электростатический анализатор. Двухфокусный секторный
масс-спектрометр ......................................................................................155
6.3.
Масс-спектрометрия высокого разрешения ............................................156
6.4.
Масс-спектрометрия с преобразованием Фурье (МС ПФ) .....................159
6.5.
Квадрупольный анализатор ......................................................................164
6.6.
Ионная ловушка ........................................................................................165
6.7.
Времяпролетный анализатор ....................................................................167
6.8.
Орбитальная ловушка (Orbitrap) ...............................................................173
6.9.
Детектирование ионов ..............................................................................176
Глава 7. Тандемная масс-спектрометрия, МС/МС ...............................................181
7.1.
Активация ионов .......................................................................................182
7.1.1.
Активация соударением или диссоциация, индуцированная
(активированная) столкновениями ................................................182
7.1.2.
Диссоциация, индуцированная столкновением
с поверхностью ................................................................................186
7.1.3.
Другие методы инициирования фрагментации ..............................188
7.1.3.1.
Диссоциация, активированная электронами .....................188
7.1.3.2.
Фотодиссоциация (Photodissociation) .................................189
7.1.4.
Последовательная тандемная масс-спектрометрия, МСn ..............191
7.2.
Анализаторы ионов в тандемной масс-спектрометрии ...........................193
7.2.1.
Система трех квадруполей ...............................................................193
7.2.2.
Магнитные секторные приборы ......................................................196
7.2.2.1.
Спектр кинетических энергий ионов,
проанализированных по массе (MIKES) ...........................196
7.2.2.2.
Высвобождение кинетической энергии
при фрагментации ...............................................................198
7.2.2.3.
Связанные сканирования ....................................................199
7.2.3.
Ионная ловушка ...............................................................................206
7.2.4.
Масс-спектрометрия с преобразованиями Фурье ..........................207
7.2.5.
Тандемная масс-спектрометрия на приборах МАЛДИ ..................208
7.2.6.
Приборы продленной геометрии ....................................................210
7.2.7.
Приборы гибридной геометрии .......................................................212
7.2.8.
Орбитальные ловушки .....................................................................214
7.3.
Автоматизированные методы записи тандемных спектров ....................215
7.4.
Инверсия заряда ........................................................................................216
7.5.
Нейтрализация-реионизация ...................................................................218
Глава 8. Методы на основе масс-спектрометрии и родственные
масс-спектрометрии ..............................................................................................221
8.1.
Пиролитическая масс-спектрометрия .....................................................221
8.2.
Реакция переноса протона ........................................................................224
8.3.
Масс-спектрометрия выбранных ионов в потоке ....................................228
8.4.
Спектрометрия ионной подвижности ......................................................230
8.4.1.
Дрейфовая спектрометрия ионной подвижности ..........................231
8.4.2.
Спектрометрия приращения ионной подвижности .......................234
8.4.3.
Спектрометр ионной подвижности на основе бегущей волны ......235
8.4.4.
Улавливающий спектрометр ионной подвижности ........................236
8.4.5.
Спектрометр ионной подвижности на основе поперечной
модуляции ........................................................................................236
8.4.6.
Варианты комплексных методов с использованием
ионной подвижности .......................................................................237
Глава 9. Масс-спектрометрия с ионизацией на воздухе
(Ambient Ionization Mass Spectrometry)..................................................................240
9.1.
Методы на основе спрея ...........................................................................242
9.1.1.
Десорбционная электрораспылительная ионизация .....................242
9.1.2.
Нано-ДЭРИ ......................................................................................245
9.1.3.
Ионизация акустическим распылением на воздухе .......................247
9.1.4.
Экстракционная электрораспылительная ионизация ....................249
9.1.5.
Спрей с бумаги .................................................................................251
9.1.6.
Спрей с листа ....................................................................................253
9.2.
Плазменные методы ..................................................................................256
9.2.1.
Прямой анализ в реальном времени ...............................................257
9.2.2.
Низкотемпературная плазма............................................................259
9.2.3.
Десорбционная химическая ионизация при атмосферном
давлении ..........................................................................................261
9.2.4.
Масс-спектрометрия с ионизацией быстрым испарением
на воздухе .........................................................................................262
9.3.
Лазерные методы .......................................................................................265
9.3.1.
Электрораспылительная лазерная десорбция/ионизация .............266
9.3.2.
Лазерная абляция с электрораспылительной ионизацией .............267
9.3.3.
Другие лазерные методы ..................................................................268
9.4.
Методы ионизации в системе ввода .........................................................269
9.5.
Количественные аспекты ионизации на воздухе .....................................271
9.6.
Проведение химических реакций методами
масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе .........................................272
9.7.
Мягкое напыление на воздухе ..................................................................275
9.8.
Использование портативных масс-спектрометров ..................................276
9.9.
Методы масс-спектрометрической (молекулярной) визуализации
(Imaging mass spectrometry) ........................................................................280
9.10.
Он-лайн контроль хирургических операций методами
масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе .......................................287
9.11.
Будущее масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе ........................290
Глава 10. Основные направления фрагментации некоторых классов
органических соединений .....................................................................................291
10.1.
Алканы .....................................................................................................291
10.2.
Алкены и диены .......................................................................................296
10.3.
Алкины .....................................................................................................300
10.4.
Алициклические углеводороды ..............................................................302
10.4.1.
Циклоалкены ..................................................................................305
10.5.
Ароматические углеводороды .................................................................306
10.6.
Спирты, фенолы, тиолы ..........................................................................314
10.6.1.
Спирты ............................................................................................314
10.6.2.
Фенолы ...........................................................................................323
10.6.3.
Тиолы ..............................................................................................324
10.7.
Простые эфиры и сульфиды ...................................................................331
10.8.
Амины и фосфины ..................................................................................341
10.9.
Алкилгалогениды, арилгалогениды ........................................................350
10.10.
Карбонильные соединения ...................................................................360
10.11.
Карбоновые кислоты и их производные ..............................................375
10.12.
Нитрилы, изонитрилы, нитросоединения, гидразины,
оксимы и диазосоединения ...................................................................399
10.13.
Сульфоксиды, сульфоны, сульфокислоты ...........................................415
10.14.
Элементоорганические соединения .....................................................421
Глава 11. Биополимеры ..........................................................................................430
11.1.
Аминокислоты, пептиды, белки .............................................................430
11.1.1.
Масс-спектрометрия аминокислот ...............................................430
11.1.2.
Масс-спектрометрия пептидов ......................................................432
11.1.2.1.
Установление последовательности аминокислотных
звеньев ..............................................................................434
11.1.3.
Масс-спектрометрия белков ..........................................................446
11.1.3.1.
Метод идентификации белков «снизу вверх» ..................447
11.1.3.2.
Метод идентификации белков «сверху вниз» ..................450
11.1.4.
Протеомика .....................................................................................451
11.2.
Масс-спектрометрия липидов ................................................................453
11.2.1.
Триацилглицериды .........................................................................456
11.2.2.
Глицерофосфолипиды и сфинголипиды .......................................459
11.2.3.
Установление положения двойных связей в алифатических
цепях ...............................................................................................460
11.3.
Масс-спектрометрия сахаров (углеводов) ..............................................462
11.3.1.
Номенклатура фрагментных ионов сахаров ..................................464
11.3.2.
Современные методы масс-спектрометрического
анализа сахаров ..............................................................................467
11.4.
Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот ............................................469
11.4.1.
Масс-спектрометрия нуклеиновых оснований,
нуклеотидов и нуклеозидов ...........................................................469
11.4.2.
Масс-спектрометрия олигонуклеотидов ......................................470
11.4.3.
Масс-спектрометрическое секвенирование
олигонуклеотидов .........................................................................472
11.4.4.
Программное обеспечение для секвенирование
олигонуклеотидов .........................................................................475
11.4.5.
Прикладные аспекты масс-спектрометрии нуклеиновых
кислот ............................................................................................475
11.5.
Метаболомика (метабономика) ..............................................................476
11.5.1.
Инструментальные аспекты метаболомики ..................................477
11.5.2.
Варианты метаболомных исследований .......................................480
11.5.3.
Программное обеспечение метаболомики ...................................482
11.6.
Масс-спектрометрический анализ микроорганизмов ...........................483
Глава 12. Количественный масс-спектрометрический анализ ............................488
12.1.
Масс-хроматография ...............................................................................491
12.2.
Масс-фрагментография, мониторинг заданных ионов .........................502
12.3.
Мониторинг заданных реакций ..............................................................504
12.4.
Дериватизация аналитов .........................................................................506
12.5.
Установление количества соединения в образце по площади
хроматографического пика .....................................................................507
12.6.
Метод внешнего стандарта ......................................................................508
12.7.
Метод внутреннего стандарта .................................................................509
12.8.
Метод изотопного разбавления ..............................................................511
12.9.
Метод добавок .........................................................................................512
Глава 13. Обобщенные задачи................................................................................513
Глава 14. Решения задач .........................................................................................553
Приложение ............................................................................................................617
Литература ..............................................................................................................638
Список принятых и предлагаемых сокращений, русских и английских терминов,
относящихся к масс-спектрометрии ........................................................................682
Приложение 1. Инновационные подходы и аналитические решения
на основе масс-спектрометрии ................................................................................705
Приложение 2. Критерии подбора оптимальной конфигурации
ГХ/МС оборудования в зависимости от аналитической задачи ..............................721
Вся информация вселенной заложена в массе.
Р.А. Зубарев
Предисловие ко второму изданию
В 2013 году научная общественность отметила 100-летие масс-спектрометрии, за
дату рождения которой было решено принять выход в свет публикации Дж.Дж. Том-
сона «Rays of positive electricity». Это и много, и одновременно мало. Важно, что
масс-спектрометрия в начале XXI века не превратилась в изученный вдоль и по-
перек рутинный метод анализа с известными непреодолимыми недостатками и
ограничениями, а, напротив, развивается семимильными шагами.
Десять лет прошло с момента выхода в свет первого издания «Масс-спектрометрия
в органической химии». Это очень большой период для современной науки. Для
масс-спектрометрии – это огромный период. За это время масс-спектрометрия
стала самым востребованным методом аналитической химии, с помощью которого
выполняется наибольшее число анализов. В распоряжении исследователей по-
явились не просто новые модели, а новые типы масс-спектрометров. Орбитальные
ловушки, разработанные А.А. Макаровым, о которых фирма «Термо» впервые офи-
циально объявила в 2005 году, завоевали повсеместное признание исследователей
и стали наиболее желанными приборами масс-спектрометристов во всем мире.
Очень значительно выросла роль времяпролетных приборов. На базе сверхвысо-
кого разрешения появились новые направления науки: гуминомика, петролеомика.
Потрясающие успехи достигнуты в протеомике, метаболомике. В конце 2014 года
осуществлена посадка космического аппарата «Розетта» на комету Чурюмова – Ге-
расименко. Это выдающееся научное достижение. Среди оборудования «Розетты»
важную роль играет ROSINA – прибор для анализа ионов и нейтральных частиц,
который состоит из двух масс-спектрометров: двухфокусного магнитного сек-
торного и рефлектронного времяпролетного. Этот факт демонстрирует важность
масс-спектрометрии для современной науки, для получения наиболее надежных
экспериментальных данных. Очень интересные результаты можно получать с
помощью изотопной масс-спектрометрии. Метод масс-спектрометрической ви-
зуализации (имиджинга) позволяет изучать распределение искомых соединений
по поверхности или всему объему изучаемого объекта. Масс-спектрометрические
методы стали широко использоваться для диагностики самых разных заболеваний,
для контроля хирургических операций.
За последние 10 лет изменилась терминология. Введено более сотни новых
терминов, рекомендовано переименовать ряд существовавших названий. Даже
классический метод ионизации «электронный удар» теперь следует называть
«электронная ионизация». Возникло необычайно перспективное направление –
масс-спектрометрия с ионизацией на открытом воздухе. Создано несколько
десятков методов ионизации, которые позволяют работать с минимальной или
вообще без пробоподготовки. Это устраняет последний практический недоста-
ток масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия сегодня – это наиболее быстрый,
чувствительный и информативный метод анализа химических и биологических
соединений любой сложности: от химических элементов до биополимеров (белки,
сахара, нуклеиновые кислоты). Можно утверждать, что, если для какого-нибудь со-
единений вы не можете найти масс-спектрометрическую методику его определения,
это означает только то, что оно до сих пор не интересовало масс-спектрометристов.
Существенные успехи достигнуты в области миниатюризации. Созданы перенос-
ные масс-спектрометры весом в несколько килограммов. В результате появились
предпосылки для создания в недалеком будущем бытовых масс-спектрометров для
проверки качества пищевых продуктов, напитков, медикаментов и т.д.
Значительные перемены произошли и в российской масс-спектрометрии.
В конце 2003 года создано Всероссийское масс-спектрометрическое общество
(ВМСО), объединившее около 600 ученых более чем из 50 регионов страны, ближ-
него и дальнего зарубежья и ставшее полноправным членом международного масс-
спектрометрического общества (International Mass Spectrometry Foundation, IMSF).
ВМСО уже проведено шесть крупных масс-спектрометрических конференций с
международным участием, ежегодно проводятся школы по разным аспектам масс-
спектрометрии. С 2004 года в свет выходит журнал «Масс-спектрометрия», вклю-
ченный в список ВАК и переводимый на английский язык в качестве ежегодного
приложения к «Журналу аналитической химии». Журнал хорошо цитируется, а по
импакт-фактору РИНЦ в 2013 году он оказался на втором месте среди всех рос-
сийских журналов в области химии и на пятом в области физики. Золотые медали
ВМСО за выдающиеся заслуги в масс-спектрометрии вручены российским ученым
с мировыми именами: Б.А. Мамырину, А.А. Макарову, Л.Н. Галль, И.А. Ревель-
скому, Р.А. Зубареву. Престижные Международные премии получили наши соот-
ечественники: В.Л. Тальрозе (премия Томсона), А.А. Макаров (премии Томсона,
Брюне, Американского масс-спектрометрического общества), Р.А. Зубарев (премии
Брюне и Бимана), Ю. Ласкин (премия Бимана, премия Rising Star Award from the
Women Chemists Committee of the American Chemical Society). Золотыми медалями
Питсбургской конференции в ХХI веке награждены два масс-спектрометра: орби-
тальная ловушка фирмы «Термо», разработанная А.А. Макаровым, и времяпролет-
ный масс-спектрометр высокого разрешения HRT фирмы ЛЕКО, разработанный
А.Н. Веренчиковым и В.Б. Артаевым. За прошедшие 10 лет активизировался выпуск
специализированной масс-спектрометрической литературы на русском языке. Вы-
шедшие монографии российских авторов и переводы зарубежных изданий были
посвящены разным направлениям масс-спектрометрии [1–7].
Таким образом, изменений и новшеств накопилось так много, что выпуск ново-
го, существенно переработанного и дополненного учебного издания по органиче-
ской масс-спектрометрии стал необходим. Изменения коснулись практически всех
глав. Добавлены новые главы по ионизации на открытом воздухе, по родственным
масс-спектрометрии методам анализа, по масс-спектрометрии биологических
соединений. В тексте использована новая терминология в соответствии с реко-
мендациями ВМСО и IMSF. Большое количество иллюстративного материала
позволит легче воспринимать материал. Добавлены новые задачи, необходимые
при проведении обучающих семинаров.
Предисловие
К концу ХХ века инструментальные физико-химические методы анализа стали
неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего
в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них,
безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-
спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине,
экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т.д. Характе-
ризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать
его ЯМР и масс-спектры.
Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить ее
чувствительность, экспрессность, информативность и надежность. Для получе-
ния достоверного масс-спектра индивидуального соединения даже на рутинном
масс-спектрометре достаточно 10{sup}-9{/sup} – 10^–10 г вещества. При необходимости про-
стого детектирования конкретного соединения в смеси порог обнаружения может
быть легко снижен до 10–12–10–14 г. Использование современного оборудования и
современных методов ионизации позволяет в некоторых случаях увеличить чув-
ствительность метода еще на несколько порядков. Таким образом, «традиционная
неразрешимая» без волшебства русская задача о «поиске иголки в стоге сена» может
быть легко решена масс-спектрометрически, а обычный масс-спектрометрический
эксперимент сравним с поиском одной иголки в нескольких миллионах стогах сена.
Для получения обычного спектра электронной ионизации индивидуального
соединения необходимо затратить 1–2 минуты, а время анализа сложной смеси
органических соединений в режиме хроматомасс-спектрометрии определяется
исключительно хроматографическим временем удерживания компонентов. При
этом в памяти компьютера, являющегося неотъемлемой частью современного
масс-спектрометра, остается информация о временах удерживания, площадях
пиков, а также масс-спектры всех компонентов смеси, то есть, вводя в прибор один
микролитр сложнейшей смеси органических соединений, на «выходе» можно полу-
чить информацию о ее качественном и количественном составе. Ни один другой
метод не сочетает в себе такой экспрессности и информативности. Надежность
масс-спектрометрического анализа также очень высока, поскольку масс-спектр
является индивидуальной характеристикой конкретного вещества, отражающей
его структурные особенности.
История масс-спектрометрии насчитывает около 100 лет. Годом рождения масс-
спектрометрии можно считать 1901-й, когда немецкий физик В. Кауфман создал
первый прототип параболического масс-спектрографа для изучения «катодных
лучей», или 1913-й, когда сэр Дж. Томсон впервые спектрально увидел изотопы
неона, или 1918-й, когда А. Демпстер сконструировал первый магнитный масс-
спектрометр с источником для электронной и термической ионизации. Тем не
менее в течение первых 50 лет существования эта наука оставалась прерогативой
исключительно физиков и физико-химиков. Используя простейшие соединения,
масс-спектрометристы того времени успешно измеряли характеристики элементов,
атомов, молекул (энергии ионизации, прочности связей, точные массы элементов
и природную распространенность их изотопов).
Временем рождения органической масс-спектрометрии можно считать конец
40-х – начало 50-х годов прошлого века. Это было совсем недавно, поэтому даже
сейчас, в начале ХХI века, можно лично поговорить с классиками, стоявшими
у истоков создания этой дисциплины. После Второй мировой войны возникло
понимание, что метод можно использовать не только в качестве прецезионного
физико-математического инструмента, но и в качестве удобного способа иден-
тификации достаточно сложных соединений по набору характеристических для
них фрагментных ионов. Знание классических химических реакций органических
соединений и привлечение теорий устойчивости органических ионов позволяет
приписать фрагментам конкретные структуры, делать обобщения по аналогиям
фрагментации внутри классов органических соединений. Переход на такой уро-
вень масс-спектрометрии резко увеличил число пользователей метода и привел
к взрывному процессу развития приборного парка. Особенно важной оказалась
применимость метода для решения нефтехимических проблем. Финансовые вло-
жения нефтяных компаний значительно помогли быстрому инструментальному и
теоретическому становлению нового научного направления. Отличное издание [8],
содержащее огромный фактический материал по истории масс-спектрометрии и
богато иллюстрированное фотографиями и рисунками, вышло в свет в 2002 году
под редакцией М. Грейсона по случаю 50-летия масс-спектрометрического обще-
ства США.
Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения
двух основных проблем: идентификации и количественного определения ве-
ществ, а также изучения превращений ионизированных молекул органических
соединений в газовой фазе в ионном источнике [9]. С появлением хроматомасс-
спектрометрии, ионного циклотронного резонанса [10], систем протока после
разряда [11] возможности классического метода значительно увеличились. Соеди-
нение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом еще более расширило круг
изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» [12]
и МАЛДИ [13], появившиеся к концу ХХ века, позволили успешно работать со
сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки,
полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют
миллионы дальтон [14]. На сегодняшний день можно проанализировать соединение
практически любой сложности. В последние годы широко ведутся исследования
по анализу микроорганизмов [15], по моделированию в газовой фазе химических
реакций термолиза, фотолиза, превращений, катализируемых кислотами и основа-
ниями [16], по изучению каталитических процессов [17]. По шутливому выражению
одного из «отцов» органической масс-спектрометрии Фреда Мак-Лафферти, «если
химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, может быть,
она вообще не стоит того, чтобы на нее тратили время» [18]. Признанием важности
масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 го-
ду Нобелевской премии масс-спектрометристам Джону Фенну и Коичи Танаке.
Наряду с очевидным использованием масс-спектрометрии в органической и био-
органической химии для установления структур соединений, хроматомасс-спектро-
метрия стала сегодня основным методом идентификации и количественного опре-
деления органических загрязнений в объектах окружающей среды. Современная
химическая экология немыслима без этого метода. Изучение метаболизма лекар-
ственных средств и пестицидов в окружающей среде и живых организмах также
ведется с активным использованием масс-спектрометрии. Метод незаменим в
криминалистических исследованиях и при проведении допинг-контроля на спор-
тивных соревнованиях.
Масс-спектрометрия применяется для решения геохимических и космохими-
ческих проблем, задач комбинаторной химии, иммунологии, медицины, биологии
и т.д. Масс-спектрометрия имеет явное преимущество перед другими физико-хи-
мическими методами, поскольку в этом случае речь идет о простейших характери-
стиках вещества: массе молекулы, ее основных фрагментов и отношении количеств
этих фрагментов относительно друг друга. Это позволяет достаточно легко усвоить
основы метода и научиться работать с масс-спектрами не только подготовленным
студентам, но и школьникам старших классов, изучающим курс органической
химии. Учитывая, что расшифровка масс-спектра может быть сродни решению
головоломки типа puzzle, научиться владеть этим методом настолько же полезно,
насколько просто и увлекательно.
Тем не менее, занимаясь масс-спектрометрией органических соединений уже
более 30 лет, я постоянно сталкиваюсь с ситуацией, когда даже опытные химики-
органики пасуют перед масс-спектром, предпочитая извлечь необходимую инфор-
мацию о структуре с помощью других, более знакомых им методов. Объяснение
этому я нахожу в отсутствии учебной литературы по интерпретации масс-спектров
и спецкурсов по этой дисциплине в вузах России. Книги по масс-спектрометрии
советских авторов, изданные в 70–80-е годы прошлого века, затрагивали отдельные
аспекты органической масс-спектрометрии [19–39], причем в качестве учебной
литературы можно было бы выделить лишь пособия [24–27]. Русскоязычный чи-
татель не был знаком и с подавляющим большинством иностранных изданий. За
исключением фундаментальной пионерской монографии Джона Бейнона [9], на
русский язык были переведены лишь три книги [40–42], две из которых [40, 41] от-
носятся к 60–70-м годам ХХ века. Даже замечательный учебник Мак-Лафферти [43],
претерпевший уже четыре издания, так и не переведен на русский язык. В XXI веке
ситуация несколько изменилась. Прежде всего это связано с созданием Всероссий-
ского масс-спектрометрического общества. Его деятельность привела к написанию
и переводу современных книг по масс-спектрометрии [1–7], а также первого из-
дания этого учебного пособия [44].
Данное пособие направлено на решение двух основных задач: учебной и по-
знавательной. Можно знакомиться с материалом последовательно, а можно выбо-
рочно читать конкретные главы или разделы. Большое внимание уделено именно
работе с масс-спектром, подходам к его расшифровке с извлечением максимальной
структурной информации. Описание основных направлений фрагментации раз-
личных классов органических соединений (от алканов до белков и нуклеиновых
кислот) сопровождается задачами, аналогичными тем, с которыми сталкивается
любой исследователь, когда обращается к методу масс-спектрометрии в своих на-
учных целях. Решая эти задачи, читатель сможет закрепить теоретический материал
и успешно справляться с подобными проблемами в своей последующей научной
работе. Большое число вариантов типовых задач позволяет использовать книгу не
только для индивидуальной работы, но и для семинаров в студенческих группах.
Последнее десятилетие ХХ века ознаменовалось революционными новациями
в органической масс-спектрометрии. В данной работе наряду с описанием класси-
ческих методов ввода и ионизации образца, а также разделения и детектирования
ионов значительное место уделено теоретическим и практическим аспектам со-
временной масс-спектрометрии: электрораспылению и другим методам стыковки
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром, матрично активированной
лазерной десорбции/ионизации (гл. 5), тандемной масс-спектрометрии (гл. 7), ме-
тодам анализа, основанным или связанным с масс-спектрометрией (гл. 8), методам
ионизации без пробоподготовки (на открытом воздухе, гл. 9).
Очень важно, чтобы масс-спектрометрией владели непосредственно химики,
биологи, экологи, а не узкий круг профессиональных масс-спектрометристов. Ни-
кто не знает столь досконально свою задачу, как человек, непосредственно работаю-
щий с веществом. Если он сможет правильно поставить масс-спектрометрическую
задачу и при этом владеет техникой интерпретации масс-спектров, эффективность
его работы со спектрами будет существенно выше, чем у профессионального масс-
спектрометриста, далекого от конкретной проблемы. Недостающим звеном для
правильной расшифровки может оказаться информация о производителе исходного
реактива, о побочных процессах изучаемой реакции, о примесях к реагентам или
даже о реакции, которая ставилась в этой посуде за неделю до данного эксперимента.
Мир масс-спектрометрии удивителен и красив. Каждый год приносит новые
потрясающие открытия, появляются неординарные приложения этого метода.
Я надеюсь, читатель сможет оценить это сам.
Введение
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, заключающимся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим
разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе
соединения, его составе и структуре. Масса самого тяжелого иона в спектре, как
правило, соответствует молекулярной массе анализируемого соединения. Принято
представлять масс-спектр в виде графика или таблицы (рис. 1) .
В случае графического изображения по оси абсцисс откладывается масса ионов
(точнее, величина отношении массы иона к его заряду), а по оси ординат – их ин-
тенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. Принято выражать
интенсивность в процентах к полному ионному току (суммарной интенсивности
всех ионов в спектре) или к интенсивности максимального иона (рис. 1). В качестве
единицы размерности массы в масс-спектрометрии используются термины: угле-
родные единицы, атомные единицы массы, дальтоны [2]. Тем не менее, поскольку
по шкале абсцисс в масс-спектрах откладывается величина отношения массы к
заряду, для обозначения этой единицы измерений используется термин «томсон»
(Thomson, Th), но чаще – просто m/z [45].
Задача 1. Установите, какому распространенному органическому соедине-
нию принадлежит масс-спектр, представленный на рис. 1. Масс-спектрометрия
высокого разрешения показала, что точная молекулярная масса соединения
60,0211 дальтона, что соответствует составу С2Н4О2. Обращайте на данном эта-
пе внимание только на наиболее интенсивные пики в спектре, обусловленные
всей молекулой (m/z 60) и ее наиболее значимыми структурными фрагментами.
В данном случае наиболее важными осколочными ионами являются фрагменты
с m/z 45, 43, 28 и 15.
Для получения масс-спектра прежде всего необходимо ввести образец в ис-
точник ионов (гл. 1), затем перевести его молекулы в заряженную форму (по-
ложительные или отрицательные ионы, гл. 2), разделить эти ионы по массам и
зарегистрировать их массы и количество (гл. 6). В современных приборах управ-
ление всеми операциями, а также обработку результатов осуществляет компьютер,
являющийся неотъемлемой частью масс-спектрометра. На выходе можно получить
спектр в любом виде, провести вычитание или усреднение спектров, сравнение
с библиотекой масс-спектров. Принципиальная блок-схема масс-спектрометра
представлена на рис. 2.
Для решения более сложных задач (например, анализ неразделенных сме-
сей) схема процесса может быть значительно сложнее (гл. 7, тандемная масс-
спектрометрия).
Фрагментация молекулярных ионов органических соединений в масс-спектро-
метре подчиняется определенным законам (гл. 2, 3), поэтому при отсутствии
спектра анализируемого соединения в компьютерных библиотеках можно устано-
вить его молекулярную массу, состав, наличие функциональных групп, а иногда и
точную структуру по характеру фрагментации (гл. 4). Поскольку во фрагментации
родственных соединений есть много общего (гл. 10 и 11), существует возможность
интерпретации спектров вручную, хотя это и требует определенной практики
(см. задачи и их решение в гл. 13 и 14). Кроме того, масс-спектрометрия является
наиболее чувствительным методом количественного анализа органических со-
единений (гл. 12).
ГЛАВА1
СИСТЕМА ВВОДА ОБРАЗЦА
Для того чтобы избежать нежелательных химических реакций в результате взаи-
модействия молекул и ионов, в источнике большинства масс-спектрометров, как
правило, поддерживается высокий (10–5–10–6 мм рт.ст.), а иногда и сверхвысокий
(10–10 мм рт.ст.) вакуум. Поэтому уже сам ввод образца является самостоятельной
технической задачей.
1.1. Баллон напуска
Одной из первых систем ввода, практически не используемой в настоящее время,
служил баллон напуска (рис. 1.1). Анализируемое вещество находилось в газообраз-
ном состоянии (давление около 10–2 мм рт.ст.) в баллоне, внутренняя поверхность
которого объемом 50–2000 см3 была остеклена для предотвращения нежелательных
химических реакций на стенках сосуда. В поздних вариантах предусматривалась
система нагрева пробы в баллоне. Этот резервуар соединялся с источником ионов
отверстием очень небольшого диаметра, через которое осуществлялось молекуляр-
ное натекание образца в масс-спектрометр.
Альтернативными вариантами такого отверстия служили капилляры или пори-
стые диафрагмы. Такое устройство позволяло получить стабильную концентрацию
вещества в источнике. Оно было необходимо на начальных стадиях развития орга-
нической масс-спектрометрии, когда применялись малоэффективные вакуумные
системы, а скорость развертки масс-спектра составляла минуты. Очевидным недо-
статком данного ввода является необходимость переводить вещество в газовую фазу
в условиях неглубокого вакуума, что для многих образцов весьма проблематично.
Конструкции стыковки баллонов напуска с ионными источниками подробно опи-
саны в фундаментальном труде Джона Бейнона [9].
1.2. Прямой ввод
Развитие техники позволило в 60-х годах перейти на более совершенную систему
ввода, которая является общепринятой и широко распространенной в настоящее
время, хотя в приборах ХХI века эта система часто оказывается лишь опцией.
Это – прямой ввод вещества в область ионизации. Твердый образец помещается
в специальную микрокапсулу (стекло, кварц, керамика, металл), которая штоком
вводится непосредственно в ионный источник, т.е. испарение осуществляется прямо
в источнике ионов в условиях глубокого вакуума. При необходимости образец может
быть нагрет с помощью программируемой печки до температуры 400–500 °С, а в
некоторых случаях, как, например, в условиях десорбционной химической иони-
зации (разд. 5.3), – выше 1000 °С. Понятно, что в этих условиях (глубокий вакуум
и высокая температура) число соединений, переходящих в газовую фазу и становя-
щихся доступными для масс-спектрометрического анализа, значительно возрастает.
Поскольку полное испарение введенного образца в источнике позволяет измерить
количество соединения, прямой ввод дает возможность наряду с идентификацией
проводить и количественное определение веществ (гл. 12).
Важно обращать внимание не только на температуру прямого ввода, но и на
температуру источника ионов. Если вещество труднолетучее, а прямой ввод пере-
грет, оно может конденсироваться на стенках источника, что ведет к его быстрому
загрязнению. Кроме того, последовательные процессы испарения и конденсации
приводят к увеличению роли деструкции вещества и, соответственно, к искажению
масс-спектра. Процессы деструкции имеют место и в случае слишком высокой
температуры источника. Принципиальная схема прямого ввода представлена на
рис. 1.2.
Программируемый нагрев образца в вакууме позволяет решить одновремен-
но три задачи: во-первых, перевести в газовую фазу широкий круг органических
соединений; во-вторых, подобрать оптимальную температуру съемки, когда вос-
производится масс-спектр высокого качества; в-третьих, анализировать смеси со-
единений с разной степенью летучести. Такое фракционное испарение позволяет в
некоторых случаях провести достаточно быстрый качественный и количественный
анализ смеси без ее предварительного разделения.
Поскольку чувствительность метода очень высока, а прямой ввод позволяет
доставить образец в область ионизации без потерь, следует опасаться ввести слиш-
ком много вещества. Считается, что твердый образец в капилляре на конце штока
должен быть едва различим глазом. Избыточное количество образца может при-
вести к искажению масс-спектра из-за протекания ионно-молекулярных реакций
и вызвать быстрое загрязнение источника ионов. Многие масс-спектрометристы
предпочитают наносить вещество из раствора и вводят шток в источник после ис-
парения растворителя.
Еще один важный параметр для наиболее распространенных спектров электрон-
ной ионизации связан с положением образца относительно пучка электронов. Если
образец расположен достаточно далеко, его молекулы достигают пучка электронов
только после ряда последовательных столкновений со стенками источника. При
этом возрастает роль процессов термодеструкции. Однако, если поместить образец
слишком близко к пучку электронов, наконечник штока может приобрести отри-
цательный заряд и начать отталкивать электроны, что приводит к расфокусировке
пучка.
Система прямого ввода применяется в основном в сочетании с методами элек-
тронной и химической ионизации, хотя его модификации используются в случае
бомбардировки быстрыми атомами (разд. 5.10) и в ряде других случаев.
1.3. Мембранный ввод (Membrane inlet mass
spectrometry, MIMS)
Весьма полезным и перспективным является мембранный ввод (МВ) пробы. Метод
был впервые описан более полувека назад [46], а с начала 1990-х годов [47, 48] стал
применяется для проведения анализов в реальном времени. Непрерывное количе-
ственное определение с целью надежной оценки экологической ситуации, напри-
мер экотоксикантов, с помощью МВ существенно предпочтительнее дискретных
измерений классическими методами. Именно МВ позволяет установить динамику
изменения концентраций целевых аналитов за адекватный промежуток времени.
Метод основан на использовании полупроницаемых мембран, которые се-
лективно пропускают молекулы аналитов из газа или жидкости в вакуум масс-
спектрометра. Поскольку МВ не требует отбора проб, их очистки и разделения,
этот метод представляет собой хорошую альтернативу хроматомасс-спектрометрии.
Уменьшается общее время анализа, а также расход органических растворителей.
Мембрана изготавливается из органического материала и пропускает в источник
масс-спектрометра соединения, растворимые или адсорбируемые ею и облада-
ющие высоким коэффициентом диффузии в ней. Анализируемое соединение
должно быть достаточно летучим, чтобы испаряться на вакуумированной стороне
мембраны. В частности, соединения с давлением паров менее 1–3 Па с трудом
десорбируются в поток газа-носителя даже при использования нагрева. В одном
из приводимых ниже вариантов мембрана размещается вне источника ионов
(рис. 1.3) [49], в другом – капиллярная мембрана вводится непосредственно в
источник (рис. 1.4) [50].
Достоинством такого ввода является селективность в пропускании веществ
разной природы. Поскольку мембрана не пропускает воду, неорганические газы и
соли, она может использоваться для эффективного мониторинга загрязнения воз-
духа или воды органическими соединениями, а также для контроля биохимических
процессов. Например, предел обнаружения в воде для широкого круга органических
соединений с молекулярной массой ниже 300 дальтон может достигать нанограммов
в литре [51]. Возможности непрерывного мониторинга уровня органических со-
единений в воде описаны в работах [49, 52, 53], в воздухе – в работе [54], для целей
биологии и медицины – в работах [55, 56].
В последнее время появились работы, демонстрирующие эффективное исполь-
зование МВ с атмосферными методами ионизации, в частности электрораспыле-
нием (ИЭР, разд. 5.13). Новые материалы, методики с применением нагревания,
использование жидких фаз для переноса десорбированных аналитов существенно
расширили круг соединений, которые можно анализировать методом МВ. В част-
ности, разработан мембранный интерфейс на базе капиллярных полых волокон для
работы с метанолом в качестве жидкофазного носителя для доставки целевых ана-
литов в источник ИЭР [57]. В таком варианте при мониторинге в режиме реального
времени полярных и заряженных молекул достижимы пределы обнаружения до ppt.
Система может работать как в режиме постоянного потока, так и с его остановкой.
В последнем варианте удается повысить чувствительность метода. Разработанный
интерфейс был с успехом использован для детектирования лекарственных препа-
ратов, фенолов и ряда других экотоксикантов в природной воде и искусственной
моче. Авторам удалось также продемонстрировать проведение он-лайн контроля
реакции хлорирования фенола в воде [57].
В обзоре [58] представлены основные тенденции развития этого метода за
последнее десятилетие, включая новые материалы для изготовления мембран,
конфигурации интерфейсов и приемлемые методы ионизации. В обзоре приведен
также ряд успешных анализов методом МВ с использованием портативных массспектрометров (разд. 9.8). Такие масс-спектрометры весьма перспективны для
работы с объектами окружающей среды непосредственно в полевых условиях, а
также в биомедицинских исследованиях [59–61].
1.4. Газовая хроматография/масс-спектрометрия
На сегодняшний день газовая хроматография/масс-спектрометрия (хроматомасс-
спектрометрия, хромасс, ГХ/МС) является чрезвычайно широко использу
Р.А. Зубарев
Предисловие ко второму изданию
В 2013 году научная общественность отметила 100-летие масс-спектрометрии, за
дату рождения которой было решено принять выход в свет публикации Дж.Дж. Том-
сона «Rays of positive electricity». Это и много, и одновременно мало. Важно, что
масс-спектрометрия в начале XXI века не превратилась в изученный вдоль и по-
перек рутинный метод анализа с известными непреодолимыми недостатками и
ограничениями, а, напротив, развивается семимильными шагами.
Десять лет прошло с момента выхода в свет первого издания «Масс-спектрометрия
в органической химии». Это очень большой период для современной науки. Для
масс-спектрометрии – это огромный период. За это время масс-спектрометрия
стала самым востребованным методом аналитической химии, с помощью которого
выполняется наибольшее число анализов. В распоряжении исследователей по-
явились не просто новые модели, а новые типы масс-спектрометров. Орбитальные
ловушки, разработанные А.А. Макаровым, о которых фирма «Термо» впервые офи-
циально объявила в 2005 году, завоевали повсеместное признание исследователей
и стали наиболее желанными приборами масс-спектрометристов во всем мире.
Очень значительно выросла роль времяпролетных приборов. На базе сверхвысо-
кого разрешения появились новые направления науки: гуминомика, петролеомика.
Потрясающие успехи достигнуты в протеомике, метаболомике. В конце 2014 года
осуществлена посадка космического аппарата «Розетта» на комету Чурюмова – Ге-
расименко. Это выдающееся научное достижение. Среди оборудования «Розетты»
важную роль играет ROSINA – прибор для анализа ионов и нейтральных частиц,
который состоит из двух масс-спектрометров: двухфокусного магнитного сек-
торного и рефлектронного времяпролетного. Этот факт демонстрирует важность
масс-спектрометрии для современной науки, для получения наиболее надежных
экспериментальных данных. Очень интересные результаты можно получать с
помощью изотопной масс-спектрометрии. Метод масс-спектрометрической ви-
зуализации (имиджинга) позволяет изучать распределение искомых соединений
по поверхности или всему объему изучаемого объекта. Масс-спектрометрические
методы стали широко использоваться для диагностики самых разных заболеваний,
для контроля хирургических операций.
За последние 10 лет изменилась терминология. Введено более сотни новых
терминов, рекомендовано переименовать ряд существовавших названий. Даже
классический метод ионизации «электронный удар» теперь следует называть
«электронная ионизация». Возникло необычайно перспективное направление –
масс-спектрометрия с ионизацией на открытом воздухе. Создано несколько
десятков методов ионизации, которые позволяют работать с минимальной или
вообще без пробоподготовки. Это устраняет последний практический недоста-
ток масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия сегодня – это наиболее быстрый,
чувствительный и информативный метод анализа химических и биологических
соединений любой сложности: от химических элементов до биополимеров (белки,
сахара, нуклеиновые кислоты). Можно утверждать, что, если для какого-нибудь со-
единений вы не можете найти масс-спектрометрическую методику его определения,
это означает только то, что оно до сих пор не интересовало масс-спектрометристов.
Существенные успехи достигнуты в области миниатюризации. Созданы перенос-
ные масс-спектрометры весом в несколько килограммов. В результате появились
предпосылки для создания в недалеком будущем бытовых масс-спектрометров для
проверки качества пищевых продуктов, напитков, медикаментов и т.д.
Значительные перемены произошли и в российской масс-спектрометрии.
В конце 2003 года создано Всероссийское масс-спектрометрическое общество
(ВМСО), объединившее около 600 ученых более чем из 50 регионов страны, ближ-
него и дальнего зарубежья и ставшее полноправным членом международного масс-
спектрометрического общества (International Mass Spectrometry Foundation, IMSF).
ВМСО уже проведено шесть крупных масс-спектрометрических конференций с
международным участием, ежегодно проводятся школы по разным аспектам масс-
спектрометрии. С 2004 года в свет выходит журнал «Масс-спектрометрия», вклю-
ченный в список ВАК и переводимый на английский язык в качестве ежегодного
приложения к «Журналу аналитической химии». Журнал хорошо цитируется, а по
импакт-фактору РИНЦ в 2013 году он оказался на втором месте среди всех рос-
сийских журналов в области химии и на пятом в области физики. Золотые медали
ВМСО за выдающиеся заслуги в масс-спектрометрии вручены российским ученым
с мировыми именами: Б.А. Мамырину, А.А. Макарову, Л.Н. Галль, И.А. Ревель-
скому, Р.А. Зубареву. Престижные Международные премии получили наши соот-
ечественники: В.Л. Тальрозе (премия Томсона), А.А. Макаров (премии Томсона,
Брюне, Американского масс-спектрометрического общества), Р.А. Зубарев (премии
Брюне и Бимана), Ю. Ласкин (премия Бимана, премия Rising Star Award from the
Women Chemists Committee of the American Chemical Society). Золотыми медалями
Питсбургской конференции в ХХI веке награждены два масс-спектрометра: орби-
тальная ловушка фирмы «Термо», разработанная А.А. Макаровым, и времяпролет-
ный масс-спектрометр высокого разрешения HRT фирмы ЛЕКО, разработанный
А.Н. Веренчиковым и В.Б. Артаевым. За прошедшие 10 лет активизировался выпуск
специализированной масс-спектрометрической литературы на русском языке. Вы-
шедшие монографии российских авторов и переводы зарубежных изданий были
посвящены разным направлениям масс-спектрометрии [1–7].
Таким образом, изменений и новшеств накопилось так много, что выпуск ново-
го, существенно переработанного и дополненного учебного издания по органиче-
ской масс-спектрометрии стал необходим. Изменения коснулись практически всех
глав. Добавлены новые главы по ионизации на открытом воздухе, по родственным
масс-спектрометрии методам анализа, по масс-спектрометрии биологических
соединений. В тексте использована новая терминология в соответствии с реко-
мендациями ВМСО и IMSF. Большое количество иллюстративного материала
позволит легче воспринимать материал. Добавлены новые задачи, необходимые
при проведении обучающих семинаров.
Предисловие
К концу ХХ века инструментальные физико-химические методы анализа стали
неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего
в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них,
безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-
спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине,
экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т.д. Характе-
ризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать
его ЯМР и масс-спектры.
Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить ее
чувствительность, экспрессность, информативность и надежность. Для получе-
ния достоверного масс-спектра индивидуального соединения даже на рутинном
масс-спектрометре достаточно 10{sup}-9{/sup} – 10^–10 г вещества. При необходимости про-
стого детектирования конкретного соединения в смеси порог обнаружения может
быть легко снижен до 10–12–10–14 г. Использование современного оборудования и
современных методов ионизации позволяет в некоторых случаях увеличить чув-
ствительность метода еще на несколько порядков. Таким образом, «традиционная
неразрешимая» без волшебства русская задача о «поиске иголки в стоге сена» может
быть легко решена масс-спектрометрически, а обычный масс-спектрометрический
эксперимент сравним с поиском одной иголки в нескольких миллионах стогах сена.
Для получения обычного спектра электронной ионизации индивидуального
соединения необходимо затратить 1–2 минуты, а время анализа сложной смеси
органических соединений в режиме хроматомасс-спектрометрии определяется
исключительно хроматографическим временем удерживания компонентов. При
этом в памяти компьютера, являющегося неотъемлемой частью современного
масс-спектрометра, остается информация о временах удерживания, площадях
пиков, а также масс-спектры всех компонентов смеси, то есть, вводя в прибор один
микролитр сложнейшей смеси органических соединений, на «выходе» можно полу-
чить информацию о ее качественном и количественном составе. Ни один другой
метод не сочетает в себе такой экспрессности и информативности. Надежность
масс-спектрометрического анализа также очень высока, поскольку масс-спектр
является индивидуальной характеристикой конкретного вещества, отражающей
его структурные особенности.
История масс-спектрометрии насчитывает около 100 лет. Годом рождения масс-
спектрометрии можно считать 1901-й, когда немецкий физик В. Кауфман создал
первый прототип параболического масс-спектрографа для изучения «катодных
лучей», или 1913-й, когда сэр Дж. Томсон впервые спектрально увидел изотопы
неона, или 1918-й, когда А. Демпстер сконструировал первый магнитный масс-
спектрометр с источником для электронной и термической ионизации. Тем не
менее в течение первых 50 лет существования эта наука оставалась прерогативой
исключительно физиков и физико-химиков. Используя простейшие соединения,
масс-спектрометристы того времени успешно измеряли характеристики элементов,
атомов, молекул (энергии ионизации, прочности связей, точные массы элементов
и природную распространенность их изотопов).
Временем рождения органической масс-спектрометрии можно считать конец
40-х – начало 50-х годов прошлого века. Это было совсем недавно, поэтому даже
сейчас, в начале ХХI века, можно лично поговорить с классиками, стоявшими
у истоков создания этой дисциплины. После Второй мировой войны возникло
понимание, что метод можно использовать не только в качестве прецезионного
физико-математического инструмента, но и в качестве удобного способа иден-
тификации достаточно сложных соединений по набору характеристических для
них фрагментных ионов. Знание классических химических реакций органических
соединений и привлечение теорий устойчивости органических ионов позволяет
приписать фрагментам конкретные структуры, делать обобщения по аналогиям
фрагментации внутри классов органических соединений. Переход на такой уро-
вень масс-спектрометрии резко увеличил число пользователей метода и привел
к взрывному процессу развития приборного парка. Особенно важной оказалась
применимость метода для решения нефтехимических проблем. Финансовые вло-
жения нефтяных компаний значительно помогли быстрому инструментальному и
теоретическому становлению нового научного направления. Отличное издание [8],
содержащее огромный фактический материал по истории масс-спектрометрии и
богато иллюстрированное фотографиями и рисунками, вышло в свет в 2002 году
под редакцией М. Грейсона по случаю 50-летия масс-спектрометрического обще-
ства США.
Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения
двух основных проблем: идентификации и количественного определения ве-
ществ, а также изучения превращений ионизированных молекул органических
соединений в газовой фазе в ионном источнике [9]. С появлением хроматомасс-
спектрометрии, ионного циклотронного резонанса [10], систем протока после
разряда [11] возможности классического метода значительно увеличились. Соеди-
нение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом еще более расширило круг
изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» [12]
и МАЛДИ [13], появившиеся к концу ХХ века, позволили успешно работать со
сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки,
полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют
миллионы дальтон [14]. На сегодняшний день можно проанализировать соединение
практически любой сложности. В последние годы широко ведутся исследования
по анализу микроорганизмов [15], по моделированию в газовой фазе химических
реакций термолиза, фотолиза, превращений, катализируемых кислотами и основа-
ниями [16], по изучению каталитических процессов [17]. По шутливому выражению
одного из «отцов» органической масс-спектрометрии Фреда Мак-Лафферти, «если
химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, может быть,
она вообще не стоит того, чтобы на нее тратили время» [18]. Признанием важности
масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 го-
ду Нобелевской премии масс-спектрометристам Джону Фенну и Коичи Танаке.
Наряду с очевидным использованием масс-спектрометрии в органической и био-
органической химии для установления структур соединений, хроматомасс-спектро-
метрия стала сегодня основным методом идентификации и количественного опре-
деления органических загрязнений в объектах окружающей среды. Современная
химическая экология немыслима без этого метода. Изучение метаболизма лекар-
ственных средств и пестицидов в окружающей среде и живых организмах также
ведется с активным использованием масс-спектрометрии. Метод незаменим в
криминалистических исследованиях и при проведении допинг-контроля на спор-
тивных соревнованиях.
Масс-спектрометрия применяется для решения геохимических и космохими-
ческих проблем, задач комбинаторной химии, иммунологии, медицины, биологии
и т.д. Масс-спектрометрия имеет явное преимущество перед другими физико-хи-
мическими методами, поскольку в этом случае речь идет о простейших характери-
стиках вещества: массе молекулы, ее основных фрагментов и отношении количеств
этих фрагментов относительно друг друга. Это позволяет достаточно легко усвоить
основы метода и научиться работать с масс-спектрами не только подготовленным
студентам, но и школьникам старших классов, изучающим курс органической
химии. Учитывая, что расшифровка масс-спектра может быть сродни решению
головоломки типа puzzle, научиться владеть этим методом настолько же полезно,
насколько просто и увлекательно.
Тем не менее, занимаясь масс-спектрометрией органических соединений уже
более 30 лет, я постоянно сталкиваюсь с ситуацией, когда даже опытные химики-
органики пасуют перед масс-спектром, предпочитая извлечь необходимую инфор-
мацию о структуре с помощью других, более знакомых им методов. Объяснение
этому я нахожу в отсутствии учебной литературы по интерпретации масс-спектров
и спецкурсов по этой дисциплине в вузах России. Книги по масс-спектрометрии
советских авторов, изданные в 70–80-е годы прошлого века, затрагивали отдельные
аспекты органической масс-спектрометрии [19–39], причем в качестве учебной
литературы можно было бы выделить лишь пособия [24–27]. Русскоязычный чи-
татель не был знаком и с подавляющим большинством иностранных изданий. За
исключением фундаментальной пионерской монографии Джона Бейнона [9], на
русский язык были переведены лишь три книги [40–42], две из которых [40, 41] от-
носятся к 60–70-м годам ХХ века. Даже замечательный учебник Мак-Лафферти [43],
претерпевший уже четыре издания, так и не переведен на русский язык. В XXI веке
ситуация несколько изменилась. Прежде всего это связано с созданием Всероссий-
ского масс-спектрометрического общества. Его деятельность привела к написанию
и переводу современных книг по масс-спектрометрии [1–7], а также первого из-
дания этого учебного пособия [44].
Данное пособие направлено на решение двух основных задач: учебной и по-
знавательной. Можно знакомиться с материалом последовательно, а можно выбо-
рочно читать конкретные главы или разделы. Большое внимание уделено именно
работе с масс-спектром, подходам к его расшифровке с извлечением максимальной
структурной информации. Описание основных направлений фрагментации раз-
личных классов органических соединений (от алканов до белков и нуклеиновых
кислот) сопровождается задачами, аналогичными тем, с которыми сталкивается
любой исследователь, когда обращается к методу масс-спектрометрии в своих на-
учных целях. Решая эти задачи, читатель сможет закрепить теоретический материал
и успешно справляться с подобными проблемами в своей последующей научной
работе. Большое число вариантов типовых задач позволяет использовать книгу не
только для индивидуальной работы, но и для семинаров в студенческих группах.
Последнее десятилетие ХХ века ознаменовалось революционными новациями
в органической масс-спектрометрии. В данной работе наряду с описанием класси-
ческих методов ввода и ионизации образца, а также разделения и детектирования
ионов значительное место уделено теоретическим и практическим аспектам со-
временной масс-спектрометрии: электрораспылению и другим методам стыковки
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром, матрично активированной
лазерной десорбции/ионизации (гл. 5), тандемной масс-спектрометрии (гл. 7), ме-
тодам анализа, основанным или связанным с масс-спектрометрией (гл. 8), методам
ионизации без пробоподготовки (на открытом воздухе, гл. 9).
Очень важно, чтобы масс-спектрометрией владели непосредственно химики,
биологи, экологи, а не узкий круг профессиональных масс-спектрометристов. Ни-
кто не знает столь досконально свою задачу, как человек, непосредственно работаю-
щий с веществом. Если он сможет правильно поставить масс-спектрометрическую
задачу и при этом владеет техникой интерпретации масс-спектров, эффективность
его работы со спектрами будет существенно выше, чем у профессионального масс-
спектрометриста, далекого от конкретной проблемы. Недостающим звеном для
правильной расшифровки может оказаться информация о производителе исходного
реактива, о побочных процессах изучаемой реакции, о примесях к реагентам или
даже о реакции, которая ставилась в этой посуде за неделю до данного эксперимента.
Мир масс-спектрометрии удивителен и красив. Каждый год приносит новые
потрясающие открытия, появляются неординарные приложения этого метода.
Я надеюсь, читатель сможет оценить это сам.
Введение
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, заключающимся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим
разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе
соединения, его составе и структуре. Масса самого тяжелого иона в спектре, как
правило, соответствует молекулярной массе анализируемого соединения. Принято
представлять масс-спектр в виде графика или таблицы (рис. 1) .
В случае графического изображения по оси абсцисс откладывается масса ионов
(точнее, величина отношении массы иона к его заряду), а по оси ординат – их ин-
тенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. Принято выражать
интенсивность в процентах к полному ионному току (суммарной интенсивности
всех ионов в спектре) или к интенсивности максимального иона (рис. 1). В качестве
единицы размерности массы в масс-спектрометрии используются термины: угле-
родные единицы, атомные единицы массы, дальтоны [2]. Тем не менее, поскольку
по шкале абсцисс в масс-спектрах откладывается величина отношения массы к
заряду, для обозначения этой единицы измерений используется термин «томсон»
(Thomson, Th), но чаще – просто m/z [45].
Задача 1. Установите, какому распространенному органическому соедине-
нию принадлежит масс-спектр, представленный на рис. 1. Масс-спектрометрия
высокого разрешения показала, что точная молекулярная масса соединения
60,0211 дальтона, что соответствует составу С2Н4О2. Обращайте на данном эта-
пе внимание только на наиболее интенсивные пики в спектре, обусловленные
всей молекулой (m/z 60) и ее наиболее значимыми структурными фрагментами.
В данном случае наиболее важными осколочными ионами являются фрагменты
с m/z 45, 43, 28 и 15.
Для получения масс-спектра прежде всего необходимо ввести образец в ис-
точник ионов (гл. 1), затем перевести его молекулы в заряженную форму (по-
ложительные или отрицательные ионы, гл. 2), разделить эти ионы по массам и
зарегистрировать их массы и количество (гл. 6). В современных приборах управ-
ление всеми операциями, а также обработку результатов осуществляет компьютер,
являющийся неотъемлемой частью масс-спектрометра. На выходе можно получить
спектр в любом виде, провести вычитание или усреднение спектров, сравнение
с библиотекой масс-спектров. Принципиальная блок-схема масс-спектрометра
представлена на рис. 2.
Для решения более сложных задач (например, анализ неразделенных сме-
сей) схема процесса может быть значительно сложнее (гл. 7, тандемная масс-
спектрометрия).
Фрагментация молекулярных ионов органических соединений в масс-спектро-
метре подчиняется определенным законам (гл. 2, 3), поэтому при отсутствии
спектра анализируемого соединения в компьютерных библиотеках можно устано-
вить его молекулярную массу, состав, наличие функциональных групп, а иногда и
точную структуру по характеру фрагментации (гл. 4). Поскольку во фрагментации
родственных соединений есть много общего (гл. 10 и 11), существует возможность
интерпретации спектров вручную, хотя это и требует определенной практики
(см. задачи и их решение в гл. 13 и 14). Кроме того, масс-спектрометрия является
наиболее чувствительным методом количественного анализа органических со-
единений (гл. 12).
ГЛАВА1
СИСТЕМА ВВОДА ОБРАЗЦА
Для того чтобы избежать нежелательных химических реакций в результате взаи-
модействия молекул и ионов, в источнике большинства масс-спектрометров, как
правило, поддерживается высокий (10–5–10–6 мм рт.ст.), а иногда и сверхвысокий
(10–10 мм рт.ст.) вакуум. Поэтому уже сам ввод образца является самостоятельной
технической задачей.
1.1. Баллон напуска
Одной из первых систем ввода, практически не используемой в настоящее время,
служил баллон напуска (рис. 1.1). Анализируемое вещество находилось в газообраз-
ном состоянии (давление около 10–2 мм рт.ст.) в баллоне, внутренняя поверхность
которого объемом 50–2000 см3 была остеклена для предотвращения нежелательных
химических реакций на стенках сосуда. В поздних вариантах предусматривалась
система нагрева пробы в баллоне. Этот резервуар соединялся с источником ионов
отверстием очень небольшого диаметра, через которое осуществлялось молекуляр-
ное натекание образца в масс-спектрометр.
Альтернативными вариантами такого отверстия служили капилляры или пори-
стые диафрагмы. Такое устройство позволяло получить стабильную концентрацию
вещества в источнике. Оно было необходимо на начальных стадиях развития орга-
нической масс-спектрометрии, когда применялись малоэффективные вакуумные
системы, а скорость развертки масс-спектра составляла минуты. Очевидным недо-
статком данного ввода является необходимость переводить вещество в газовую фазу
в условиях неглубокого вакуума, что для многих образцов весьма проблематично.
Конструкции стыковки баллонов напуска с ионными источниками подробно опи-
саны в фундаментальном труде Джона Бейнона [9].
1.2. Прямой ввод
Развитие техники позволило в 60-х годах перейти на более совершенную систему
ввода, которая является общепринятой и широко распространенной в настоящее
время, хотя в приборах ХХI века эта система часто оказывается лишь опцией.
Это – прямой ввод вещества в область ионизации. Твердый образец помещается
в специальную микрокапсулу (стекло, кварц, керамика, металл), которая штоком
вводится непосредственно в ионный источник, т.е. испарение осуществляется прямо
в источнике ионов в условиях глубокого вакуума. При необходимости образец может
быть нагрет с помощью программируемой печки до температуры 400–500 °С, а в
некоторых случаях, как, например, в условиях десорбционной химической иони-
зации (разд. 5.3), – выше 1000 °С. Понятно, что в этих условиях (глубокий вакуум
и высокая температура) число соединений, переходящих в газовую фазу и становя-
щихся доступными для масс-спектрометрического анализа, значительно возрастает.
Поскольку полное испарение введенного образца в источнике позволяет измерить
количество соединения, прямой ввод дает возможность наряду с идентификацией
проводить и количественное определение веществ (гл. 12).
Важно обращать внимание не только на температуру прямого ввода, но и на
температуру источника ионов. Если вещество труднолетучее, а прямой ввод пере-
грет, оно может конденсироваться на стенках источника, что ведет к его быстрому
загрязнению. Кроме того, последовательные процессы испарения и конденсации
приводят к увеличению роли деструкции вещества и, соответственно, к искажению
масс-спектра. Процессы деструкции имеют место и в случае слишком высокой
температуры источника. Принципиальная схема прямого ввода представлена на
рис. 1.2.
Программируемый нагрев образца в вакууме позволяет решить одновремен-
но три задачи: во-первых, перевести в газовую фазу широкий круг органических
соединений; во-вторых, подобрать оптимальную температуру съемки, когда вос-
производится масс-спектр высокого качества; в-третьих, анализировать смеси со-
единений с разной степенью летучести. Такое фракционное испарение позволяет в
некоторых случаях провести достаточно быстрый качественный и количественный
анализ смеси без ее предварительного разделения.
Поскольку чувствительность метода очень высока, а прямой ввод позволяет
доставить образец в область ионизации без потерь, следует опасаться ввести слиш-
ком много вещества. Считается, что твердый образец в капилляре на конце штока
должен быть едва различим глазом. Избыточное количество образца может при-
вести к искажению масс-спектра из-за протекания ионно-молекулярных реакций
и вызвать быстрое загрязнение источника ионов. Многие масс-спектрометристы
предпочитают наносить вещество из раствора и вводят шток в источник после ис-
парения растворителя.
Еще один важный параметр для наиболее распространенных спектров электрон-
ной ионизации связан с положением образца относительно пучка электронов. Если
образец расположен достаточно далеко, его молекулы достигают пучка электронов
только после ряда последовательных столкновений со стенками источника. При
этом возрастает роль процессов термодеструкции. Однако, если поместить образец
слишком близко к пучку электронов, наконечник штока может приобрести отри-
цательный заряд и начать отталкивать электроны, что приводит к расфокусировке
пучка.
Система прямого ввода применяется в основном в сочетании с методами элек-
тронной и химической ионизации, хотя его модификации используются в случае
бомбардировки быстрыми атомами (разд. 5.10) и в ряде других случаев.
1.3. Мембранный ввод (Membrane inlet mass
spectrometry, MIMS)
Весьма полезным и перспективным является мембранный ввод (МВ) пробы. Метод
был впервые описан более полувека назад [46], а с начала 1990-х годов [47, 48] стал
применяется для проведения анализов в реальном времени. Непрерывное количе-
ственное определение с целью надежной оценки экологической ситуации, напри-
мер экотоксикантов, с помощью МВ существенно предпочтительнее дискретных
измерений классическими методами. Именно МВ позволяет установить динамику
изменения концентраций целевых аналитов за адекватный промежуток времени.
Метод основан на использовании полупроницаемых мембран, которые се-
лективно пропускают молекулы аналитов из газа или жидкости в вакуум масс-
спектрометра. Поскольку МВ не требует отбора проб, их очистки и разделения,
этот метод представляет собой хорошую альтернативу хроматомасс-спектрометрии.
Уменьшается общее время анализа, а также расход органических растворителей.
Мембрана изготавливается из органического материала и пропускает в источник
масс-спектрометра соединения, растворимые или адсорбируемые ею и облада-
ющие высоким коэффициентом диффузии в ней. Анализируемое соединение
должно быть достаточно летучим, чтобы испаряться на вакуумированной стороне
мембраны. В частности, соединения с давлением паров менее 1–3 Па с трудом
десорбируются в поток газа-носителя даже при использования нагрева. В одном
из приводимых ниже вариантов мембрана размещается вне источника ионов
(рис. 1.3) [49], в другом – капиллярная мембрана вводится непосредственно в
источник (рис. 1.4) [50].
Достоинством такого ввода является селективность в пропускании веществ
разной природы. Поскольку мембрана не пропускает воду, неорганические газы и
соли, она может использоваться для эффективного мониторинга загрязнения воз-
духа или воды органическими соединениями, а также для контроля биохимических
процессов. Например, предел обнаружения в воде для широкого круга органических
соединений с молекулярной массой ниже 300 дальтон может достигать нанограммов
в литре [51]. Возможности непрерывного мониторинга уровня органических со-
единений в воде описаны в работах [49, 52, 53], в воздухе – в работе [54], для целей
биологии и медицины – в работах [55, 56].
В последнее время появились работы, демонстрирующие эффективное исполь-
зование МВ с атмосферными методами ионизации, в частности электрораспыле-
нием (ИЭР, разд. 5.13). Новые материалы, методики с применением нагревания,
использование жидких фаз для переноса десорбированных аналитов существенно
расширили круг соединений, которые можно анализировать методом МВ. В част-
ности, разработан мембранный интерфейс на базе капиллярных полых волокон для
работы с метанолом в качестве жидкофазного носителя для доставки целевых ана-
литов в источник ИЭР [57]. В таком варианте при мониторинге в режиме реального
времени полярных и заряженных молекул достижимы пределы обнаружения до ppt.
Система может работать как в режиме постоянного потока, так и с его остановкой.
В последнем варианте удается повысить чувствительность метода. Разработанный
интерфейс был с успехом использован для детектирования лекарственных препа-
ратов, фенолов и ряда других экотоксикантов в природной воде и искусственной
моче. Авторам удалось также продемонстрировать проведение он-лайн контроля
реакции хлорирования фенола в воде [57].
В обзоре [58] представлены основные тенденции развития этого метода за
последнее десятилетие, включая новые материалы для изготовления мембран,
конфигурации интерфейсов и приемлемые методы ионизации. В обзоре приведен
также ряд успешных анализов методом МВ с использованием портативных массспектрометров (разд. 9.8). Такие масс-спектрометры весьма перспективны для
работы с объектами окружающей среды непосредственно в полевых условиях, а
также в биомедицинских исследованиях [59–61].
1.4. Газовая хроматография/масс-спектрометрия
На сегодняшний день газовая хроматография/масс-спектрометрия (хроматомасс-
спектрометрия, хромасс, ГХ/МС) является чрезвычайно широко использу