eng
Содержание
Содержание
Предисловие ко второму изданию ............................................................................ 11
Предисловие ............................................................................................................. 13
Введение ................................................................................................................... 17
Глава 1. Система ввода образца .............................................................................. 19
1.1.
Баллон напуска ........................................................................................... 19
1.2.
Прямой ввод ............................................................................................... 20
1.3.
Мембранный ввод (Membrane inlet mass spectrometry, MIMS) ................. 21
1.4.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия .......................................... 23
1.4.1.
Ввод пробы в систему ГХ/МС .......................................................... 23
1.4.2.
Запись масс-спектров в режиме ГХ/МС .......................................... 26
1.4.3.
ГХ×ГХ/МС ....................................................................................... 30
1.5.
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
(ЖХ/МС, LC/MS) ...................................................................................... 34
1.5.1.
Ленточный транспортер (moving belt) .............................................. 35
1.5.2.
Прямой ввод жидкости (direct liquid introduction, DLI) .................. 36
1.5.3.
Поток частиц (particle beam) ............................................................. 36
1.5.4.
Термораспыление, термоспрей (thermospray, TSP),
плазмораспыление, плазмаспрей (plasmaspray) ............................... 37
1.6.
Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия
(СФХ/МС) .................................................................................................. 38
1.7.
Капиллярный электрофорез /масс-спектрометрия, КЭ/МС
(Capillary Electrophoresis/Mass spectrometry, CE/MS) ................................ 41
1.8.
Ионная хроматография/масс-спектрометрия (ИХ/МС) ......................... 42
1.9.
Атмосферный ввод ..................................................................................... 42
Глава 2. Физические основы процессов масс-спектрометрической
фрагментации .......................................................................................................... 44
2.1.
Электронная ионизация (Electron Ionization, EI) ..................................... 44
2.2.
Физические основы масс-спектрометрической фрагментации ............... 49
2.2.1.
Квазиравновесная теория ................................................................. 50
2.2.2.
Фотодиссоциация, разрешенная во времени ................................... 54
2.3.
Метастабильные ионы ............................................................................... 55
2.4.
Полуколичественная теория фрагментации ............................................. 58
Глава 3. Основные правила и подходы к интерпретации масс-спектров ............. 59
3.1.
Стабильность ионов и нейтральных частиц .............................................. 59
3.1.1.
Правило выброса максимального алкильного радикала ................. 61
3.1.2.
Правило Стивенсона (Стивенсона – Одье) ..................................... 63
3.1.3.
Правило четноэлектронных ионов ................................................... 65
3.1.4.
Правило степеней свободы ............................................................... 66
3.1.5.
Прочность химических связей .......................................................... 67
3.1.6.
Структурные и стереохимические факторы ..................................... 68
3.1.7.
Орто-эффект ...................................................................................... 70
3.1.8.
Масс-спектрометрия хиральных соединений .................................. 72
3.2.
Концепция локализации заряда и неспаренного электрона .................... 73
3.2.1.
Фрагментация, удаленная от места локализации заряда ................. 77
Глава 4. Практические основы интерпретации масс-спектров ............................. 79
4.1.
Молекулярный ион .................................................................................... 79
4.2.
Определение элементного состава ионов на основании
изотопных пиков ........................................................................................ 82
4.2.1.
Азотное правило ................................................................................ 90
4.2.2.
Определение содержания изотопа 13С в природных образцах......... 93
4.2.3.
Расчет изотопной чистоты соединений ........................................... 94
4.3.
Область молекулярных ионов высокомолекулярных соединений .......... 96
4.4.
Фрагментные ионы .................................................................................... 99
4.4.1.
Гомологические серии ионов ............................................................ 99
4.4.2.
Выбросы простейших нейтральных частиц ....................................102
4.4.3.
Наиболее интенсивные пики в спектре ..........................................102
4.5.
Библиотеки масс-спектров .......................................................................103
4.6.
Использование для интерпретации дополнительной
масс-спектральной информации ..............................................................108
4.7.
Схема фрагментации .................................................................................112
Глава 5. Альтернативные методы ионизации образца ..........................................115
5.1.
Ионизация фотонами (Photoionization) ...................................................115
5.2.
Химическая ионизация (Chemical Ionization, CI) ....................................116
5.3.
Химическая ионизация отрицательных ионов (Negative ion
chemical ionization, NICI) ..........................................................................119
5.4.
Пульсирующая химическая ионизация (Pulsed positive,
negative ion chemical ionization mass spectrometry) ....................................121
5.5.
Десорбционная (прямая) химическая ионизация, ДХИ
(Direct (Desorption) Chemical Ionization, DCI) .........................................121
5.6.
Полевая ионизация (Field Ionization, FI) .................................................122
5.7.
Полевая десорбция (Field Desorption, FD) ...............................................123
5.8.
Тлеющий разряд (Glow discharge) .............................................................124
5.9.
Плазменная десорбционная масс-спектрометрия (Plasma desorption
mass spectrometry, PDMS) ..........................................................................125
5.10.
Бомбардировка быстрыми атомами, ББА (Fast Аtom Вombardment,
FAB); вторичноионная масс-спектрометрия, ВИМС (Secondary Ion
Mass Spectrometry, SIMS) ...........................................................................125
5.10.1.
Проточный (динамический) вариант бомбардировки
быстрыми атомами (Continuous Flow or Dinamic Fast Atom
Bombardment) .................................................................................128
5.11.
Химическая ионизация при атмосферном давлении (Atmospheric
pressure Chemical Ionization, APCI) .........................................................129
5.12.
Фотоионизация при атмосферном давлении (ФИАД)
и фотохимическая ионизация при атмосферном давлении (ФХИАД),
Atmospheric pressure photoionization (APPI), Atmospheric pressure
photochemical ionization (APPCI) .............................................................131
5.13.
Ионизация электрораспылением, электроспрей (ИЭР) .......................134
5.14.
Ионизация акустическим распылением .................................................140
5.15.
Матрично активированная лазерная десорбция/ионизация
(МАЛДИ) .................................................................................................141
5.16.
Лазерная десорбционная масс-спектрометрия (Laser desorption
mass spectrometry, LDMS) ........................................................................151
Глава 6. Разделение и регистрация ионов .............................................................154
6.1.
Магнитный секторный масс-спектрометр ...............................................154
6.2.
Электростатический анализатор. Двухфокусный секторный
масс-спектрометр ......................................................................................155
6.3.
Масс-спектрометрия высокого разрешения ............................................156
6.4.
Масс-спектрометрия с преобразованием Фурье (МС ПФ) .....................159
6.5.
Квадрупольный анализатор ......................................................................164
6.6.
Ионная ловушка ........................................................................................165
6.7.
Времяпролетный анализатор ....................................................................167
6.8.
Орбитальная ловушка (Orbitrap) ...............................................................173
6.9.
Детектирование ионов ..............................................................................176
Глава 7. Тандемная масс-спектрометрия, МС/МС ...............................................181
7.1.
Активация ионов .......................................................................................182
7.1.1.
Активация соударением или диссоциация, индуцированная
(активированная) столкновениями ................................................182
7.1.2.
Диссоциация, индуцированная столкновением
с поверхностью ................................................................................186
7.1.3.
Другие методы инициирования фрагментации ..............................188
7.1.3.1.
Диссоциация, активированная электронами .....................188
7.1.3.2.
Фотодиссоциация (Photodissociation) .................................189
7.1.4.
Последовательная тандемная масс-спектрометрия, МСn ..............191
7.2.
Анализаторы ионов в тандемной масс-спектрометрии ...........................193
7.2.1.
Система трех квадруполей ...............................................................193
7.2.2.
Магнитные секторные приборы ......................................................196
7.2.2.1.
Спектр кинетических энергий ионов,
проанализированных по массе (MIKES) ...........................196
7.2.2.2.
Высвобождение кинетической энергии
при фрагментации ...............................................................198
7.2.2.3.
Связанные сканирования ....................................................199
7.2.3.
Ионная ловушка ...............................................................................206
7.2.4.
Масс-спектрометрия с преобразованиями Фурье ..........................207
7.2.5.
Тандемная масс-спектрометрия на приборах МАЛДИ ..................208
7.2.6.
Приборы продленной геометрии ....................................................210
7.2.7.
Приборы гибридной геометрии .......................................................212
7.2.8.
Орбитальные ловушки .....................................................................214
7.3.
Автоматизированные методы записи тандемных спектров ....................215
7.4.
Инверсия заряда ........................................................................................216
7.5.
Нейтрализация-реионизация ...................................................................218
Глава 8. Методы на основе масс-спектрометрии и родственные
масс-спектрометрии ..............................................................................................221
8.1.
Пиролитическая масс-спектрометрия .....................................................221
8.2.
Реакция переноса протона ........................................................................224
8.3.
Масс-спектрометрия выбранных ионов в потоке ....................................228
8.4.
Спектрометрия ионной подвижности ......................................................230
8.4.1.
Дрейфовая спектрометрия ионной подвижности ..........................231
8.4.2.
Спектрометрия приращения ионной подвижности .......................234
8.4.3.
Спектрометр ионной подвижности на основе бегущей волны ......235
8.4.4.
Улавливающий спектрометр ионной подвижности ........................236
8.4.5.
Спектрометр ионной подвижности на основе поперечной
модуляции ........................................................................................236
8.4.6.
Варианты комплексных методов с использованием
ионной подвижности .......................................................................237
Глава 9. Масс-спектрометрия с ионизацией на воздухе
(Ambient Ionization Mass Spectrometry)..................................................................240
9.1.
Методы на основе спрея ...........................................................................242
9.1.1.
Десорбционная электрораспылительная ионизация .....................242
9.1.2.
Нано-ДЭРИ ......................................................................................245
9.1.3.
Ионизация акустическим распылением на воздухе .......................247
9.1.4.
Экстракционная электрораспылительная ионизация ....................249
9.1.5.
Спрей с бумаги .................................................................................251
9.1.6.
Спрей с листа ....................................................................................253
9.2.
Плазменные методы ..................................................................................256
9.2.1.
Прямой анализ в реальном времени ...............................................257
9.2.2.
Низкотемпературная плазма............................................................259
9.2.3.
Десорбционная химическая ионизация при атмосферном
давлении ..........................................................................................261
9.2.4.
Масс-спектрометрия с ионизацией быстрым испарением
на воздухе .........................................................................................262
9.3.
Лазерные методы .......................................................................................265
9.3.1.
Электрораспылительная лазерная десорбция/ионизация .............266
9.3.2.
Лазерная абляция с электрораспылительной ионизацией .............267
9.3.3.
Другие лазерные методы ..................................................................268
9.4.
Методы ионизации в системе ввода .........................................................269
9.5.
Количественные аспекты ионизации на воздухе .....................................271
9.6.
Проведение химических реакций методами
масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе .........................................272
9.7.
Мягкое напыление на воздухе ..................................................................275
9.8.
Использование портативных масс-спектрометров ..................................276
9.9.
Методы масс-спектрометрической (молекулярной) визуализации
(Imaging mass spectrometry) ........................................................................280
9.10.
Он-лайн контроль хирургических операций методами
масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе .......................................287
9.11.
Будущее масс-спектрометрии с ионизацией на воздухе ........................290
Глава 10. Основные направления фрагментации некоторых классов
органических соединений .....................................................................................291
10.1.
Алканы .....................................................................................................291
10.2.
Алкены и диены .......................................................................................296
10.3.
Алкины .....................................................................................................300
10.4.
Алициклические углеводороды ..............................................................302
10.4.1.
Циклоалкены ..................................................................................305
10.5.
Ароматические углеводороды .................................................................306
10.6.
Спирты, фенолы, тиолы ..........................................................................314
10.6.1.
Спирты ............................................................................................314
10.6.2.
Фенолы ...........................................................................................323
10.6.3.
Тиолы ..............................................................................................324
10.7.
Простые эфиры и сульфиды ...................................................................331
10.8.
Амины и фосфины ..................................................................................341
10.9.
Алкилгалогениды, арилгалогениды ........................................................350
10.10.
Карбонильные соединения ...................................................................360
10.11.
Карбоновые кислоты и их производные ..............................................375
10.12.
Нитрилы, изонитрилы, нитросоединения, гидразины,
оксимы и диазосоединения ...................................................................399
10.13.
Сульфоксиды, сульфоны, сульфокислоты ...........................................415
10.14.
Элементоорганические соединения .....................................................421
Глава 11. Биополимеры ..........................................................................................430
11.1.
Аминокислоты, пептиды, белки .............................................................430
11.1.1.
Масс-спектрометрия аминокислот ...............................................430
11.1.2.
Масс-спектрометрия пептидов ......................................................432
11.1.2.1.
Установление последовательности аминокислотных
звеньев ..............................................................................434
11.1.3.
Масс-спектрометрия белков ..........................................................446
11.1.3.1.
Метод идентификации белков «снизу вверх» ..................447
11.1.3.2.
Метод идентификации белков «сверху вниз» ..................450
11.1.4.
Протеомика .....................................................................................451
11.2.
Масс-спектрометрия липидов ................................................................453
11.2.1.
Триацилглицериды .........................................................................456
11.2.2.
Глицерофосфолипиды и сфинголипиды .......................................459
11.2.3.
Установление положения двойных связей в алифатических
цепях ...............................................................................................460
11.3.
Масс-спектрометрия сахаров (углеводов) ..............................................462
11.3.1.
Номенклатура фрагментных ионов сахаров ..................................464
11.3.2.
Современные методы масс-спектрометрического
анализа сахаров ..............................................................................467
11.4.
Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот ............................................469
11.4.1.
Масс-спектрометрия нуклеиновых оснований,
нуклеотидов и нуклеозидов ...........................................................469
11.4.2.
Масс-спектрометрия олигонуклеотидов ......................................470
11.4.3.
Масс-спектрометрическое секвенирование
олигонуклеотидов .........................................................................472
11.4.4.
Программное обеспечение для секвенирование
олигонуклеотидов .........................................................................475
11.4.5.
Прикладные аспекты масс-спектрометрии нуклеиновых
кислот ............................................................................................475
11.5.
Метаболомика (метабономика) ..............................................................476
11.5.1.
Инструментальные аспекты метаболомики ..................................477
11.5.2.
Варианты метаболомных исследований .......................................480
11.5.3.
Программное обеспечение метаболомики ...................................482
11.6.
Масс-спектрометрический анализ микроорганизмов ...........................483
Глава 12. Количественный масс-спектрометрический анализ ............................488
12.1.
Масс-хроматография ...............................................................................491
12.2.
Масс-фрагментография, мониторинг заданных ионов .........................502
12.3.
Мониторинг заданных реакций ..............................................................504
12.4.
Дериватизация аналитов .........................................................................506
12.5.
Установление количества соединения в образце по площади
хроматографического пика .....................................................................507
12.6.
Метод внешнего стандарта ......................................................................508
12.7.
Метод внутреннего стандарта .................................................................509
12.8.
Метод изотопного разбавления ..............................................................511
12.9.
Метод добавок .........................................................................................512
Глава 13. Обобщенные задачи................................................................................513
Глава 14. Решения задач .........................................................................................553
Приложение ............................................................................................................617
Литература ..............................................................................................................638
Список принятых и предлагаемых сокращений, русских и английских терминов,
относящихся к масс-спектрометрии ........................................................................682
Приложение 1. Инновационные подходы и аналитические решения
на основе масс-спектрометрии ................................................................................705
Приложение 2. Критерии подбора оптимальной конфигурации
ГХ/МС оборудования в зависимости от аналитической задачи ..............................721
Вся информация вселенной заложена в массе.
Р.А. Зубарев
Предисловие ко второму изданию
В 2013 году научная общественность отметила 100-летие масс-спектрометрии, за
дату рождения которой было решено принять выход в свет публикации Дж.Дж. Том-
сона «Rays of positive electricity». Это и много, и одновременно мало. Важно, что
масс-спектрометрия в начале XXI века не превратилась в изученный вдоль и по-
перек рутинный метод анализа с известными непреодолимыми недостатками и
ограничениями, а, напротив, развивается семимильными шагами.
Десять лет прошло с момента выхода в свет первого издания «Масс-спектрометрия
в органической химии». Это очень большой период для современной науки. Для
масс-спектрометрии – это огромный период. За это время масс-спектрометрия
стала самым востребованным методом аналитической химии, с помощью которого
выполняется наибольшее число анализов. В распоряжении исследователей по-
явились не просто новые модели, а новые типы масс-спектрометров. Орбитальные
ловушки, разработанные А.А. Макаровым, о которых фирма «Термо» впервые офи-
циально объявила в 2005 году, завоевали повсеместное признание исследователей
и стали наиболее желанными приборами масс-спектрометристов во всем мире.
Очень значительно выросла роль времяпролетных приборов. На базе сверхвысо-
кого разрешения появились новые направления науки: гуминомика, петролеомика.
Потрясающие успехи достигнуты в протеомике, метаболомике. В конце 2014 года
осуществлена посадка космического аппарата «Розетта» на комету Чурюмова – Ге-
расименко. Это выдающееся научное достижение. Среди оборудования «Розетты»
важную роль играет ROSINA – прибор для анализа ионов и нейтральных частиц,
который состоит из двух масс-спектрометров: двухфокусного магнитного сек-
торного и рефлектронного времяпролетного. Этот факт демонстрирует важность
масс-спектрометрии для современной науки, для получения наиболее надежных
экспериментальных данных. Очень интересные результаты можно получать с
помощью изотопной масс-спектрометрии. Метод масс-спектрометрической ви-
зуализации (имиджинга) позволяет изучать распределение искомых соединений
по поверхности или всему объему изучаемого объекта. Масс-спектрометрические
методы стали широко использоваться для диагностики самых разных заболеваний,
для контроля хирургических операций.
За последние 10 лет изменилась терминология. Введено более сотни новых
терминов, рекомендовано переименовать ряд существовавших названий. Даже
классический метод ионизации «электронный удар» теперь следует называть
«электронная ионизация». Возникло необычайно перспективное направление –
масс-спектрометрия с ионизацией на открытом воздухе. Создано несколько
десятков методов ионизации, которые позволяют работать с минимальной или
вообще без пробоподготовки. Это устраняет последний практический недоста-
ток масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия сегодня – это наиболее быстрый,
чувствительный и информативный метод анализа химических и биологических
соединений любой сложности: от химических элементов до биополимеров (белки,
сахара, нуклеиновые кислоты). Можно утверждать, что, если для какого-нибудь со-
единений вы не можете найти масс-спектрометрическую методику его определения,
это означает только то, что оно до сих пор не интересовало масс-спектрометристов.
Существенные успехи достигнуты в области миниатюризации. Созданы перенос-
ные масс-спектрометры весом в несколько килограммов. В результате появились
предпосылки для создания в недалеком будущем бытовых масс-спектрометров для
проверки качества пищевых продуктов, напитков, медикаментов и т.д.
Значительные перемены произошли и в российской масс-спектрометрии.
В конце 2003 года создано Всероссийское масс-спектрометрическое общество
(ВМСО), объединившее около 600 ученых более чем из 50 регионов страны, ближ-
него и дальнего зарубежья и ставшее полноправным членом международного масс-
спектрометрического общества (International Mass Spectrometry Foundation, IMSF).
ВМСО уже проведено шесть крупных масс-спектрометрических конференций с
международным участием, ежегодно проводятся школы по разным аспектам масс-
спектрометрии. С 2004 года в свет выходит журнал «Масс-спектрометрия», вклю-
ченный в список ВАК и переводимый на английский язык в качестве ежегодного
приложения к «Журналу аналитической химии». Журнал хорошо цитируется, а по
импакт-фактору РИНЦ в 2013 году он оказался на втором месте среди всех рос-
сийских журналов в области химии и на пятом в области физики. Золотые медали
ВМСО за выдающиеся заслуги в масс-спектрометрии вручены российским ученым
с мировыми именами: Б.А. Мамырину, А.А. Макарову, Л.Н. Галль, И.А. Ревель-
скому, Р.А. Зубареву. Престижные Международные премии получили наши соот-
ечественники: В.Л. Тальрозе (премия Томсона), А.А. Макаров (премии Томсона,
Брюне, Американского масс-спектрометрического общества), Р.А. Зубарев (премии
Брюне и Бимана), Ю. Ласкин (премия Бимана, премия Rising Star Award from the
Women Chemists Committee of the American Chemical Society). Золотыми медалями
Питсбургской конференции в ХХI веке награждены два масс-спектрометра: орби-
тальная ловушка фирмы «Термо», разработанная А.А. Макаровым, и времяпролет-
ный масс-спектрометр высокого разрешения HRT фирмы ЛЕКО, разработанный
А.Н. Веренчиковым и В.Б. Артаевым. За прошедшие 10 лет активизировался выпуск
специализированной масс-спектрометрической литературы на русском языке. Вы-
шедшие монографии российских авторов и переводы зарубежных изданий были
посвящены разным направлениям масс-спектрометрии [1–7].
Таким образом, изменений и новшеств накопилось так много, что выпуск ново-
го, существенно переработанного и дополненного учебного издания по органиче-
ской масс-спектрометрии стал необходим. Изменения коснулись практически всех
глав. Добавлены новые главы по ионизации на открытом воздухе, по родственным
масс-спектрометрии методам анализа, по масс-спектрометрии биологических
соединений. В тексте использована новая терминология в соответствии с реко-
мендациями ВМСО и IMSF. Большое количество иллюстративного материала
позволит легче воспринимать материал. Добавлены новые задачи, необходимые
при проведении обучающих семинаров.
Предисловие
К концу ХХ века инструментальные физико-химические методы анализа стали
неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего
в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них,
безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-
спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине,
экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т.д. Характе-
ризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать
его ЯМР и масс-спектры.
Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить ее
чувствительность, экспрессность, информативность и надежность. Для получе-
ния достоверного масс-спектра индивидуального соединения даже на рутинном
масс-спектрометре достаточно 10{sup}-9{/sup} – 10^–10 г вещества. При необходимости про-
стого детектирования конкретного соединения в смеси порог обнаружения может
быть легко снижен до 10–12–10–14 г. Использование современного оборудования и
современных методов ионизации позволяет в некоторых случаях увеличить чув-
ствительность метода еще на несколько порядков. Таким образом, «традиционная
неразрешимая» без волшебства русская задача о «поиске иголки в стоге сена» может
быть легко решена масс-спектрометрически, а обычный масс-спектрометрический
эксперимент сравним с поиском одной иголки в нескольких миллионах стогах сена.
Для получения обычного спектра электронной ионизации индивидуального
соединения необходимо затратить 1–2 минуты, а время анализа сложной смеси
органических соединений в режиме хроматомасс-спектрометрии определяется
исключительно хроматографическим временем удерживания компонентов. При
этом в памяти компьютера, являющегося неотъемлемой частью современного
масс-спектрометра, остается информация о временах удерживания, площадях
пиков, а также масс-спектры всех компонентов смеси, то есть, вводя в прибор один
микролитр сложнейшей смеси органических соединений, на «выходе» можно полу-
чить информацию о ее качественном и количественном составе. Ни один другой
метод не сочетает в себе такой экспрессности и информативности. Надежность
масс-спектрометрического анализа также очень высока, поскольку масс-спектр
является индивидуальной характеристикой конкретного вещества, отражающей
его структурные особенности.
История масс-спектрометрии насчитывает около 100 лет. Годом рождения масс-
спектрометрии можно считать 1901-й, когда немецкий физик В. Кауфман создал
первый прототип параболического масс-спектрографа для изучения «катодных
лучей», или 1913-й, когда сэр Дж. Томсон впервые спектрально увидел изотопы
неона, или 1918-й, когда А. Демпстер сконструировал первый магнитный масс-
спектрометр с источником для электронной и термической ионизации. Тем не
менее в течение первых 50 лет существования эта наука оставалась прерогативой
исключительно физиков и физико-химиков. Используя простейшие соединения,
масс-спектрометристы того времени успешно измеряли характеристики элементов,
атомов, молекул (энергии ионизации, прочности связей, точные массы элементов
и природную распространенность их изотопов).
Временем рождения органической масс-спектрометрии можно считать конец
40-х – начало 50-х годов прошлого века. Это было совсем недавно, поэтому даже
сейчас, в начале ХХI века, можно лично поговорить с классиками, стоявшими
у истоков создания этой дисциплины. После Второй мировой войны возникло
понимание, что метод можно использовать не только в качестве прецезионного
физико-математического инструмента, но и в качестве удобного способа иден-
тификации достаточно сложных соединений по набору характеристических для
них фрагментных ионов. Знание классических химических реакций органических
соединений и привлечение теорий устойчивости органических ионов позволяет
приписать фрагментам конкретные структуры, делать обобщения по аналогиям
фрагментации внутри классов органических соединений. Переход на такой уро-
вень масс-спектрометрии резко увеличил число пользователей метода и привел
к взрывному процессу развития приборного парка. Особенно важной оказалась
применимость метода для решения нефтехимических проблем. Финансовые вло-
жения нефтяных компаний значительно помогли быстрому инструментальному и
теоретическому становлению нового научного направления. Отличное издание [8],
содержащее огромный фактический материал по истории масс-спектрометрии и
богато иллюстрированное фотографиями и рисунками, вышло в свет в 2002 году
под редакцией М. Грейсона по случаю 50-летия масс-спектрометрического обще-
ства США.
Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения
двух основных проблем: идентификации и количественного определения ве-
ществ, а также изучения превращений ионизированных молекул органических
соединений в газовой фазе в ионном источнике [9]. С появлением хроматомасс-
спектрометрии, ионного циклотронного резонанса [10], систем протока после
разряда [11] возможности классического метода значительно увеличились. Соеди-
нение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом еще более расширило круг
изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» [12]
и МАЛДИ [13], появившиеся к концу ХХ века, позволили успешно работать со
сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки,
полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют
миллионы дальтон [14]. На сегодняшний день можно проанализировать соединение
практически любой сложности. В последние годы широко ведутся исследования
по анализу микроорганизмов [15], по моделированию в газовой фазе химических
реакций термолиза, фотолиза, превращений, катализируемых кислотами и основа-
ниями [16], по изучению каталитических процессов [17]. По шутливому выражению
одного из «отцов» органической масс-спектрометрии Фреда Мак-Лафферти, «если
химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, может быть,
она вообще не стоит того, чтобы на нее тратили время» [18]. Признанием важности
масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 го-
ду Нобелевской премии масс-спектрометристам Джону Фенну и Коичи Танаке.
Наряду с очевидным использованием масс-спектрометрии в органической и био-
органической химии для установления структур соединений, хроматомасс-спектро-
метрия стала сегодня основным методом идентификации и количественного опре-
деления органических загрязнений в объектах окружающей среды. Современная
химическая экология немыслима без этого метода. Изучение метаболизма лекар-
ственных средств и пестицидов в окружающей среде и живых организмах также
ведется с активным использованием масс-спектрометрии. Метод незаменим в
криминалистических исследованиях и при проведении допинг-контроля на спор-
тивных соревнованиях.
Масс-спектрометрия применяется для решения геохимических и космохими-
ческих проблем, задач комбинаторной химии, иммунологии, медицины, биологии
и т.д. Масс-спектрометрия имеет явное преимущество перед другими физико-хи-
мическими методами, поскольку в этом случае речь идет о простейших характери-
стиках вещества: массе молекулы, ее основных фрагментов и отношении количеств
этих фрагментов относительно друг друга. Это позволяет достаточно легко усвоить
основы метода и научиться работать с масс-спектрами не только подготовленным
студентам, но и школьникам старших классов, изучающим курс органической
химии. Учитывая, что расшифровка масс-спектра может быть сродни решению
головоломки типа puzzle, научиться владеть этим методом настолько же полезно,
насколько просто и увлекательно.
Тем не менее, занимаясь масс-спектрометрией органических соединений уже
более 30 лет, я постоянно сталкиваюсь с ситуацией, когда даже опытные химики-
органики пасуют перед масс-спектром, предпочитая извлечь необходимую инфор-
мацию о структуре с помощью других, более знакомых им методов. Объяснение
этому я нахожу в отсутствии учебной литературы по интерпретации масс-спектров
и спецкурсов по этой дисциплине в вузах России. Книги по масс-спектрометрии
советских авторов, изданные в 70–80-е годы прошлого века, затрагивали отдельные
аспекты органической масс-спектрометрии [19–39], причем в качестве учебной
литературы можно было бы выделить лишь пособия [24–27]. Русскоязычный чи-
татель не был знаком и с подавляющим большинством иностранных изданий. За
исключением фундаментальной пионерской монографии Джона Бейнона [9], на
русский язык были переведены лишь три книги [40–42], две из которых [40, 41] от-
носятся к 60–70-м годам ХХ века. Даже замечательный учебник Мак-Лафферти [43],
претерпевший уже четыре издания, так и не переведен на русский язык. В XXI веке
ситуация несколько изменилась. Прежде всего это связано с созданием Всероссий-
ского масс-спектрометрического общества. Его деятельность привела к написанию
и переводу современных книг по масс-спектрометрии [1–7], а также первого из-
дания этого учебного пособия [44].
Данное пособие направлено на решение двух основных задач: учебной и по-
знавательной. Можно знакомиться с материалом последовательно, а можно выбо-
рочно читать конкретные главы или разделы. Большое внимание уделено именно
работе с масс-спектром, подходам к его расшифровке с извлечением максимальной
структурной информации. Описание основных направлений фрагментации раз-
личных классов органических соединений (от алканов до белков и нуклеиновых
кислот) сопровождается задачами, аналогичными тем, с которыми сталкивается
любой исследователь, когда обращается к методу масс-спектрометрии в своих на-
учных целях. Решая эти задачи, читатель сможет закрепить теоретический материал
и успешно справляться с подобными проблемами в своей последующей научной
работе. Большое число вариантов типовых задач позволяет использовать книгу не
только для индивидуальной работы, но и для семинаров в студенческих группах.
Последнее десятилетие ХХ века ознаменовалось революционными новациями
в органической масс-спектрометрии. В данной работе наряду с описанием класси-
ческих методов ввода и ионизации образца, а также разделения и детектирования
ионов значительное место уделено теоретическим и практическим аспектам со-
временной масс-спектрометрии: электрораспылению и другим методам стыковки
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром, матрично активированной
лазерной десорбции/ионизации (гл. 5), тандемной масс-спектрометрии (гл. 7), ме-
тодам анализа, основанным или связанным с масс-спектрометрией (гл. 8), методам
ионизации без пробоподготовки (на открытом воздухе, гл. 9).
Очень важно, чтобы масс-спектрометрией владели непосредственно химики,
биологи, экологи, а не узкий круг профессиональных масс-спектрометристов. Ни-
кто не знает столь досконально свою задачу, как человек, непосредственно работаю-
щий с веществом. Если он сможет правильно поставить масс-спектрометрическую
задачу и при этом владеет техникой интерпретации масс-спектров, эффективность
его работы со спектрами будет существенно выше, чем у профессионального масс-
спектрометриста, далекого от конкретной проблемы. Недостающим звеном для
правильной расшифровки может оказаться информация о производителе исходного
реактива, о побочных процессах изучаемой реакции, о примесях к реагентам или
даже о реакции, которая ставилась в этой посуде за неделю до данного эксперимента.
Мир масс-спектрометрии удивителен и красив. Каждый год приносит новые
потрясающие открытия, появляются неординарные приложения этого метода.
Я надеюсь, читатель сможет оценить это сам.
Введение
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, заключающимся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим
разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе
соединения, его составе и структуре. Масса самого тяжелого иона в спектре, как
правило, соответствует молекулярной массе анализируемого соединения. Принято
представлять масс-спектр в виде графика или таблицы (рис. 1) .
В случае графического изображения по оси абсцисс откладывается масса ионов
(точнее, величина отношении массы иона к его заряду), а по оси ординат – их ин-
тенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. Принято выражать
интенсивность в процентах к полному ионному току (суммарной интенсивности
всех ионов в спектре) или к интенсивности максимального иона (рис. 1). В качестве
единицы размерности массы в масс-спектрометрии используются термины: угле-
родные единицы, атомные единицы массы, дальтоны [2]. Тем не менее, поскольку
по шкале абсцисс в масс-спектрах откладывается величина отношения массы к
заряду, для обозначения этой единицы измерений используется термин «томсон»
(Thomson, Th), но чаще – просто m/z [45].
Задача 1. Установите, какому распространенному органическому соедине-
нию принадлежит масс-спектр, представленный на рис. 1. Масс-спектрометрия
высокого разрешения показала, что точная молекулярная масса соединения
60,0211 дальтона, что соответствует составу С2Н4О2. Обращайте на данном эта-
пе внимание только на наиболее интенсивные пики в спектре, обусловленные
всей молекулой (m/z 60) и ее наиболее значимыми структурными фрагментами.
В данном случае наиболее важными осколочными ионами являются фрагменты
с m/z 45, 43, 28 и 15.
Для получения масс-спектра прежде всего необходимо ввести образец в ис-
точник ионов (гл. 1), затем перевести его молекулы в заряженную форму (по-
ложительные или отрицательные ионы, гл. 2), разделить эти ионы по массам и
зарегистрировать их массы и количество (гл. 6). В современных приборах управ-
ление всеми операциями, а также обработку результатов осуществляет компьютер,
являющийся неотъемлемой частью масс-спектрометра. На выходе можно получить
спектр в любом виде, провести вычитание или усреднение спектров, сравнение
с библиотекой масс-спектров. Принципиальная блок-схема масс-спектрометра
представлена на рис. 2.
Для решения более сложных задач (например, анализ неразделенных сме-
сей) схема процесса может быть значительно сложнее (гл. 7, тандемная масс-
спектрометрия).
Фрагментация молекулярных ионов органических соединений в масс-спектро-
метре подчиняется определенным законам (гл. 2, 3), поэтому при отсутствии
спектра анализируемого соединения в компьютерных библиотеках можно устано-
вить его молекулярную массу, состав, наличие функциональных групп, а иногда и
точную структуру по характеру фрагментации (гл. 4). Поскольку во фрагментации
родственных соединений есть много общего (гл. 10 и 11), существует возможность
интерпретации спектров вручную, хотя это и требует определенной практики
(см. задачи и их решение в гл. 13 и 14). Кроме того, масс-спектрометрия является
наиболее чувствительным методом количественного анализа органических со-
единений (гл. 12).
ГЛАВА1
СИСТЕМА ВВОДА ОБРАЗЦА
Для того чтобы избежать нежелательных химических реакций в результате взаи-
модействия молекул и ионов, в источнике большинства масс-спектрометров, как
правило, поддерживается высокий (10–5–10–6 мм рт.ст.), а иногда и сверхвысокий
(10–10 мм рт.ст.) вакуум. Поэтому уже сам ввод образца является самостоятельной
технической задачей.
1.1. Баллон напуска
Одной из первых систем ввода, практически не используемой в настоящее время,
служил баллон напуска (рис. 1.1). Анализируемое вещество находилось в газообраз-
ном состоянии (давление около 10–2 мм рт.ст.) в баллоне, внутренняя поверхность
которого объемом 50–2000 см3 была остеклена для предотвращения нежелательных
химических реакций на стенках сосуда. В поздних вариантах предусматривалась
система нагрева пробы в баллоне. Этот резервуар соединялся с источником ионов
отверстием очень небольшого диаметра, через которое осуществлялось молекуляр-
ное натекание образца в масс-спектрометр.
Альтернативными вариантами такого отверстия служили капилляры или пори-
стые диафрагмы. Такое устройство позволяло получить стабильную концентрацию
вещества в источнике. Оно было необходимо на начальных стадиях развития орга-
нической масс-спектрометрии, когда применялись малоэффективные вакуумные
системы, а скорость развертки масс-спектра составляла минуты. Очевидным недо-
статком данного ввода является необходимость переводить вещество в газовую фазу
в условиях неглубокого вакуума, что для многих образцов весьма проблематично.
Конструкции стыковки баллонов напуска с ионными источниками подробно опи-
саны в фундаментальном труде Джона Бейнона [9].
1.2. Прямой ввод
Развитие техники позволило в 60-х годах перейти на более совершенную систему
ввода, которая является общепринятой и широко распространенной в настоящее
время, хотя в приборах ХХI века эта система часто оказывается лишь опцией.
Это – прямой ввод вещества в область ионизации. Твердый образец помещается
в специальную микрокапсулу (стекло, кварц, керамика, металл), которая штоком
вводится непосредственно в ионный источник, т.е. испарение осуществляется прямо
в источнике ионов в условиях глубокого вакуума. При необходимости образец может
быть нагрет с помощью программируемой печки до температуры 400–500 °С, а в
некоторых случаях, как, например, в условиях десорбционной химической иони-
зации (разд. 5.3), – выше 1000 °С. Понятно, что в этих условиях (глубокий вакуум
и высокая температура) число соединений, переходящих в газовую фазу и становя-
щихся доступными для масс-спектрометрического анализа, значительно возрастает.
Поскольку полное испарение введенного образца в источнике позволяет измерить
количество соединения, прямой ввод дает возможность наряду с идентификацией
проводить и количественное определение веществ (гл. 12).
Важно обращать внимание не только на температуру прямого ввода, но и на
температуру источника ионов. Если вещество труднолетучее, а прямой ввод пере-
грет, оно может конденсироваться на стенках источника, что ведет к его быстрому
загрязнению. Кроме того, последовательные процессы испарения и конденсации
приводят к увеличению роли деструкции вещества и, соответственно, к искажению
масс-спектра. Процессы деструкции имеют место и в случае слишком высокой
температуры источника. Принципиальная схема прямого ввода представлена на
рис. 1.2.
Программируемый нагрев образца в вакууме позволяет решить одновремен-
но три задачи: во-первых, перевести в газовую фазу широкий круг органических
соединений; во-вторых, подобрать оптимальную температуру съемки, когда вос-
производится масс-спектр высокого качества; в-третьих, анализировать смеси со-
единений с разной степенью летучести. Такое фракционное испарение позволяет в
некоторых случаях провести достаточно быстрый качественный и количественный
анализ смеси без ее предварительного разделения.
Поскольку чувствительность метода очень высока, а прямой ввод позволяет
доставить образец в область ионизации без потерь, следует опасаться ввести слиш-
ком много вещества. Считается, что твердый образец в капилляре на конце штока
должен быть едва различим глазом. Избыточное количество образца может при-
вести к искажению масс-спектра из-за протекания ионно-молекулярных реакций
и вызвать быстрое загрязнение источника ионов. Многие масс-спектрометристы
предпочитают наносить вещество из раствора и вводят шток в источник после ис-
парения растворителя.
Еще один важный параметр для наиболее распространенных спектров электрон-
ной ионизации связан с положением образца относительно пучка электронов. Если
образец расположен достаточно далеко, его молекулы достигают пучка электронов
только после ряда последовательных столкновений со стенками источника. При
этом возрастает роль процессов термодеструкции. Однако, если поместить образец
слишком близко к пучку электронов, наконечник штока может приобрести отри-
цательный заряд и начать отталкивать электроны, что приводит к расфокусировке
пучка.
Система прямого ввода применяется в основном в сочетании с методами элек-
тронной и химической ионизации, хотя его модификации используются в случае
бомбардировки быстрыми атомами (разд. 5.10) и в ряде других случаев.
1.3. Мембранный ввод (Membrane inlet mass
spectrometry, MIMS)
Весьма полезным и перспективным является мембранный ввод (МВ) пробы. Метод
был впервые описан более полувека назад [46], а с начала 1990-х годов [47, 48] стал
применяется для проведения анализов в реальном времени. Непрерывное количе-
ственное определение с целью надежной оценки экологической ситуации, напри-
мер экотоксикантов, с помощью МВ существенно предпочтительнее дискретных
измерений классическими методами. Именно МВ позволяет установить динамику
изменения концентраций целевых аналитов за адекватный промежуток времени.
Метод основан на использовании полупроницаемых мембран, которые се-
лективно пропускают молекулы аналитов из газа или жидкости в вакуум масс-
спектрометра. Поскольку МВ не требует отбора проб, их очистки и разделения,
этот метод представляет собой хорошую альтернативу хроматомасс-спектрометрии.
Уменьшается общее время анализа, а также расход органических растворителей.
Мембрана изготавливается из органического материала и пропускает в источник
масс-спектрометра соединения, растворимые или адсорбируемые ею и облада-
ющие высоким коэффициентом диффузии в ней. Анализируемое соединение
должно быть достаточно летучим, чтобы испаряться на вакуумированной стороне
мембраны. В частности, соединения с давлением паров менее 1–3 Па с трудом
десорбируются в поток газа-носителя даже при использования нагрева. В одном
из приводимых ниже вариантов мембрана размещается вне источника ионов
(рис. 1.3) [49], в другом – капиллярная мембрана вводится непосредственно в
источник (рис. 1.4) [50].
Достоинством такого ввода является селективность в пропускании веществ
разной природы. Поскольку мембрана не пропускает воду, неорганические газы и
соли, она может использоваться для эффективного мониторинга загрязнения воз-
духа или воды органическими соединениями, а также для контроля биохимических
процессов. Например, предел обнаружения в воде для широкого круга органических
соединений с молекулярной массой ниже 300 дальтон может достигать нанограммов
в литре [51]. Возможности непрерывного мониторинга уровня органических со-
единений в воде описаны в работах [49, 52, 53], в воздухе – в работе [54], для целей
биологии и медицины – в работах [55, 56].
В последнее время появились работы, демонстрирующие эффективное исполь-
зование МВ с атмосферными методами ионизации, в частности электрораспыле-
нием (ИЭР, разд. 5.13). Новые материалы, методики с применением нагревания,
использование жидких фаз для переноса десорбированных аналитов существенно
расширили круг соединений, которые можно анализировать методом МВ. В част-
ности, разработан мембранный интерфейс на базе капиллярных полых волокон для
работы с метанолом в качестве жидкофазного носителя для доставки целевых ана-
литов в источник ИЭР [57]. В таком варианте при мониторинге в режиме реального
времени полярных и заряженных молекул достижимы пределы обнаружения до ppt.
Система может работать как в режиме постоянного потока, так и с его остановкой.
В последнем варианте удается повысить чувствительность метода. Разработанный
интерфейс был с успехом использован для детектирования лекарственных препа-
ратов, фенолов и ряда других экотоксикантов в природной воде и искусственной
моче. Авторам удалось также продемонстрировать проведение он-лайн контроля
реакции хлорирования фенола в воде [57].
В обзоре [58] представлены основные тенденции развития этого метода за
последнее десятилетие, включая новые материалы для изготовления мембран,
конфигурации интерфейсов и приемлемые методы ионизации. В обзоре приведен
также ряд успешных анализов методом МВ с использованием портативных массспектрометров (разд. 9.8). Такие масс-спектрометры весьма перспективны для
работы с объектами окружающей среды непосредственно в полевых условиях, а
также в биомедицинских исследованиях [59–61].
1.4. Газовая хроматография/масс-спектрометрия
На сегодняшний день газовая хроматография/масс-спектрометрия (хроматомасс-
спектрометрия, хромасс, ГХ/МС) является чрезвычайно широко используемым
методом органической масс-спектрометрии, хотя начиная с 90-х годов ХХ века
многочисленные варианты комбинированного метода жидкостная хроматогра-
фия/масс-спектрометрия (разд. 1.5) используются все шире и во многих областях
исcледований (особенно биомедицинских) заняли лидирующее положение.
Стыковка газового хроматографа и масс-спектрометра была абсолютно ло-
гичной, поскольку оба метода использовались для анализа смесей органических
соединений в газовой фазе и обладали приблизительно равной чувствительностью.
Единственной проблемой для объединения двух методов в едином приборе являлось
рабочее давление. Газовый хроматограф работает при атмосферном давлении, а
масс-спектрометр – в условиях глубокого вакуума. Основные принципы стыковки
были сформулированы и претворены в жизнь в 1957 году [62]. Первоначальные
проблемы, связанные с недостаточной мощностью вакуумных систем и набивными
колонками с рабочими потоками газа-носителя 30 мл/мин, решались установкой
сепараторов различного типа [9]. Эти устройства размещались между выходным
концом колонки хроматографа и ионным источником масс-спектрометра и предна-
значались для обогащения пробы анализируемым веществом за счет избирательной
откачки значительно более легкого газа-носителя (водород, гелий). Появление
более мощных вакуумных систем и капиллярных колонок с меньшими потоками
(0,5–2,0 мл/мин) значительно облегчило задачу, а замена металла или стекла, из
которых изготавливались колонки, на плавленый кварц позволила ввести конец
колонки непосредственно в ионный источник. Все это сделало метод ГХ/МС про-
стым и эффективным.
Не стоит забывать, однако, что стыковка хроматографа и масс-спектрометра
все-таки является компромиссом, поскольку давление в ионном источнике ока-
зывается несколько выше идеального, а выходное отверстие хроматографической
колонки функционирует в условиях вакуума, что несколько ухудшает хроматогра-
фическое разрешение. Подробнее об этом можно прочитать в книге Чепмена [42].
Метод прежде всего предназначен для анализа смесей органических соединений и
заключается в их разделении на колонке хроматографа с последовательным выходом
компонентов из колонки в ионный источник масс-спектрометра, где происходит их
ионизация. Хроматографисты часто рассматривают в этом случае масс-спектрометр
как детектор газового хроматографа.
1.4.1. Ввод пробы в систему ГХ/МС
Метод ГХ/МС позволяет эффективно работать с неполярными и слабополярны-
ми соединениями, обладающими при этом достаточной летучестью. Соединения
средней летучести (полулетучие) вводятся в инжектор хроматографа шприцем в
растворе в органическом растворителе. Для более летучих соединений наиболее
популярными системами ввода являются «выдувание – улавливание» (purge and
trap) и парофазный анализ (headspace).
Условное разделение органических веществ на две группы (летучие и полулету-
чие) возникло в процессе разработки методов анализа органических экотоксикан-
тов. К группе летучих органических соединений (ЛОС) отнесли малорастворимые
в воде соединения, активно переходящие в газовую фазу при выдувании их из воды
инертным газом при комнатной температуре. ЛОС содержат не более 8 атомов
углерода в молекуле и, как правило, имеют молекулярную массу менее 200 даль-
тон и температуру кипения ниже 200 °С. К ЛОС относятся галогенсодержащие
углеводороды, легкие ароматические соединения ряда бензола, кетоны, эфиры и
сероуглерод. Если вводить эти соединения в прибор в органическом растворителе,
они оказываются либо полностью скрыты пиком растворителя, либо выходят на его
хвосте. Велики их потери и при пробоподготовке, например при концентрировании
упариванием растворителя.
Метод парофазного анализа (рис. 1.5) заключается в выдерживании жидкой или
твердой пробы, которая содержит целевые аналиты, в течение некоторого времени
при определенной температуре в закрытой виале. За это время устанавливается
равновесие и ЛОС распределяются в определенном соотношении между конден-
сированной и газовой фазой. Это распределение зависит от значений константы
Генри и определяется простейшей формулой:
Р = НС,
где Р – давление паров ЛОС, С – концентрация ЛОС в жидкости, Н – константа
Генри.
Далее из газовой фазы шприцем отбирается проба (~1 мл) и вводится в инжектор
хроматографа. Такой вариант называется статическим парофазным анализом. Аль-
тернативно можно использовать шприц с иглой, покрытой адсорбирующим слоем.
При внесении этого устройства в газовую фазу (можно и непосредственно в конден-
сированную) аналиты абсорбируются на нем. Последующее введение этой иглы в
нагретый инжектор хроматографа вызывает десорбцию, а все вещества оказываются
в колонке. Варьируя состав пленки адсорбирующей фазы, можно проводить изби-
рательную сорбцию аналитов из анализируемого образца. Этот метод, называемый
твердофазной микроэкстракцией (ТФМЭ, solid phase micro extraction, SPME), стал
весьма популярным в настоящее время для анализа образцов объектов окружающей
среды, пищевых продуктов и т.д. [63].
Для увеличения чувствительности метода можно усложнить прибор и проду-
вать над конденсированной фазой, содержащей аналиты, поток инертного газа в
течение заданного времени. Этот поток далее направляется в ловушку со специ-
альным материалом, в которой происходит сорбция паров аналитов. В качестве
адсорбентов наиболее часто используются силикагель, активированный уголь
или Тенакс (полимерная смола на основе 2,6-дифенил-п-фениленоксида). В за-
висимости от природы целевых аналитов выбирается тот или иной адсорбент либо
несколько адсорбентов используется послойно. Этот вариант метода называется
динамическим парофазным анализом.
Далее резкий нагрев адсорбента, сопровождающийся подачей инертного газа,
приводит к количественному переносу десорбированных соединений в колонку
ГХ. Вариантом улавливания аналитов перед их попаданием в хроматографическую
колонку является криофокусировка. В этом случае на пути потока инертного газа,
несущего молекулы аналитов, устанавливается склянка, охлаждаемая жидким азо-
том. Большинство органических соединений конденсируется, и через некоторое
время резкий нагрев приводит к единовременному переносу всего накопленного
материала в хроматограф. Этот метод характеризуется лучшими показателями, но
технически несколько сложнее.
Метод динамического парофазного анализа очень близок популярному для анализа
водных проб методу «выдувание – улавливание». В этом варианте поток инертного
газа барботируется непосредственно через водную фазу, унося из нее целевые аналиты
(рис. 1.6). Далее вновь используется улавливание аналитов сорбентами или криофоку-
сировка. Чувствительность метода «выдувание – улавливание», как правило, выше, чем
парофазного анализа, поскольку из конденсированной фазы выдувается боjльшая часть
растворенных летучих органических соединений. Если парофазный анализ одной и той
же пробы можно проводить в нескольких повторностях, то вторичное использование
пробы в методе «выдувание – улавливание» приведет к получению значительно мень-
ших концентраций ЛОС.
1.4.2. Запись масс-спектров в режиме ГХ/МС
Если поток элюата из колонки хроматографа идет непрерывно, масс-спектрометр
работает в дискретном режиме, поскольку должен просканировать весь намеченный
диапазон масс и вернуться к начальной массе для проведения нового сканирования.
Понятно, что запись спектра (сканирование) должна осуществляться с достаточной
частотой, чтобы зарегистрировать масс-спектр каждого соединения несколько раз.
В идеале считается, что каждый хроматографический пик должен быть охаракте-
ризован 10–15 масс-спектрами. Это условие является очень важным, поскольку в
условиях ГХ концентрация вещества изменяется очень быстро. В зависимости от
того, на восходящей или нисходящей стороне хроматографического пика записан
масс-спектр, будут дискриминированы или низкие, или высокие массы (рис. 1.7).
Безусловно, лучшим будет спектр, зарегистрированный на вершине хроматогра-
фического пика (рис. 1.7в), где максимальна концентрация вещества и минимальны
ее изменения во времени. Спектры на рис. 1.7а, б значительно искажены, и библио-
течный поиск для идентификации этого компонента может быть затруднен. Жела-
тельно получить не менее 10 спектров каждого компонента смеси, а для улучшения
качества масс-спектра часто необходимо проводить усреднения и вычитания фона.
Продемонстрировать эффект вычитания фона можно на примере, представ-
ленном на рис. 1.8. В данном случае спектр, снятый у подножия хроматографи-
ческого пика, вычитается из спектра, снятого на вершине пика. Эту процедуру
осуществляет компьютер. В некоторых программах (например, ChromaTOF,
LECO) это происходит в автоматическом режиме во время компьютерной об-
работки результатов анализа. Однако в большинстве случаев оператор должен
сам выбрать номера спектров на вершине и у подножия хроматографического
пика и поручить компьютеру провести вычитание. Результирующий спектр
очищен от наложения фона и позволяет значительно улучшить индекс схо-
димости с библиотечным спектром. Очень важна скорость сканирования и
для количественного анализа. Недостаточное число сканирований приводит
к значительному искажению площади хроматографического пика (рис. 1.9).
Современные приборы позволяют сканировать спектр за 0,01–0,5 сек, что удов-
летворительно сочетается с шириной хроматогафического пика (как правило, не-
сколько секунд). Если учесть, что средний хроматомасс-спектрометрический анализ
длится 30 минут, при скорости сканирования 0,1 сек в памяти компьютера должно
остаться 18 000 спектров. Этот факт наглядно демонстрирует невозможность полу-
чения качественных результатов без стыковки прибора с мощным компьютером.
Кстати, времяпролетные спектрометры (разд. 6.7) позволяют регистрировать до
500 полных масс-спектров в секунду. Эта особенность привела к созданию быстрой
хроматомасс-спектрометрии (Rapid GC-MS), позволившей сократить время анализа
смесей в 5–10 раз [64].
На рис. 1.10 представлен пример хроматографического пика додекана в экспе-
рименте методом сверхбыстрой хроматографии. В этих условиях ширина хромато-
графического пика составила всего 100 миллисекунд. При скорости сбора данных
250 спектров в секунду можно получить корректный сигнал додекана. Однако даже
при достаточно высокой скорости сканирования в 10 спектров в секунду результат
крайне искажен. Сравните площади пиков на рис. 1.10. Количественное определе-
ние в таком варианте становится абсолютно невозможным, но и идентификация
соединения оказывается весьма проблематичной, поскольку интенсивности пиков
в зависимости от величин m/z фрагментных ионов будут сильно искажены.
Хромасс добавляет к масс-спектрометрической информации еще один очень
важный параметр – время удерживания. Именно благодаря этому параметру появ-
ляется возможность во многих случаях проводить качественный и количественный
анализ изомеров, масс-спектры которых очень похожи. На рис. 1.11б, в представ-
лены практически неразличимые спектры электронной ионизации изомерных
флуорантена и пирена. Однако времена удерживания этих соединений различаются
почти на 1 минуту (рис. 1.11а), что позволяет легко их идентифицировать.
Хромасс позволяет также детектировать ультрамикрокомпоненты на фоне вы-
соких концентраций других соединений. Для этой цели используется мониторинг
заданных ионов (разд. 12.2). Тем не менее следует отметить, что число соедине-
ний, которые можно проанализировать методом ГХ/МС, значительно меньше,
чем при использовании масс-спектрометра с прямым вводом. Действительно, в
последнем случае можно получить масс-спектр соединения, обладающего хотя
бы слабой летучестью в условиях глубокого вакуума и температуре 300–400 °С,
не говоря уже об альтернативных методах ионизации (гл. 5). В случае же ГХ/МС
необходимо, чтобы вещество прошло через колонку газового хроматографа при
атмосферном давлении и температуре 250–300 °С (в некоторых случаях до 400 °С).
Это приводит к невозможности анализа без предварительной дериватизации труд-
нолетучих, высокополярных, термолабильных соединений. Некоторые примеры
дериватизации для ГХ/МС анализа малолетучих соединений представлены в гл. 12.
1.4.3. ГХ×ГХ/МС
В случае очень сложных смесей органических соединений, например нефтепродук-
тов, или необходимости полного разделения соединений с близкими временами
удерживания очень полезным оказывается метод тандемной газовой хроматогра-
фии – масс-спектрометрии (ГХ×ГХ/МС) [65]. В этом случае разделение осущест-
вляется на двух последовательно соединенных колонках с разными свойствами
(неполярная – полярная, ахиральная – хиральная и т.д.). Например, в варианте
«неполярная – полярная» первая колонка разделяет компоненты по их темпера-
турам кипения, а вторая по полярности.
Между колонками находится криофокусировочное устройство. Первая колонка,
как правило, длинная. Она разделяет компоненты, как и в обычном методе ГХ/МС.
Однако на выходе эти компоненты попадают в охлаждаемую камеру, где собираются
в течение определенного времени (1–5 секунд). Далее резкий нагрев переводит со-
бранные вещества во вторую короткую колонку другого типа, время удерживания
аналитов в которой не превышает тех же самых 1–5 секунд. Пока вещества проходят
вторую колонку, новая порция из первой колонки накапливается в криозатворе.
В коммерческих приборах реализованы варианты с двух- и четырехступенчатыми
модуляторами [65]. Каждый компонент помимо масс-спектра характеризуется
двумя временами выхода по каждой из колонок.
ГХ×ГХ/МС хроматограммы представляют в трехмерном или двумерном (вид
сверху) варианте (рис. 1.12–1.14). В первом случае каждый пик представляет кон-
кретный компонент смеси, а объем пика пропорционален количеству данного
компонента в смеси. Такое представление очень красиво и удобно для демонстра-
ций, поскольку картинку можно поворачивать и демонстрировать под разным
углом для получения оптимального вида. Работать с хроматограммой удобнее в
двумерном варианте (рис. 1.14), поскольку пики не закрывают друг друга. Нагляд-
но представлены все компоненты образца, хотя количественные характеристики
выражены не столь ярко.
Благодаря улучшенному разделению масс-спектры компонентов оказываются
чище, а библиотечный поиск – более эффективным и надежным. При этом за один
ввод образца в прибор можно получить информацию по индивидуальному составу
смесей, содержащих несколько тысяч компонентов. Вторым важным достоинством
метода является возможность устанавливать класс соединения по его расположению
на трехмерной хроматограмме. Так, на рис. 1.13 представлена масс-хроматограмма,
построенная по ионам с m/z 55, характерным для спиртов и алкенов/нафтенов. Масс-
спектры этих классов соединений могут быть очень похожими, поскольку молекуляр-
ные ионы спиртов, будучи нестабильными, легко теряют молекулу воды, превращаясь в
соответствующие углеводороды (гл. 10). Поэтому возможны ошибки в идентификации.
Однако на рис. 1.13 видно, что спирты и нафтены выходят из второй (полярной)
колонки с разным временем удерживания. По положению хроматографического
пика можно сделать однозначный вывод о принадлежности компонента смеси.
Зачастую прикладную задачу с помощью ГХ×ГХ/МС можно решить без пол-
ной расшифровки масс-спектров всех компонентов. Например, на рис. 1.14а, б
предствлены двумерные хроматограммы ГХ×ГХ/МС анализа дизельного топлива
до и после проведения процесса десульфуризации. На рис. 1.14а в выделенных об-
ластях наблюдается большое количество пиков. Они обусловлены серусодержащими
соединениями разного типа. После проведения процесса десульфуризации эти
области оказываются пустыми, т.е. очистка прошла практически количественно
(рис. 1.14б).
Дополнительную информацию о методе ГХ×ГХ/МС можно найти в книгах
[65, 66].
В методе реакционной хроматомасс-спектрометрии перед колонкой хроматографа
или между колонкой и масс-спектрометром устанавливается реакционная камера,
в которой можно осуществлять заданные превращения анализируемых соедине-
ний. В таком варианте дериватизация, разделение и анализ компонентов пробы
осуществляются в режиме on-line. Реакционная хроматомасс-спектрометрия может
использоваться для улучшения разделения компонентов смеси или для проведения
структурных анализов. Например, дейтерирование алкенов в реакционной камере
позволяет установить положение двойной связи в молекуле [30].
Для дополнительной информации о ГХ/МС можно порекомендовать кни-
ги [7, 67].
1.5. Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
(ЖХ/МС, LC/MS)
Решить проблему анализа тяжелых, полярных и термолабильных соединений мож-
но при замене газового хроматографа на жидкостный. При всей принципиальной
очевидности такого решения создать эффективный метод ЖХ/МС оказалось не
столь простой задачей [7, 68, 69]. Наиболее сложным моментом была стыковка
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. Масс-спектрометр обычно
работает в условиях глубокого вакуума (10–6 мм рт.ст.), а скорость потока через
стандартную колонку жидкостного хроматографа составляет примерно 1 мл/мин.
Две наиболее часто используемые в современной ЖХ/МС жидкие фазы – метанол
и вода. Испаряясь в источнике ионов, 1 мл метанола образует 0,55 л пара, а 1 мл
воды – 1,24 л пара. Учитывая, что вакуумная система масс-спектрометра может
поддерживать требуемое для работы давление только в том случае, если приток
паров в ионный источник не превышает 10 мл/мин, понятно, что соединительный
узел (интерфейс) системы ЖХ/МС должен эффективно осуществлять обогащение
анализируемым соединением примерно в 100 раз. При этом надо помнить, что
проводящие жидкости могут быть причиной возникновения электрической дуги
в магнитных секторных приборах, работающих в условиях высокой разности по-
тенциалов, а нелетучие неорганические соли, используемые в качестве буфера в
хроматографии, приводят к проводящим отложениям на линзах источника ионов,
вызывая расфокусировку прибора.
Поскольку метод ЖХ/МС обычно используется для анализа полярных и мало-
летучих соединений, наиболее эффективно применение обратнофазной хрома-
тографии с неполярной неподвижной фазой и полярным растворителем (вода,
метанол, изопропанол, ацетонитрил). Тем не менее хороших результатов можно
добиться и методом прямофазной ЖХ/МС c неполярной подвижной и полярной
неподвижной фазами. Еще одним популярным вариантом для биологических проб
является жидкостная хроматография гидрофильных взаимодействий (hydrophilic interaction
liquid chromatography, HILIC), когда стационарной фазой служит полярный
недириватизованный силикагель или силикагель модифицированный полярными
аминопропильными или цианопропильными группами, а подвижная фаза состоит
из воды со смешивающимися с ней растворителями: ацетонитрил, метанол [70].
Вода мобильной фазы образует иммобилизованный слой на поверхности стацио-
нарной фазы, в котором и происходит разделение полярных и заряженных молекул
аналита. Этот метод устраняет недостатки и обратнофазной, и прямофазной ЖХ в
ее стыковке с МС, поскольку позволяет разделять высокополярные аналиты и не
использовать растворители, которые плохо стыкуются с МС в режиме атмосферных
методов ионизации.
К настоящему времени существует значительное число интерфейсов ЖХ/МС.
Часть из них уже практически не используется. Ниже представлены наиболее важ-
ные варианты. Самый популярный и эффективный метод стыковки жидкостного
хроматографа с масс-спектрометром – электрораспылительная ионизация – под-
робно представлен в разд. 5.13.
1.5.1. Ленточный транспортер (moving belt)
Исторически первым интерфейсом ЖХ – МС можно считать ленточный транс-
портер [71], появившийся в 1976 году. Принципиальная схема устройства пред-
ставлена на рис. 1.15.
Его основной конструкционной деталью является тонкая полиимидная коль-
цевая лента. Элюат из колонки хроматографа попадает на ленту, движущуюся по
направлению к источнику ионов. На пути следования он проходит вдоль инфра-
красных испарителей, которые переводят в газовую фазу значительную долю по-
движной фазы. Далее лента проходит вакуумный замок, и в условиях вакуума
остатки растворителя откачиваются насосами. В месте перегиба ленты, в ионном
источнике, находится импульсный нагреватель, который переводит в газовую фазу
молекулы образца, подвергающиеся электронной или химической ионизации. Дви-
гаясь в обратном направлении, лента очищается от избытка нанесенного образца
благодаря дополнительным испарителям, а иногда и растворителям и, теоретически,
возвращается за новой порцией элюата в исходном чистом виде.
К достоинствам метода следует отнести:
1) возможность использования стандартных библиотек масс-спектров элек-
тронной ионизации для идентификации исследуемых веществ;
2) возможность работы со стандартными колонками для жидкостной хромато-
графии, поскольку метод использует скорости потока до 1,5 мл/мин. Такие
потоки приемлемы при распылении элюата на ленту;
3) неорганические соли, используемые в качестве буфера при хроматографи-
ровании, не мешают анализу.
Тем не менее ленточные транспортеры не получили широкого признания, по-
скольку лишь незначительно расширяли круг органических соединений, доступных
масс-спектрометрическому анализу. В ионном источнике все равно требовался
термический перевод вещества в газовую фазу. Лента транспортера примерно через
10 прохождений оказывалась загрязненной, что приводило к наложению масс-
спектров друг на друга и мешало надежной идентификации. Качество спектров
и интенсивность характеристических ионов существенно зависели от количества
образца, т.е. воспроизводимость была плохой. В настоящее время ленточные транс-
портеры не используются, хотя в 70–80-х годах прошлого века этим методом было
получено много интересных результатов.
1.5.2. Прямой ввод жидкости (direct liquid introduction, DLI)
Данный метод тоже следует рассматривать, скорее, как историю масс-спектрометрии.
Он более или менее активно использовался в 80-х годах ХХ века, но уступил место
более прогрессивным техникам, основанным на аналогичном принципе. Фак-
тически все современные интерфейсы ЖХ/МС могли бы быть названы прямым
вводом жидкости. Для его реализации на выходе из хроматографической колонки
устанавливается диафрагма с отверстием 2–5 микрон (рис. 1.16). Возникающая
струя мелких капель движется с большой скоростью к источнику ионов. На пути
следования капли проходят через камеру испарения, где большая часть раство-
рителя переходит в газовую фазу. Оказываясь в источнике масс-спектрометра,
молекулы аналита подвергаются химической ионизации (разд. 5.2), тогда как
молекулы растворителя играют роль газа-реагента. Основной недостаток метода –
низкая скорость потока. Давление в источнике становится слишком высоким при
потоках более 50 мкл/мин. Поэтому требуется либо разделять поток из стандарт-
ных хроматографических колонок, уменьшая тем самым чувствительность метода
примерно в 20 раз, либо использовать узкие колонки. Кроме того, узкое отверстие
постоянно забивается, а добавки неорганических солей к подвижной фазе приво-
дят к быстрому ухудшению работы масс-спектрометра.
1.5.3. Поток частиц (particle beam)
В этом варианте интерфейса поток из колонки хроматографа направляется через
капилляр в стеклянный распылитель, где элюат превращается в облако мелких
капель, разорванных концентрическим потоком гелия. Это облако перемещается
внутри стеклянной испарительной камеры, стенки которой подогреваются, а дав-
ление поддерживается на уровне чуть ниже атмосферного. При этом происходит
частичное испарение растворителя, и размер капель уменьшается. Испарительная
камера заканчивается узким отверстием, за которым следует сепаратор молекуляр-
ного пучка с вакуумной откачкой (рис. 1.17). Вылетая из испарительной камеры,
частицы приобретают высокую скорость благодаря сужению потока. Поскольку
более тяжелые молекулы анализируемого вещества менее подвержены диффузии,
чем атомы гелия или молекулы растворителя, именно они и проходят в узкое вход-
ное отверстие сепаратора, а из него в масс-спектрометр.
Частицы анализируемого вещества далее направляются в ионный источник,
где подвергаются химической или электронной ионизации. Получение спектров
электронной ионизации является преимуществом метода, поскольку позволяет
использовать компьютерные библиотеки масс-спектров (разд. 4.5). Такой интер-
фейс может работать с потоками жидкости из хроматографа в диапазоне от 0,1 до
1,0 мл/мин. Чувствительность метода для получения полного масс-спектра лежит
на уровне единиц нанограммов (10–9 г). Этот метод фактически заменил ленточный
транспортер, хотя и не устранил недостатков, связанных с невозможностью работы
с высокомолекулярными, нелетучими и термолабильными соединениями.
1.5.4. Термораспыление, термоспрей (thermospray, TSP),
плазмораспыление, плазмаспрей (plasmaspray)
Принципиальная схема методов термораспыления и плазмараспыления представле-
на на рис. 1.18. В этом случае поток из колонки жидкостного хроматографа направ-
ляется в нагреваемый капилляр. Диаметр капилляра 0,1 мм, что значительно больше
по сравнению с отверстием для метода прямого ввода жидкости. Это устраняет случаи
закупорки – серьезный недостаток прямого ввода жидкости. Температура капил-
ляра поддерживается на уровне температуры кипения растворителя. В результате
из капилляра вырывается струя пара, которая попадает в ионизационную камеру.
В случае плазмаспрея подача напряжения на разрядный электрод или просто пучок
электронов создают условия химической ионизации (разд. 5.2), причем роль газа-
реагента играют пары растворителя.
Работая в режиме плазмаспрея, исследователи замечали, что часто удается ре-
гистрировать ионы даже в случае выключенного электрода. Анализ этого эффекта
привел к возникновению техники термораспыления. Дело в том, что некоторые
анализируемые соединения уже в растворе находятся в виде положительных или
отрицательных ионов. Добавки кислот и оснований в растворители жидкостной
хроматографии, которыми в большинстве случаев являются вода и метанол, при-
водят к протонированию или депротонированию субстрата. Появлению заряда
служат также добавки электролитов, например, ацетата аммония. Струя пара, вы-
ходящая из капилляра, представляет собой аэрозоль небольших заряженных капель.
Нагретый источник ионов и работающие вакуумные насосы заставляют эти капли
при движении уменьшаться в размере. В конечном итоге градиент поля на каплях
может достигать критических значений, что приводит к устранению сольватной
оболочки и появлению свободных ионов в газовой фазе. Выталкивающий по-
тенциал направляет эти ионы в узкое отверстие, ведущее к анализатору, а избыток
растворителя откачивается насосами (рис. 1.18).
Термоспрей и плазмаспрей применимы к потокам жидкости из хроматографа в
диапазоне от 0,5 до 2,0 мл/мин, что позволяет работать с обычными аналитическими
колонками. Следует отметить нежелательность использования в качестве буфера
нелетучих неорганических солей из-за возможного образования отложений в ис-
точнике ионов. В качестве недостатка метода можно отметить его плохую воспроиз-
водимость. Интенсивность спектра, а также наличие или отсутствие фрагментных
ионов существенно зависят от состава раствора, наличия добавок, температуры
капилляра и источника. В связи с этим очень важен выбор оптимальных условий
регистрации спектра для каждого анализируемого вещества. Чувствительность
метода лежит в очень широком диапазоне от единиц нанограммов до десятков
микрограммов. Увеличение доли пиков фрагментных ионов в спектре достигается
увеличением потенциала на выталкивающем электроде. Причиной тому становятся
более эффективные столкновения разогнанных ионов с молекулами, так как в этой
части ионного источника давление достаточно высоко.
Для ознакомления с другими существующими вариантами ЖХ/МС целесо-
образно предварительно усвоить основные методы ионизации веществ. Подробное
описание проточного варианта бомбардировки быстрыми атомами, химической
ионизации при атмосферном давлении, электрораспыления, акустического рас-
пыления представлено в гл. 5.
1.6. Сверхкритическая флюидная хроматография/
масс-спектрометрия (СФХ/МС)
Помимо газа или жидкости, подвижной фазой для хроматографического разделения
органических соединений может служить вещество, находящееся в сверхкритиче-
ском состоянии. Такой вид хроматографии был впервые предложен более полувека
назад [72]. В сверхкритической флюидной хроматографии/масс-спектрометрии
(Supercritical fluid chromatography/mass spectrometry, SFC/MS) используемое в
качестве подвижной фазы вещество можно представить как очень плотный газ.
Наиболее часто используемый диоксид углерода в таком состоянии имеет свой-
ства, промежуточные между жидкостью и газом, т.е. это плотный газ с высокой
сольватирующей способностью. Растворение образца в таком материале можно
рассматривать как процесс, родственный переводу вещества в газовую фазу, но
протекающий при достаточно низкой температуре.
Как уже отмечалось в разд. 1.5, основной проблемой стыковки жидкостного
хроматографа и масс-спектрометра является большой объем вещества (раство-
рителя), поступающего в ионный источник, что трудно совместимо с условиями
высокого вакуума в нем. В СФХ поток подвижной фазы значительно меньше, т.е.
комбинация СФХ/МС осуществима с меньшими сложностями по сравнению с
ЖХ/МС. Мобильная фаза СФХ имеет меньшую вязкость и больший коэффициент
диффузии по сравнению с фазами ЖХ. Фактически, метод является промежуточ-
ным между ЖХ/МС и ГХ/МС и в плане инструментальных требований, и в плане
свойств анализируемых соединений. Важно, что метод позволяет анализировать
более тяжелые и более термолабильные соединения по сравнению с ГХ/МС. Это
же касается полярности аналитов. В случае СФХ/МС идеальные аналиты более
полярны, чем те, для которых предпочтителен метод ГХ/МС, и менее полярны,
чем те, для которых предпочтителен метод ЖХ/МС.
В 80-х годах ХХ века казалось, что метод может существенно потеснить ЖХ/МС
благодаря большей разрешающей способности и уже существующим в то время
эффективным интерфейсам. Однако изобретение электроспрея (разд. 5.13) и
создание метода капиллярного электрофореза (разд. 1.7) отодвинули СФХ/МС на
вторые позиции. Тем не менее метод по-прежнему широко используется для ана-
лиза липидов, пестицидов, силиконов, неионогенных ПАВ, природных соединений
и т.д. Еще одним преимуществом СФХ/МС над ГХ/МС является тот факт, что в
сверхкритическом состоянии вещество, используемое в качестве подвижной фазы,
является отличным растворителем и очень эффективно экстрагирует органические
соединения разных классов из образцов пищевых продуктов, полимерных матери-
алов, биоты, объектов окружающей среды. Это существенно упрощает подготовку
проб для последующего масс-спектрометрического анализа.
Существует огромное разнообразие интерфейсов для стыковки сверхкритиче-
ского флюидного хроматографа с масс-спектрометром [73]. Для метода подходят
практически все интерфейсы, используемые в ЖХ/МС, хотя они могут быть слегка
модифицированы. Результаты часто улучшаются при увеличении полярности под-
вижной фазы, например при использовании в СФХ/МС электроспрея (разд. 5.13).
Положительным образом сказывается добавление к подвижной фазе метанола или
другого полярного органического растворителя [74]. Для улучшения разделения к
жидкостям в суперкритическом состоянии могут добавляться в качестве добавок
кислоты или основания. Это расширяет круг анализируемых соединений. В част-
ности, использование трифторуксусной кислоты в качестве добавки к подвижной
фазе СО2/метанол для предотвращения диссоциации карбоксильных групп и про-
тонирования аминогрупп позволило проводить надежный анализ самых разных по
составу пептидов с длиной цепи до 40 аминокислотных остатков [75].
Помимо электроспрея, активно используется химическая ионизация при атмо-
сферном давлении (разд. 5.11). Применение ленточного транспортера (разд. 1.5.1),
потока частиц (разд. 1.5.3) или специальных капиллярных ограничителей позволяет
работать в режимах электронной (разд. 2.1) и химической (разд. 5.2) ионизации.
Следует подчеркнуть, что в случае химической ионизации газом-реагентом служит
не СО2, а метан, изобутан или аммиак. Последний часто оказывается предпочти-
тельным, поскольку процесс ионизации аммиаком подвержен менее значительному
влиянию изменений парциального давления СО2 в процессе анализа. Это связано
прежде всего с очень низким сродством к протону молекулы углекислого газа. Не-
которое «раскрытие» ионизационной камеры, хотя и ухудшает чувствительность,
позволяет получать классические спектры электронной ионизации, а ионизация
осуществляется как напрямую, при взаимодействии молекул образца с электрона-
ми, так и в результате перезарядки при их взаимодействии с СО2
+•. Такие спектры
перезарядки (разд. 5.2) оказываются практически аналогичными обычным спек-
трам ИЭ. Их даже можно использовать для поиска по компьютерным библиотекам
масс-спектров [76].
Наибольшие успехи СФХ/МС последнего времени связаны с медициной,
прежде всего с липидным анализом. Так, родственные простагландину изопро-
станы являются продуктами окисления полиненасыщенных жирных кислот и
генерируются организмом в условиях оксидативного стресса, например в мозге
людей с болезнью Альцгеймера. Метод СФХ/МС/МС с успехом используется
для идентификации региоизомеров и энантиомеров этих соединений. Хиральная
хроматография позволяет разделить изомеры, а тандемная масс-спектрометрия
(мониторинг заданных реакций, разд. 12.3) провести их идентификацию и коли-
чественное определение [77]. Применение двумерного СФХ/СФХ/МС метода для
разделения и анализа сложных смесей рацематов фармацевтических препаратов с
многочисленными примесями продемонстрировало, что ахиральное и хиральное
разделение могут быть успешно объединены в одном последовательном процессе
как в аналитическом, так и в препаративном варианте [78]. Разработана автомати-
зированная программа для высокопроизводительного профилирования липидов
в биологических жидкостях с использованием СФХ/МС и орбитальной ловуш-
ки [79]. Молекулы липидов подвергались разделению на обычной колонке С18 не
только по длине алкильных радикалов, но и по природе головных групп. Полное
профилирование осуществляется всего за 30 минут, что доказывает эффективность
предложенного подхода. Универсальность метода продемонстрирована при созда-
нии методики одновременного детектирования и количественного определения
17 пестицидов, обладающих широким разбросом молекулярных масс (112–888)
и полярности (log Pow от –4,6 до 7,05). Время СФХ/МС/МС анализа всей группы
пестицидов, для которых обычно используется комплекс и ГХ/МС, и ЖХ/МС,
составило лишь 11 минут [80].
Обзоры последних лет посвящены общим вопросам СФХ/МС [81], ее исполь-
зованию для исследования лекарственных препаратов [82, 83] и решения проблем
липидомики [84]. Благодаря высокому хроматографическому разрешению и воз-
можности разделять изомеры, включая оптические, СФХ/МС во многих случаях
оказывается эффективнее альтернативных подходов.
1.7. Капиллярный электрофорез /масс-спектрометрия,
КЭ/МС (Capillary Electrophoresis/Mass
spectrometry, CE/MS)
Альтернативой хроматографическим методам разделения компонентов образца
перед вводом в масс-спектрометр является капиллярный электрофорез [85]. Появ-
ление капиллярного варианта электрофореза существенно повысило разрешающую
способность разделения компонентов смесей (до 107 теоретических тарелок) и, как
следствие, эффективность анализа. Логичная стыковка электрофоретического ка-
пилляра с масс-спектрометром подняла этот метод на новый уровень [86, 87]. Метод
основан на разделении заряженных компонентов смесей в кварцевом капилляре
под действием приложенного электрического поля. Наиболее распространенным
вариантом метода КЭ в стыковке с масс-спектрометрией является капиллярный
зонный электрофорез (КЗЭ), основанный на различии в электрокинетических
подвижностях заряженных частиц в электролитах. Эта подвижность определяется
зарядом частиц и сопротивлением жидкости, которая зависит от размера и формы
иона.
В данном случае можно с натяжкой говорить о принципиально другой системе
ввода образца в масс-спектрометр, потому что в качестве интерфейса используются
устройства ЖХ/МС. Наилучших результатов удалось достигнуть при использова-
нии на выходе из колонки техники электрораспыления (разд. 5.13). Существуют
интерфейсы с подачей дополнительной жидкости и без нее. Первый вариант ха-
рактеризуется меньшей чувствительностью и хорошей воспроизводимостью, а вто-
рой – повышенной чувствительностью с ухудшенной воспроизводимостью [88, 89].
Возможно также [90–92] использование техники ультразвукового распыления
(разд. 5.13). Есть большое число работ по стыковке КЭ с МАЛДИ [93, 94]. Кстати,
именно фоновые электролиты создают основную сложность в интерфейсах КЭ/МС.
Тем не менее капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия по праву считается
самостоятельным методом анализа прежде всего биологических молекул (белков,
липидов, пептидов, аддуктов с ДНК и т.д.). Очень небольшой объем проб является
преимуществом метода, когда речь идет о работе с биологическими образцами,
доступными в ограниченных количествах. Одновременно этот аспект является
и недостатком, поскольку иногда чувствительности оказывается недостаточно и
требуется проводить концентрирование исходного образца [95]. Поскольку наряду
с очень малым количеством пробы (менее 10–10 литра) капиллярный электрофорез
позволяет проводить сверхбыстрое разделение компонентов смеси с шириной
пика в несколько миллисекунд [96], необходимо осуществлять такое же быстрое
сканирование спектра. В частности, впечатляющие результаты получены при
использовании времяпролетного анализатора с ортогональным ускорением [97].
Однако следует отметить, что в качестве детектора к КЭ может быть использо-
ван масс-спектрометр любого типа, например прибор ионного циклотронного
резонанса с преобразованием Фурье [98]. Несколько сотен ссылок на различные
аспекты и приложения метода КЭ/МС в биомедицинских исследованиях можно
найти в обзорах [99–101].
1.8. Ионная хроматография/масс-спектрометрия (ИХ/МС)
Существенно реже для целей органической химии используется комбинация ионная
хроматография/масс-спектрометрия (Ion chromatography/mass spectrometry, IC/MS).
Тем не менее это весьма перспективное аналитическое направление, особенно для
целей экологии, криминалистики и биомедицинских приложений [102, 103]. Метод
наиболее полезен для неорганических и органических ионов с низкими величинами
m/z, когда другие методы разделения оказываются не столь эффективными.
Первые публикации по этому направлению появились в середине 1990-х го-
дов [104, 105]. Методами ионизации в большинстве случаев оказываются электро-
распыление (разд. 5.13) или индуктивно связанная плазма [106]. В последнем
случае ИХ разделяет конкретные формы элементов в образцах, тогда как масс-
спектрометрический анализ без предварительного разделения позволяет установить
лишь интегральные уровни химических элементов. В качестве примера можно
привести количественное определение в образцах серусодержащих анионов S2–,
SO3
2–, SO4
2– и S2O3
2– [107] или ряда галогенсодержащих анионов [108].
Помимо катионов металлов и неорганических анионов, ИХ/МС может с
успехом применяться и для анализа органических ионов. В частности, пределы
детектирования 100 нг/л при регистрации анионов галогенуксусных кислот полу-
чены методом ИХ/ИЭР/МС [109]. С этими побочными продуктами хлорирования
питьевой воды не так просто работать классическими методами ГХ/МС и ЖХ/МС.
Методика количественного определения восьми органических кислот методом
ИХ/МС описана в работе [110].
Существует несколько вариантов ионной хроматографии. Их обсуждение вы-
ходит за рамки данного пособия. В частности, вариантом анализа ИХ/МС является
формирование ионных ассоциатов, когда, например, из двухзарядного аниона
получают устойчивый продукт с трехзарядным катионным реагентом. В результате
образуется аналит с большей массой, который можно определять в режиме реги-
страции положительных ионов [111, 112].
Поскольку современная ионная хроматография позволяет за один ввод об-
разца работать и с катионами, и с анионами, эффективно использование масс-
спектрометров с чередующейся регистрацией положительных и отрицательных
ионов [104, 105, 113]. Очень песпективен для ИХ/МС вариант капиллярной ионной
хроматографии [114], устраняющий проблемы стыковки со стандартным источником
ИЭР. Хотя на первый взгляд кажется, что масс-спектрометрия высокого разрешения
не должна иметь значительных преимуществ для работы с низкомолекулярными
соединениями, недавние исследования с использованием орбитальных ловушек
продемонстрировали улучшенную чувствительность и надежность идентификации
и количественного определения органических и неорганических анионов [115, 116].
1.9. Атмосферный ввод
Самой простой системой ввода является атмосферный (капиллярный) ввод. Если
мы соединим источник ионов с атмосферой открытым капилляром, то благодаря
вакууму внутри масс-спектрометра через этот капилляр будут поступать молекулы
и ионы самых разных соединений в газообразном или аэрозольном состоянии.
Все современные методы ионизации на открытом воздухе (гл. 9) работают именно
с атмосферным вводом, при этом открытый конец капилляра должен находиться
в непосредственной близости от области образования ионов. Капилляр может
изготавливаться из самых разных материалов, а его длина может достигать не-
скольких метров, что в некоторых случаях остро необходимо. Например, при масс-
спектрометрическом контроле проведения хирургических операций открытый
конец каппиляра закреплен на электроскальпеле хирурга, т.е. достаточно далеко
от масс-спектрометра [117]. Если в работе используется обычный лабораторный
масс-спектрометр, то современные насосы успешно справляются с откачкой. Не-
сколько сложнее обстоит дело с портативными масс-спектрометрами, хотя и здесь
есть эффективные решения [59].
ГЛАВА 2
ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРОЦЕССОВ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ
Поскольку масс-спектрометрия имеет дело с положительными или отрицательными
ионами, после ввода вещества в прибор необходимо провести ионизацию молекул
образца. На сегодняшний день существует более сотни методов ионизации. Часть
из них используется очень активно, часть – только в единичных экспериментах.
Популярность метода может достигать максимума в какой-то момент времени, а
затем с появлением новых, более эффективных, сходить на нет.
2.1. Электронная ионизация (Electron Ionization, EI)
Среди различных методов ионизации особое положение занимает ионизация
электронами (ИЭ). Исторически это первый метод ионизации органических со-
единений. Он же остается и наиболее распространенным на сегодняшний день.
Основными достоинствами метода являются надежность и универсальность.
Кроме того, в существующих компьютерных библиотеках масс-спектров (WILEY
и NIST) используются именно спектры ИЭ. Теории масс-спектрометрической
фрагментации и подходы к интерпретации спектров, о которых идет речь в этой
главе и последующих (гл. 3, 4), также базируются в основном на первоначальном
образовании молекулярного катион-радикала в результате электронной ионизации.
Старое название метода – электронный удар – несколько не соответствова-
ло действительности. Реального удара электронов по молекуле не происходит.
Электрон, пролетая вблизи молекулы, возбуждает ее электронную оболочку. Соб-
ственные электроны молекулы перемещаются на более высокие орбитали и могут
покинуть молекулу. В связи с этим термин «электронный удар» недавно официально
заменен на «электронную ионизацию» или «ионизацию электронами».
Пучок электронов генерируется катодом (проволока или пластина из рения
или вольфрама) и ускоряется потенциалом 12–70 В по направлению к аноду
(рис. 2.1). Вещество в газовой фазе (давление 10–5–10–6 мм рт.ст.) взаимодействует
с электронами и ионизируется. Формально можно представить процесс ионизации
уравнением (2.1):
M + ē = M+• + 2ē (2.1)
В результате образуется молекулярный ион (М+•). Это – нечетноэлектронный
ион, т.е. катион-радикал. Эффективность ионизации очень низка. Ионизируется при-
мерно одна из десяти тысяч молекул образца. Более 99,99% неионизованных молекул
вещества откачивается из источника вакуумными насосами. Этот факт тем не менее
позволяет еще раз подчеркнуть высочайшую чувствительность масс-спектрометрии,
поскольку для получения спектра нужны пикограммовые (10–12) количества вещества.
Эффективность ионизации меняется от вещества к веществу. Эта характеристика
соединения имеет количественный показатель, называемый сечением ионизации.
Важным параметром является энергия ионизирующих электронов. График зави-
симости ионного тока (количество образующихся ионов) от энергии ионизирующих
электронов представлен на рис. 2.2. Ионный ток достигает максимума при энергиях
электронов около 50 эВ. Именно такая энергия использовалась в советских приборах
1960–1970-х годов. Однако уже более 40 лет стандартные масс-спектры ИЭ во всем
мире принято регистрировать, используя ионизирующие электроны с энергией
около 70 эВ. Именно такая энергия, помимо высокой эффективности ионизации,
дает возможность получать и наболее стабильные спектры. Пучок электронов не
монохроматичен, причем разброс по энергиям, как правило, очень велик и может
достигать 5 эВ. Это приводит к тому, что условия взаимодействия вещества с низ-
коэнергетическими электронами (крутая часть графика на рис. 2.2) нестабильны, а
соответственно, не стабилен и масс-спектр. Чем меньше угол наклона кривой эф-
фективности ионизации в какой-либо точке, тем выше стабильность масс-спектра,
поэтому высокоэнергетическая часть кривой предпочтительна. Уменьшение энергии
от 70 эВ приведет к меньшей стабильности спектра, а увеличение – к меньшей чув-
ствительности. Следует также отметить, что все существующие библиотеки, включая
последнюю версию наиболее популярной библиотеки NIST14, созданы на базе
масс-спектров, полученных при энергиях ионизирующих электронов 70 эВ.
Для того чтобы молекула образца потеряла свой электрон, необходима энергия
ионизирующих частиц выше какого-то определенного критического значения.
Эта энергия характеристична для каждого индивидуального соединения и называется
энергией ионизации (ЭИ). Поскольку каждая молекулярная или атомная орбиталь имеет
свою собственную энергию, молекула имеет несколько значений энергии иониза-
ции (см. метод фотоэлектронной спектроскопии [118]). В масс-спектрометрии под
энергией ионизации подразумевается минимальная энергия, требуемая для потери
наиболее доступного электрона, т.е. энергия высшей занятой молекулярной орбитали.
Величина ЭИ для большинства органических соединений лежит в диапазоне 6–12 эВ.
Если энергия электронов, эмиттируемых катодом, ниже ЭИ, ионизация образца не-
возможна, и масс-спектра не будет.
В процессе ионизации молекулярный ион получает избыточную внутреннюю
энергию в диапазоне 0–20 эВ. Эта избыточная энергия равномерно распределяется
по всем связям, причем превышение энергии какой-либо связи ведет к ее разрыву с
отщеплением нейтральной радикальной частицы и образованием четноэлектронно-
го осколочного (фрагментного) иона. Вторым важнейшим процессом фрагментации
являются перегруппировки с выбросом нейтральной молекулы и образованием
нечетноэлектронного (катион-радикала) перегруппировочного иона. Минимальная
энергия ионизирующих электронов, при которой в масс-спектре, помимо молеку-
лярного, будет регистрироваться фрагментный ион, называется энергией появления
(ЭП) данного иона. Чем выше энергия ионизирующих электронов, тем большее
число направлений распада М+• реализуется, причем, если внутренняя энергия
осколочного иона остается высокой, могут идти вторичные процессы его распада.
Принимая во внимание, что различия в ЭП осколочных ионов очень незначи-
тельны, небольшие изменения энергии ионизирующих электронов могут приво-
дить к весьма существенным изменениям в масс-спектре. Если учесть отсутствие
монохроматичности пучка ионизирующих электронов, понятно, что оптимальные
условия получения спектра достигаются при энергиях электронов 50–70 эВ, когда
максимален выход ионов, минимален наклон кривой эффективности ионного
тока (рис. 2.2), а также задействованы все возможные направления распада М+•.
Наряду с однозарядными, образуются двух- и многозарядные ионы. Количество
многозарядных ионов существенно меньше, чем однозарядных, и зависит прежде
всего от структуры молекул образца, а также от условий эксперимента. Например,
повышенным выходом многозарядных ионов характеризуются полициклические
ароматические углеводороды (разд. 10.5).
В некоторых случаях, когда хотят увеличить интенсивность пика М+•, снимают
спектр, используя ионизирующие электроны с энергией 12–20 эВ. Следует подчер-
кнуть, что в этом случае возрастает только относительная интенсивность пика М+• и
пиков перегруппировочных ионов по отношению к интенсивности пиков осколоч-
ных ионов, тогда как абсолютная интенсивность всех пиков в спектре падает. Кроме
того, происходит потеря определенной информации, так как не все направления
фрагментации реализуются в таких условиях. Это положение проиллюстрирова-
но на рис. 2.3. Видно, что при уменьшении энергии ионизирующих электронов
уменьшается число и интенсивность пиков в спектре, а относительная доля моле-
кулярного иона возрастает. Хотя М+• становится максимальным в спектре, растет
именно относительное количество этих ионов, а абсолютное количество становится
меньше, чем при 70 эВ, поскольку падение интенсивностей осколочных ионов идет
значительно активнее. Нормирование спектра в результате осуществляется по М+•
и создается впечатление, что его интенсивность становится значительно выше.
Важный вывод, который следует помнить: если пик молекулярного иона отсутствует
в масс-спектре, полученном при энергии ионизирующих электронов 70 эВ, его не будет
и при меньшей энергии электронов. В этом случае можно говорить о нестабильности
молекулярного иона данного соединения. Кстати, значительное число органических
соединений характеризуется нестабильными молекулярными ионами в условиях
ИЭ [119]. Это один из существенных недостатков данного метода ионизации.
Стоит отметить, что, если снизить внутреннюю энергию молекул образца до ми-
нимума, можно получать интенсивные пики молекулярных ионов даже при работе
с алканами (при обычных условиях съемки они ничтожно малы либо вообще от-
сутствуют). Например, метод ГХ/МС с интерфейсом ультразвуковых молекулярных
пучков [120] позволяет получать спектры алканов, в которых молекулярные ионы
имеют 100% интенсивность (рис. 2.4). Это достигается направлением элюата, разбав-
ленного струей гелия, из колонки в источник открытого типа с большой скоростью
(до 100 мл/мин). При расширении в вакууме кинетическая энергия пучка возрастает,
а внутренняя (колебательная) понижается в связи с «охлаждением» аналитов до тем-
пературы нескольких десятков градусов Кельвина. В отсутствие столкновений с горя-
чими стенками источника большая часть образующихся молекулярных ионов имеет
энергию, недостаточную для протекания фрагментации. Подробнее о методе ГХ/МС
с интерфейсом ультразвуковых молекулярных пучков можно прочитать в обзоре [65].
В условиях ионизации электронами наряду с положительными образуются и
отрицательные ионы (молекулярные анион-радикалы). К сожалению, качество
спектров отрицательных ионов в этом случае оставляет желать лучшего. В част-
ности, доминирующий пик в спектре зачастую обусловлен малоинформативным
ионом (Cl–, F–, CN–). Кроме того, выход отрицательных ионов значительно мень-
ше, чем положительных. Тем не менее информация, заключенная в масс-спектрах
отрицательных ионов, может служить хорошим дополнением к полученной с ис-
пользованием положительных ионов. Детали фрагментации молекулярных анион-
радикалов основных классов органических соединений, полученных в условиях
ИЭ, подробно рассмотрены в работе [121].
Качество и информативность спектров отрицательных ионов можно повысить
при использовании электронов с малыми (тепловыми) энергиями. Метод называ-
ется резонансный захват электрона и заключается в ассоциации электрона одной из
молекулярных орбиталей молекулы образца [35]. Как правило, ионы образуются
в нескольких резонансных областях с захватом электронов с энергиями 0–10 эВ.
Эти области могут характеризоваться разными выходами ионов и разными на-
правлениями фрагментации молекулярных анион-радикалов. Например, молекулы
4-циано-5-гидрокси-1,2,3-триазола и изомерного 2-диазо-2-цианоацетамида захва-
тывают электроны в четырех резонансных областях энергий: 0,1; 1,5; 5,0 и 7,5 эВ,
причем в трех последних ионные токи оказываются на 2–3 порядка ниже [122].
Наличие нескольких резонансных областей придает масс-спектру дополнительное
измерение, поскольку каждое химическое соединение, фактически, характеризу-
ется несколькими масс-спектрами. Этот факт открывает хорошие перспективы
по масс-спектрометрической идентификации структурно близких соединений.
К сожалению, эти потенциальные возможности резонансного захвата электрона
реализованы на сегодняшний день далеко не в полной мере, хотя в последнее вре-
мя метод электронного захвата все шире и эффективнее используется для анализа
биологических молекул [123, 124]. Другим примером использования электронного
захвата является метод селективного определения соединений, содержащих гетеро-
атомы, в нефти. Он основан на разности энергий электронов, которые захватываются соединениями разных типов. Если большинство углеводородов нефти захва-
тывают электроны только с энергиями более 10 эВ, то гетероатомные компоненты
образуют анион-радикалы при взаимодействии с электронами, энергия которых
приближается к нулю [125].
Возвращаясь к классическому варианту спектров ионизации электронами,
можно отметить, что, поскольку давление в источнике ионов в условиях ИЭ
10–5–10–6 мм рт.ст., а образец можно нагревать до нескольких сот градусов, в газо-
вую фазу переходят многие органические соединения. Тем не менее у ионизации
электронами есть существенные недостатки. Метод не пригоден для анализа
термолабильных, высокомолекулярных, труднолетучих соединений. В спектрах
ИЭ многих веществ пик М+• имеет низкую интенсивность либо вообще отсутству-
ет [119]. Широкий разброс по энергиям ионизирующих электронов не позволяет
с достаточной точностью определять характеристики молекул и ионов (энергии
появления и ионизации). Работа над устранением этих недостатков привела к
созданию представительного ряда альтернативных методов ионизации (гл. 5).
2.2. Физические основы масс-
спектрометрической фрагментации
Существует ряд более или менее строгих подходов к описанию процессов образо-
вания и фрагментации молекулярных ионов. К сожалению, на сегодняшний день
ни один из них не может надежно предсказать массовые числа и интенсивности
пиков всех ионов в спектре даже достаточно простых органических соединений. Во
избежание чрезмерного углубления в физику и математику в данном разделе будут от-
ражены лишь основные подходы, преимущества и недостатки существующих теорий.
Практически любой процесс генерирования заряженной частицы сопряжен с
передачей ей дополнительной внутренней энергии. В частности, в случае наиболее
распространенного (и наиболее жесткого) метода ионизации, каким является ио-
низация электронами, образующиеся молекулярные ионы могут иметь избыточную
энергию в диапазоне 0–20 эВ. Для химии растворов 20 эВ на частицу означало
бы, что энергия системы составляет порядка 2000 кДж/моль, т.е. значительно
выше энергии реакционных частиц, образуемых в растворах. Распределение об-
разовавшихся молекулярных ионов по энергиям (верхняя часть рис. 2.5) можно
представить в виде вероятностной функции Р(Е). Эта кривая в определенной мере
напоминает фотоэлектронный спектр данной молекулы. В растворах в результате
столкновений происходит усреднение энергии частиц. В ионизационной камере
масс-спектрометра все определяется процессом ионизации. В случае, например,
химической ионизации (гл. 5) достаточно высокое давление в источнике приво-
дит к многочисленным столкновениям ионов, радикалов и молекул, т.е. можно
говорить об определенном усреднении их внутренней энергии. Напротив, условия
высокого вакуума при использовании ионизации электронами препятствуют стол-
кновениям частиц, и судьба образовавшегося иона зависит исключительно от той
внутренней энергии, которую он приобрел в результате ионизации. Именно эта
энергия определяет то, что одна часть ионов достигнет детектора без фрагмента-
ции, другая в виде каких-либо перегруппировочных ионов, третья – каких-либо
осколочных ионов, четвертая – фрагментных ионов второго поколения и т.д. Сле-
дует подчеркнуть, что, поскольку речь идет о мономолекулярных реакциях изоли-
рованных частиц, живущих очень короткое время, набор и количество продуктов
реакции определяются прежде всего кинетическими, а не термодинамическими
факторами.
Здесь имеет смысл напомнить, что молекулярный ион образуется в результате
ионизации молекулы (потеря электрона). Его величина m/z соответствует молеку-
лярной массе соединения (за минусом массы электрона, что необходимо учитывать,
используя масс-спектрометрию высокого разрешения). Фрагментные ионы об-
разуются при распаде молекулярного. Осколочные ионы образуются в результате
простых разрывов связей. Перегруппировочные ионы наряду с разрывами связей
требуют образования новых связей между атомами (группами), не связанными
напрямую в исходной молекуле.
2.2.1. Квазиравновесная теория
В 1952 году практически одновременно возникли две теории, направленные на
интерпретацию мономолекулярных реакций в газовой фазе в условиях глубокого
вакуума. Розенштоком [126] было предложено физическое описание процессов
в источнике масс-спектрометра. Эта теория была названа квазиравновесной,
поскольку постулировала, что за 10–12 секунды избыточная энергия равномерно
распределяется по всем связям в молекуле, точнее, по всем энергетическим состо-
яниям молекулярного иона, т.е. квазиравновесие между всеми этими состояниями
достигается до того, как начнется фрагментация. Вероятности путей фрагментации
определяются только энергией и структурой каждого конкретного иона, а не методом
ионизации, механизмом образования или структурой предшественника (для фраг-
ментных ионов). Исключения связаны, как правило, с простейшими молекулами,
случаями далеко отстоящих друг от друга возбужденных электронных состояний
и быстрыми (k >1011) процессами распада. Близкая КРТ теория описывает про-
цессы в нейтральных молекулах. Она была названа по фамилиям ее авторов Райса,
Рампсберга, Касселя и Маркуса РРКМ [127].
Обе теории базируются на определенных допущениях.
1. Вращательные, колебательные, электронные и поступательные движения
частиц независимы друг от друга.
2. Движения ядер могут быть описаны уравнениями классической механики,
хотя и с учетом квантовохимических коррекций.
3. Все микросостояния частиц равновероятны, т.е. энергия равновероятно рас-
пределяется по всем степеням свободы иона.
4. Существует энергетическая граничная поверхность, разделяющая ионы-пред-
щественники и ионы-продукты. Эта поверхность может пересекаться только
в одном направлении, т.е. для любого иона-предшественника достижение
этого переходного состояния означает необратимый распад с образованием
продуктов.
Основная задача теорий – расчет скоростей фрагментации частиц с разрывом
любой химической связи в зависимости от избытка внутренней энергии. Рассмо-
трим несколько подробнее ионизацию электронами. Сам процесс потери электрона
нейтральной молекулой протекает за 10–16 секунды. По принципу Франка – Кондо-
на [128] расстояния между ядрами при этом не изменяются. Колебания ядер могут
начаться через 10–12–10–13 секунды. После ионизации молекулярные ионы могут
оказаться на любых уровнях всех возбужденных (вращательных, колебательных,
электронных) состояний. Важно, что ион в возбужденном электронном состо-
янии живет не более 10–8 секунды. За это время в результате излучательных или
безызлучательных процессов ион переходит в основное электронное состояние,
либо фрагментирует. Поскольку время присутствия ионов в источнике иониза-
ции электронами 10–6 секунды, около 99% времени ион находится там в основном
электронном состоянии. Когда, представляя схему фрагментации, указывают заряд
иона на конкретном атоме, это не означает, что в результате ионизации электрон
удален именно из этого места. Речь идет об изображении иона в основном электрон-
ном состоянии.
Вероятность какой-либо трансформации (изомеризация, фрагментация) мо-
лекулярного иона зависит от его внутренней энергии (рис. 2.5 нижняя часть), т.е.
от константы скорости k(E) конкретной реакции. Та часть молекулярных ионов,
энергия которых ниже критической энергии (Е0) для самой низкоэнергетической
реакции фрагментации, регистрируется в виде М+•. Предположим, что молеку-
лярный ион соединения АВХY может распадаться с разрывом центральной связи
В–Х, или претерпевать перегруппировку с образованием химической связи между
ранее несвязанными А и Y (схема 2.1).
Вернемся к рис. 2.5. Если Е(М+•) < Е0(АY+•), ион стабилен и регистрируется
как М+•. Обозначим как Е1/2(АY+•) такую энергию, при которой ровно половина
М+• фрагментирует с образованием АY+•, а половина остается в виде М+•. Анало-
гично Е1/2(АВ+) соответствует энергии, при которой половина М+• фрагментирует
с образованием АУ+•, а половина – с образованием АВ+, т.е. для представленного
на рис. 2.5 случая все молекулярные ионы с энергией выше Е1/2(АВ+) будут рас-
падаться с образованием АВ+, так как в этой точке скорость образования АВ+
становится выше скорости образования АY+•. Формально, площади под кривыми
на рис. 2.5 с обозначениями М+•, АY+•, АВ+ соответствуют долям тока этих ионов
в полном ионном токе. Однако необходимо подчеркнуть, что эти доли являются
начальными. Для вычисления реальной интенсивности соответствующих пиков
в масс-спектре необходимо учитывать вторичные процессы фрагментации этих
первичных ионов.
При изменении распределения внутренней энергии М+• (функция Р(Е)) вид
масс-спектра может существенно меняться. Некоторые реакции частично или
полностью подавляются более выгодными для данной энергии ионов. Изменением
распределения Р(Е) объясняется, в частности, изменение спектра ИЭ при снижении
энергии ионизирующих электронов (рис. 2.3).
Один из вариантов записи масс-спектрометрической информации в графиче-
ском виде представлен на рис. 2.6. Пусть молекулярный ион АВХY+• фрагментирует
(схема 2.1) в результате простого разрыва связи (ион АВ+) или с перегруппировкой
(ион АY+•). Рисунок 2.6 демонстрирует изменение спектра с изменением внутренней
энергии М+•. Вертикальное сечение позволяет получить масс-спектр при конкрет-
ном значении энергии М+•.
Как видно из рис. 2.5 и 2.6, реакция с низшей Е0 далеко не всегда приводит к
наиболее интенсивному фрагментному иону. Для рассматриваемой молекулы АВХY
реакция образования иона АY+• имеет предпочтительную энтальпию, в то время как
энтропийный фактор благоприятствует возникновению иона АВ+. Действительно,
в первом случае рвутся две связи (АВ и ХY) и две связи (АY и ВХ) образуются, т.е.
энергетические затраты невелики. Во втором случае происходит разрыв одной связи
(ВХ), но новых связей не образуется. С другой стороны, стерические требования в
первом случае значительно строже. Ион АВ+ может образоваться, как только связь
ВХ будет обладать достаточной для разрыва колебательной энергией, а для возникнове-
ния иона АY+• необходим подход А к Y с искажением валентных углов на достаточное
для образования новой связи расстояние, что реализуется лишь для небольшой ча-
сти многочисленных конформаций М+•, имеющих достаточную для такого процесса
энергию. Этот простой пример демонстрирует конкуренцию различных направлений
фрагментации и объясняет сложность масс-спектров в случае многоатомных молекул.
Изменение потенциальной энергии вдоль координаты реакции для простого
разрыва связи и перегруппировки представлено на рис. 2.7. Для реакции простого
разрыва связей (рис. 2.7, левая часть) обратный процесс протекает практически
всегда без энергии или с минимальной энергией активации (Er), а для перегруп-
пировок (рис. 2.7, правая часть) обратный процесс может иметь значительную
энергию активации.
Ранее были введены определения энергии ионизации (ЭИ) молекулы и энергии
появления (ЭП) иона. Если для установления ЭП(АY+•) фиксировать появление в
спектре пика иона АY+•, будет измерена не Е0(АY+•), а Е1/2(АY+•). Величина Е1/2 – Е0
называется кинетическим сдвигом. Обычно он невелик (0,01–0,1 эВ), но для орга-
нических молекул может достигать величин до 2 эВ. Для случая АВ+ измерение
Е0(АВ+) еще больше усложнено, поскольку дополнительно к кинетическому сдвигу
возникает так называемый конкурентный сдвиг; при Е < Е1/2(АВ+) М+• будет пред-
почтительно фрагментировать с образованием АY+•.
Для больших молекул ситуация несколько отличается, поскольку внутренняя
тепловая энергия, распределенная по многочисленным степеням свободы, зна-
чительно больше. В частности, для белковой молекулы с молекулярной массой
8400 Да она составит примерно 30 эВ при 430 К [129]. Кинетические сдвиги для
белковых молекул очень велики. Они могут превосходить Е0 на 5 эВ. Например,
при поверхностно-индуцированной диссоциации пептидов (8-членные с массой
около 1000) с Е0 около 1,3, чтобы увидеть фрагментный ион, внутренняя энергия
должна была быть повышена на 8 эВ [130].
Тем не менее следует отметить, что масс-спектрометрическое измерение ЭИ,
ЭП и сродства к электрону в сочетании с известными термохимическими характе-
ристиками нейтральных частиц позволяет вычислять теплоты образования ионов и
энергии связей. Масс-спектрометрически можно изучать нестабильные радикалы
и получать информацию об энергиях химических связей, недостижимую при ис-
пользовании других методов.
Измерение ЭП фрагментных ионов является важным методом установления их
структур. Пусть необходимо установить структуру иона АВ+, образующегося при
распаде АВХY+•. Если ионы такого же состава были изучены ранее (например, при
их образовании из АВСD+•, АВ2Y+• и т.д.) и для них были установлены структуры
и теплоты образования, необходимо измерить ЭП иона АВ+, образующегося из
АВХY+•, и рассчитать теплоту его образования по уравнению (2.2):
ΔH(АВ+) = ЭП + ΔH(АВХY) – ΔH(ХY) (2.2)
Совпадение полученной величины ΔH(АВ+) с аналогичной величиной для иона
АВ+ известной структуры, полученного в результате другого процесса, является
весомым свидетельством в пользу их единой структуры. Понятно, что, если вели-
чина ΔH(АВ+) значительно отличается от ΔH всех изученных ранее ионов АВ+,
можно утверждать, что исследуемый ион обладает другой структурой. Развитие
компьютерных расчетов с помощью эмпирических методов или ab inicio позволило
проверять приписываемые ионам структуры при сравнении экспериментальных и
расчетных величин теплот их образования.
2.2.2. Фотодиссоциация, разрешенная во времени
Метод фотодиссоциации, разрешенной во времени (Time-Resolved Photodissociation,
TRPD), предложен Данбаром [131] для измерения кинетики медленных про-
цессов диссоциации, инициированных фотонами, и расчетов соответствующих
пороговых энергий на базе измеренных скоростей диссоциации [132]. Метод
применяется к ион-радикалам, генерированным фотоионизацией из нейтральных
молекул в газовой фазе. Перевод в газовую фазу обычно осуществляется лазерной
десорбцией [133]. Фотодиссоциативный импульс прикладывается после термали-
зации ионов-предшественников и удаления всех фрагментов, образовавшихся в
процессе фотоионизации. Длина волны для фотодиссоциации выбирается таким
образом, чтобы передать молекуле известное количество внутренней энергии для
инициирования фрагментации по конкретному хромофору. Хорошо подобранная
частота фотодиссоциативного импульса приводит к появлению единственного
фрагмента. Общая внутренняя энергия диссоциирующего иона принимается равной
E* = Ephoton + Etermal. Спектры записываются с различными временными задержками,
а относительные интенсивности фрагментных ионов регистрируются относительно
времени задержки. Таким образом строится кривая TRPD. Метод позволяет из-
мерять константы скоростей в диапазоне от 1 до 106 с–1.
Например, образование иммониевого иона лейцина из катион-радикалов ис-
ходных LeuTyr и LeuLeuTyr характеризуется константами скорости 4,8 × 103 с–1 и
2,9 × 102 с–1 соответственно. Существенно более низкая скорость для большего
пептида объясняется внутримолекулярным перераспределением колебательной
энергии, т.е. рандомизацией полученной энергии перед диссоциацией. Это со-
гласуется с теорией РРКМ, согласно которой рандомизация энергии предшествует
фрагментации.
Термохимическая информация может быть извлечена из кривых TRPD при
их моделировании с использованием расчетов РРКМ в комбинации с квантово-
химической теорией [133]. В частности, для примера иммониевого иона лейцина
достигнуто отличное совпадение между экспериментальной и рассчитанной на
основании кривых TRPD величиной E0 = 1,4 эВ и ΔS‡ = 64–77 Дж/моль × К.
Возможности современных методов для определения величин энергий разрыва
химических связей в катионах представлены в обзоре [134].
2.3. Метастабильные ионы
Кинетический сдвиг при определении ЭП обусловлен тем, что осколочный ион
появляется в масс-спектре только из тех М+•, энергия которых достаточна для
протекания соответствующей реакции с константой скорости не ниже 106. Однако
существует возможность регистрировать процессы с константой скорости 105. Де-
ло в том, что ион покидает источник ионизации электронами за 10–6 секунды, но
достигает детектора за 10–5 секунды, т.е., обладая достаточной энергией, он может
фрагментировать по пути следования.
Рассмотрим, как будет регистрироваться этот ион, называемый метастабиль-
ным, в магнитном секторном приборе. Пусть ион m1
+ покидает ионный источник,
ускоряется напряжением V и распадается с образованием иона m2
+ и нейтральной
частицы m3
0 в бесполевом пространстве между источником и магнитным анализа-
тором.
m1
+ → m2
+ + m3
0
Пусть vn скорость иона с массой mn. Тогда в бесполевом пространстве право-
мерны уравнения сохранения энергии и момента количества движения:
m1v1
2 = m2v2
2 + m3v3
2 (2.3)
m1v1 = m2v2 + m3v3 (2.4)
Так как m1 = m2 + m3, оба уравнения могут быть справедливы только в случае
v1 = v2 = v3, т.е. в первом приближении можно считать, что продукты фрагментации
движутся в том же направлении и с теми же скоростями, что и ион-предшественник.
Магнитный сектор масс-спектрометра является анализатором моментов. Поэтому
метастабильный ион с реальной массой m2 и скоростью v1 будет регистрироваться
вместе со стабильным ионом m*, обладающим скоростью v*, при равенстве их
моментов (уравнение (2.5)).
m*v* = m2v1 (2.5)
Уравнение (2.6) справедливо для любого стабильного иона.
.
2 2
* * 2
1 1
2
eV
m v m v
(2.6)
Исходя из двух уравнений (2.5) и (2.6), получаем уравнение (2.7) для расчета
регистрируемой массы метастабильного иона:
m
(2.7)
Таким образом, метастабильный ион, образующийся в первом бесполевом про-
странстве однофокусного магнитного масс-спектрометра, будет регистрироваться в
спектре с кажущейся массой, рассчитываемой по уравнению (2.7). Метастабильные
ионы проявляются в спектре в виде слабых уширенных пиков. Низкая интенсив-
ность обусловлена незначительной долей молекулярных ионов, энергия которых
благоприятствует их распаду вне источника. Даже наиболее низкоэнергетический
процесс (перегруппировка с образованием иона АY+•, рис. 2.5) приводит к слабому
пику метастабильного иона. Для более высокоэнергетических реакций образование
стабильного иона в результате менее энергоемкого процесса выгоднее образования
альтернативных метастабильных ионов. Пики последних могут вообще не наблю-
даться в спектре. Уширение пика метастабильного иона связано с высвобождением
части внутренней энергии при фрагментации. Эта энергия переходит в кинетиче-
скую, причем направление приращения может быть от полностью совпадающего до
прямо противоположного относительно скорости движения распадающегося иона.
Регистрация в спектре метастабильного иона очень полезна, поскольку по-
зволяет доказать протекание конкретной реакции, связывающей ион-продукт и
ион-предшественник. Схемы масс-спектрометрической фрагментации считаются
надежно доказанными, если они подтверждены пиками метастабильных ионов.
С другой стороны, пики метастабильных ионов ухудшают разрешение в спектре.
В зависимости от количества энергии, выделяющейся при фрагментации в бес-
полевом пространстве, форма пиков метатабильных ионов может быть разной
(рис. 7.5). К сожалению, эти пики исчезают из спектра в результате его компью-
терной обработки.
Так как электростатический анализатор пропускает ионы в зависимости от их
энергии, метастабильные ионы, обладающие меньшей энергией по сравнению со
стабильными, через него не проходят. Тем не менее пики метастабильных ионов
проявляются в масс-спектре, полученном на двухфокусном приборе прямой гео-
метрии (разд. 6.2), если фрагментация идет во втором бесполевом пространстве
после прохождения электростатического анализатора.
Многие масс-спектрометры позволяют работать в режиме получения спектров
исключительно метастабильных ионов с дефокусировкой стабильных. В данном
случае речь идет о варианте тандемной масс-спектрометрии (гл. 7). Так можно
получать все виды спектров (ионов-продуктов, ионов-предшественников, выбро-
сов идентичных нейтральных частиц). Такие спектры позволяют устанавливать
направления фрагментации, решать структурные задачи. Однако интенсивность
сигналов и даже наличие или отсутствие пиков конкретных ионов в спектрах зависит
от энергии ионов-предшественников. Поэтому в отличие от спектров активации
соударением (разд. 7.1) различия в спектрах метастабильных ионов-продуктов двух
ионов-предшественников не обязательно свидетельствуют об их разной структуре.
Примером использования метастабильных ионов может служить масс-спектро-
метрическое исследование N-фенил-4-циано-5-гидрокси-1,2,3-триазола [135].
Ионы [M–N2]+• триазолов обычно циклизуются в азирины [136] (схема 2.2). Однако
спектр метастабильных ионов-продуктов свидетельствует о том, что одним из на-
правлений фрагментации [M–N2]+• ионов N-фенил-4-циано-5-гидрокси-1,2,3-
триазола является отщепление радикала NCO•. Такой процесс невозможен для
азирина и заставляет предположить более сложную трансформацию первичного
иона [M–N2]+•, например образование оксиндола при взаимодействии радикаль-
ного центра с бензольным ядром (схема 2.2).
Метастабильные ионы позволяют также получать важную физико-химическую
информацию. Например, Кукс [137] предложил метод определения основности
молекул, базирующийся на спектрах метастабильных ионов. Он основан на срав-
нении скоростей конкурентных реакций фрагментации метастабильных ионов
(cхема 2.3).
В1Н+ + В2 ← В1НВ2
+ → В2Н+ + В1
Схема 2.3
Поскольку у таких реакций частотные факторы должны быть идентичными, их
скорости определяются исключительно энергиями активации конкурентных про-
цессов. Так как энергия активации обратных процессов (ион-молекулярная реакция
без перегруппировки) ничтожно мала, разница в энергиях активации определяется
исключительно разницей в сродстве к протону соответствующих оснований.
Если в источнике химической ионизации генерировать ионы В1НВ2
+ и выделить
их с помощью магнитного анализатора, можно исследовать их фрагментацию в бес-
полевом пространстве, регистрируя продукты метастабильного распада в электро-
статическом анализаторе (гл. 7). Различие в интенсивностях пиков B1H+ и В2Н+
соответствует различию их величин сродства к протону, а следовательно, позволяет
сравнивать основности молекул. Благодаря тому, что метастабильные ионы обла-
дают минимальной энергией возбуждения, достаточной для фрагментации, метод
обладает высочайшей чувствительностью, причем лучшие результаты получаются
для наиболее близких по силе оснований, так как интенсивности соответствующих
пиков в спектре оказываются близки по интенсивности.
2.4. Полуколичественная теория фрагментации
К сожалению, строгая математизированная теория (КРТ или РРКМ) не применима
к реальным органическим соединениям. За исключением простейших молекул эти
подходы требуют слишком большого времени даже для современной компьютерной
базы. Кроме того, значительные ошибки могут быть вызваны незнанием реальных
структур ни ионов-предшественников, ни ионов-продуктов, ни переходного со-
стояния. Распределение энергии по связям также не очевидно. Максимальным
успехом строгих физических теорий можно считать расчеты спектров легких алканов
(пропан, бутан), т.е. простейших молекул с одним типом химических связей. Воз-
можно, в будущем с созданием следующих поколений компьютеров эти проблемы
удастся преодолеть.
Существует упрощенная полуколичественная КРТ теория описания процессов
фрагментации более сложных молекул. Для расчета констант скоростей реакций
распада используется уравнение (2.8):
(2.8)
где k – константа скорости, v – частотный фактор, Е – избыток внутренней энергии,
Е0 – критическая энергии конкретной реакции, N – число осцилляторов.
Частотный фактор обратно пропорционален мере стерических затруднений в
активированном комплексе (переходном состоянии) и фактически является чис-
ленной характеристикой изменения энтропии в процессе. Для простого разрыва
связи он принимается равным ее колебательной частоте (ИК-спектроскопия).
Для перегруппировочного процесса требуется конкретное расположение атомов
в пространстве, что приводит к уменьшению величины v. Число осцилляторов в
молекуле, содержащей n атомов, рассчитывается по формуле: N = 3n – 6. Однако
на практике оказывается, что не все осцилляторы равноценны, и величина k завы-
шается. Поэтому число осцилляторов обычно уменьшают в три раза.
При использовании этой упрощенной теории для расчета интенсивностей фраг-
ментных ионов в спектре нельзя забывать про вторичные процессы распада этих
ионов при наличии у них достаточной внутренней энергии. Интенсивность пика
иона в спектре зависит и от скорости его образования, и от скорости его распада.
Р.А. Зубарев
Предисловие ко второму изданию
В 2013 году научная общественность отметила 100-летие масс-спектрометрии, за
дату рождения которой было решено принять выход в свет публикации Дж.Дж. Том-
сона «Rays of positive electricity». Это и много, и одновременно мало. Важно, что
масс-спектрометрия в начале XXI века не превратилась в изученный вдоль и по-
перек рутинный метод анализа с известными непреодолимыми недостатками и
ограничениями, а, напротив, развивается семимильными шагами.
Десять лет прошло с момента выхода в свет первого издания «Масс-спектрометрия
в органической химии». Это очень большой период для современной науки. Для
масс-спектрометрии – это огромный период. За это время масс-спектрометрия
стала самым востребованным методом аналитической химии, с помощью которого
выполняется наибольшее число анализов. В распоряжении исследователей по-
явились не просто новые модели, а новые типы масс-спектрометров. Орбитальные
ловушки, разработанные А.А. Макаровым, о которых фирма «Термо» впервые офи-
циально объявила в 2005 году, завоевали повсеместное признание исследователей
и стали наиболее желанными приборами масс-спектрометристов во всем мире.
Очень значительно выросла роль времяпролетных приборов. На базе сверхвысо-
кого разрешения появились новые направления науки: гуминомика, петролеомика.
Потрясающие успехи достигнуты в протеомике, метаболомике. В конце 2014 года
осуществлена посадка космического аппарата «Розетта» на комету Чурюмова – Ге-
расименко. Это выдающееся научное достижение. Среди оборудования «Розетты»
важную роль играет ROSINA – прибор для анализа ионов и нейтральных частиц,
который состоит из двух масс-спектрометров: двухфокусного магнитного сек-
торного и рефлектронного времяпролетного. Этот факт демонстрирует важность
масс-спектрометрии для современной науки, для получения наиболее надежных
экспериментальных данных. Очень интересные результаты можно получать с
помощью изотопной масс-спектрометрии. Метод масс-спектрометрической ви-
зуализации (имиджинга) позволяет изучать распределение искомых соединений
по поверхности или всему объему изучаемого объекта. Масс-спектрометрические
методы стали широко использоваться для диагностики самых разных заболеваний,
для контроля хирургических операций.
За последние 10 лет изменилась терминология. Введено более сотни новых
терминов, рекомендовано переименовать ряд существовавших названий. Даже
классический метод ионизации «электронный удар» теперь следует называть
«электронная ионизация». Возникло необычайно перспективное направление –
масс-спектрометрия с ионизацией на открытом воздухе. Создано несколько
десятков методов ионизации, которые позволяют работать с минимальной или
вообще без пробоподготовки. Это устраняет последний практический недоста-
ток масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия сегодня – это наиболее быстрый,
чувствительный и информативный метод анализа химических и биологических
соединений любой сложности: от химических элементов до биополимеров (белки,
сахара, нуклеиновые кислоты). Можно утверждать, что, если для какого-нибудь со-
единений вы не можете найти масс-спектрометрическую методику его определения,
это означает только то, что оно до сих пор не интересовало масс-спектрометристов.
Существенные успехи достигнуты в области миниатюризации. Созданы перенос-
ные масс-спектрометры весом в несколько килограммов. В результате появились
предпосылки для создания в недалеком будущем бытовых масс-спектрометров для
проверки качества пищевых продуктов, напитков, медикаментов и т.д.
Значительные перемены произошли и в российской масс-спектрометрии.
В конце 2003 года создано Всероссийское масс-спектрометрическое общество
(ВМСО), объединившее около 600 ученых более чем из 50 регионов страны, ближ-
него и дальнего зарубежья и ставшее полноправным членом международного масс-
спектрометрического общества (International Mass Spectrometry Foundation, IMSF).
ВМСО уже проведено шесть крупных масс-спектрометрических конференций с
международным участием, ежегодно проводятся школы по разным аспектам масс-
спектрометрии. С 2004 года в свет выходит журнал «Масс-спектрометрия», вклю-
ченный в список ВАК и переводимый на английский язык в качестве ежегодного
приложения к «Журналу аналитической химии». Журнал хорошо цитируется, а по
импакт-фактору РИНЦ в 2013 году он оказался на втором месте среди всех рос-
сийских журналов в области химии и на пятом в области физики. Золотые медали
ВМСО за выдающиеся заслуги в масс-спектрометрии вручены российским ученым
с мировыми именами: Б.А. Мамырину, А.А. Макарову, Л.Н. Галль, И.А. Ревель-
скому, Р.А. Зубареву. Престижные Международные премии получили наши соот-
ечественники: В.Л. Тальрозе (премия Томсона), А.А. Макаров (премии Томсона,
Брюне, Американского масс-спектрометрического общества), Р.А. Зубарев (премии
Брюне и Бимана), Ю. Ласкин (премия Бимана, премия Rising Star Award from the
Women Chemists Committee of the American Chemical Society). Золотыми медалями
Питсбургской конференции в ХХI веке награждены два масс-спектрометра: орби-
тальная ловушка фирмы «Термо», разработанная А.А. Макаровым, и времяпролет-
ный масс-спектрометр высокого разрешения HRT фирмы ЛЕКО, разработанный
А.Н. Веренчиковым и В.Б. Артаевым. За прошедшие 10 лет активизировался выпуск
специализированной масс-спектрометрической литературы на русском языке. Вы-
шедшие монографии российских авторов и переводы зарубежных изданий были
посвящены разным направлениям масс-спектрометрии [1–7].
Таким образом, изменений и новшеств накопилось так много, что выпуск ново-
го, существенно переработанного и дополненного учебного издания по органиче-
ской масс-спектрометрии стал необходим. Изменения коснулись практически всех
глав. Добавлены новые главы по ионизации на открытом воздухе, по родственным
масс-спектрометрии методам анализа, по масс-спектрометрии биологических
соединений. В тексте использована новая терминология в соответствии с реко-
мендациями ВМСО и IMSF. Большое количество иллюстративного материала
позволит легче воспринимать материал. Добавлены новые задачи, необходимые
при проведении обучающих семинаров.
Предисловие
К концу ХХ века инструментальные физико-химические методы анализа стали
неотъемлемой частью экспериментальной работы исследователя, работающего
в области естественных наук. Наиболее мощными и многоцелевыми среди них,
безусловно, являются спектроскопия ядерного магнитного резонанса и масс-
спектрометрия. Оба метода активно используются в химии, биологии, медицине,
экологии, контроле технологических процессов, криминалистике и т.д. Характе-
ризуя вновь синтезированное вещество, исследователь обязан получить и описать
его ЯМР и масс-спектры.
Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить ее
чувствительность, экспрессность, информативность и надежность. Для получе-
ния достоверного масс-спектра индивидуального соединения даже на рутинном
масс-спектрометре достаточно 10{sup}-9{/sup} – 10^–10 г вещества. При необходимости про-
стого детектирования конкретного соединения в смеси порог обнаружения может
быть легко снижен до 10–12–10–14 г. Использование современного оборудования и
современных методов ионизации позволяет в некоторых случаях увеличить чув-
ствительность метода еще на несколько порядков. Таким образом, «традиционная
неразрешимая» без волшебства русская задача о «поиске иголки в стоге сена» может
быть легко решена масс-спектрометрически, а обычный масс-спектрометрический
эксперимент сравним с поиском одной иголки в нескольких миллионах стогах сена.
Для получения обычного спектра электронной ионизации индивидуального
соединения необходимо затратить 1–2 минуты, а время анализа сложной смеси
органических соединений в режиме хроматомасс-спектрометрии определяется
исключительно хроматографическим временем удерживания компонентов. При
этом в памяти компьютера, являющегося неотъемлемой частью современного
масс-спектрометра, остается информация о временах удерживания, площадях
пиков, а также масс-спектры всех компонентов смеси, то есть, вводя в прибор один
микролитр сложнейшей смеси органических соединений, на «выходе» можно полу-
чить информацию о ее качественном и количественном составе. Ни один другой
метод не сочетает в себе такой экспрессности и информативности. Надежность
масс-спектрометрического анализа также очень высока, поскольку масс-спектр
является индивидуальной характеристикой конкретного вещества, отражающей
его структурные особенности.
История масс-спектрометрии насчитывает около 100 лет. Годом рождения масс-
спектрометрии можно считать 1901-й, когда немецкий физик В. Кауфман создал
первый прототип параболического масс-спектрографа для изучения «катодных
лучей», или 1913-й, когда сэр Дж. Томсон впервые спектрально увидел изотопы
неона, или 1918-й, когда А. Демпстер сконструировал первый магнитный масс-
спектрометр с источником для электронной и термической ионизации. Тем не
менее в течение первых 50 лет существования эта наука оставалась прерогативой
исключительно физиков и физико-химиков. Используя простейшие соединения,
масс-спектрометристы того времени успешно измеряли характеристики элементов,
атомов, молекул (энергии ионизации, прочности связей, точные массы элементов
и природную распространенность их изотопов).
Временем рождения органической масс-спектрометрии можно считать конец
40-х – начало 50-х годов прошлого века. Это было совсем недавно, поэтому даже
сейчас, в начале ХХI века, можно лично поговорить с классиками, стоявшими
у истоков создания этой дисциплины. После Второй мировой войны возникло
понимание, что метод можно использовать не только в качестве прецезионного
физико-математического инструмента, но и в качестве удобного способа иден-
тификации достаточно сложных соединений по набору характеристических для
них фрагментных ионов. Знание классических химических реакций органических
соединений и привлечение теорий устойчивости органических ионов позволяет
приписать фрагментам конкретные структуры, делать обобщения по аналогиям
фрагментации внутри классов органических соединений. Переход на такой уро-
вень масс-спектрометрии резко увеличил число пользователей метода и привел
к взрывному процессу развития приборного парка. Особенно важной оказалась
применимость метода для решения нефтехимических проблем. Финансовые вло-
жения нефтяных компаний значительно помогли быстрому инструментальному и
теоретическому становлению нового научного направления. Отличное издание [8],
содержащее огромный фактический материал по истории масс-спектрометрии и
богато иллюстрированное фотографиями и рисунками, вышло в свет в 2002 году
под редакцией М. Грейсона по случаю 50-летия масс-спектрометрического обще-
ства США.
Традиционно органическая масс-спектрометрия используется для решения
двух основных проблем: идентификации и количественного определения ве-
ществ, а также изучения превращений ионизированных молекул органических
соединений в газовой фазе в ионном источнике [9]. С появлением хроматомасс-
спектрометрии, ионного циклотронного резонанса [10], систем протока после
разряда [11] возможности классического метода значительно увеличились. Соеди-
нение масс-спектрометра с жидкостным хроматографом еще более расширило круг
изучаемых объектов. Новые методы ионизации, в частности «электроспрей» [12]
и МАЛДИ [13], появившиеся к концу ХХ века, позволили успешно работать со
сложнейшими биоорганическими молекулами, такими как полипептиды, белки,
полисахариды, нуклеиновые кислоты, молекулярные массы которых составляют
миллионы дальтон [14]. На сегодняшний день можно проанализировать соединение
практически любой сложности. В последние годы широко ведутся исследования
по анализу микроорганизмов [15], по моделированию в газовой фазе химических
реакций термолиза, фотолиза, превращений, катализируемых кислотами и основа-
ниями [16], по изучению каталитических процессов [17]. По шутливому выражению
одного из «отцов» органической масс-спектрометрии Фреда Мак-Лафферти, «если
химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, может быть,
она вообще не стоит того, чтобы на нее тратили время» [18]. Признанием важности
масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 го-
ду Нобелевской премии масс-спектрометристам Джону Фенну и Коичи Танаке.
Наряду с очевидным использованием масс-спектрометрии в органической и био-
органической химии для установления структур соединений, хроматомасс-спектро-
метрия стала сегодня основным методом идентификации и количественного опре-
деления органических загрязнений в объектах окружающей среды. Современная
химическая экология немыслима без этого метода. Изучение метаболизма лекар-
ственных средств и пестицидов в окружающей среде и живых организмах также
ведется с активным использованием масс-спектрометрии. Метод незаменим в
криминалистических исследованиях и при проведении допинг-контроля на спор-
тивных соревнованиях.
Масс-спектрометрия применяется для решения геохимических и космохими-
ческих проблем, задач комбинаторной химии, иммунологии, медицины, биологии
и т.д. Масс-спектрометрия имеет явное преимущество перед другими физико-хи-
мическими методами, поскольку в этом случае речь идет о простейших характери-
стиках вещества: массе молекулы, ее основных фрагментов и отношении количеств
этих фрагментов относительно друг друга. Это позволяет достаточно легко усвоить
основы метода и научиться работать с масс-спектрами не только подготовленным
студентам, но и школьникам старших классов, изучающим курс органической
химии. Учитывая, что расшифровка масс-спектра может быть сродни решению
головоломки типа puzzle, научиться владеть этим методом настолько же полезно,
насколько просто и увлекательно.
Тем не менее, занимаясь масс-спектрометрией органических соединений уже
более 30 лет, я постоянно сталкиваюсь с ситуацией, когда даже опытные химики-
органики пасуют перед масс-спектром, предпочитая извлечь необходимую инфор-
мацию о структуре с помощью других, более знакомых им методов. Объяснение
этому я нахожу в отсутствии учебной литературы по интерпретации масс-спектров
и спецкурсов по этой дисциплине в вузах России. Книги по масс-спектрометрии
советских авторов, изданные в 70–80-е годы прошлого века, затрагивали отдельные
аспекты органической масс-спектрометрии [19–39], причем в качестве учебной
литературы можно было бы выделить лишь пособия [24–27]. Русскоязычный чи-
татель не был знаком и с подавляющим большинством иностранных изданий. За
исключением фундаментальной пионерской монографии Джона Бейнона [9], на
русский язык были переведены лишь три книги [40–42], две из которых [40, 41] от-
носятся к 60–70-м годам ХХ века. Даже замечательный учебник Мак-Лафферти [43],
претерпевший уже четыре издания, так и не переведен на русский язык. В XXI веке
ситуация несколько изменилась. Прежде всего это связано с созданием Всероссий-
ского масс-спектрометрического общества. Его деятельность привела к написанию
и переводу современных книг по масс-спектрометрии [1–7], а также первого из-
дания этого учебного пособия [44].
Данное пособие направлено на решение двух основных задач: учебной и по-
знавательной. Можно знакомиться с материалом последовательно, а можно выбо-
рочно читать конкретные главы или разделы. Большое внимание уделено именно
работе с масс-спектром, подходам к его расшифровке с извлечением максимальной
структурной информации. Описание основных направлений фрагментации раз-
личных классов органических соединений (от алканов до белков и нуклеиновых
кислот) сопровождается задачами, аналогичными тем, с которыми сталкивается
любой исследователь, когда обращается к методу масс-спектрометрии в своих на-
учных целях. Решая эти задачи, читатель сможет закрепить теоретический материал
и успешно справляться с подобными проблемами в своей последующей научной
работе. Большое число вариантов типовых задач позволяет использовать книгу не
только для индивидуальной работы, но и для семинаров в студенческих группах.
Последнее десятилетие ХХ века ознаменовалось революционными новациями
в органической масс-спектрометрии. В данной работе наряду с описанием класси-
ческих методов ввода и ионизации образца, а также разделения и детектирования
ионов значительное место уделено теоретическим и практическим аспектам со-
временной масс-спектрометрии: электрораспылению и другим методам стыковки
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром, матрично активированной
лазерной десорбции/ионизации (гл. 5), тандемной масс-спектрометрии (гл. 7), ме-
тодам анализа, основанным или связанным с масс-спектрометрией (гл. 8), методам
ионизации без пробоподготовки (на открытом воздухе, гл. 9).
Очень важно, чтобы масс-спектрометрией владели непосредственно химики,
биологи, экологи, а не узкий круг профессиональных масс-спектрометристов. Ни-
кто не знает столь досконально свою задачу, как человек, непосредственно работаю-
щий с веществом. Если он сможет правильно поставить масс-спектрометрическую
задачу и при этом владеет техникой интерпретации масс-спектров, эффективность
его работы со спектрами будет существенно выше, чем у профессионального масс-
спектрометриста, далекого от конкретной проблемы. Недостающим звеном для
правильной расшифровки может оказаться информация о производителе исходного
реактива, о побочных процессах изучаемой реакции, о примесях к реагентам или
даже о реакции, которая ставилась в этой посуде за неделю до данного эксперимента.
Мир масс-спектрометрии удивителен и красив. Каждый год приносит новые
потрясающие открытия, появляются неординарные приложения этого метода.
Я надеюсь, читатель сможет оценить это сам.
Введение
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, заключающимся в переводе молекул образца в ионизированную форму с последующим
разделением и регистрацией образующихся при этом положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе
соединения, его составе и структуре. Масса самого тяжелого иона в спектре, как
правило, соответствует молекулярной массе анализируемого соединения. Принято
представлять масс-спектр в виде графика или таблицы (рис. 1) .
В случае графического изображения по оси абсцисс откладывается масса ионов
(точнее, величина отношении массы иона к его заряду), а по оси ординат – их ин-
тенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. Принято выражать
интенсивность в процентах к полному ионному току (суммарной интенсивности
всех ионов в спектре) или к интенсивности максимального иона (рис. 1). В качестве
единицы размерности массы в масс-спектрометрии используются термины: угле-
родные единицы, атомные единицы массы, дальтоны [2]. Тем не менее, поскольку
по шкале абсцисс в масс-спектрах откладывается величина отношения массы к
заряду, для обозначения этой единицы измерений используется термин «томсон»
(Thomson, Th), но чаще – просто m/z [45].
Задача 1. Установите, какому распространенному органическому соедине-
нию принадлежит масс-спектр, представленный на рис. 1. Масс-спектрометрия
высокого разрешения показала, что точная молекулярная масса соединения
60,0211 дальтона, что соответствует составу С2Н4О2. Обращайте на данном эта-
пе внимание только на наиболее интенсивные пики в спектре, обусловленные
всей молекулой (m/z 60) и ее наиболее значимыми структурными фрагментами.
В данном случае наиболее важными осколочными ионами являются фрагменты
с m/z 45, 43, 28 и 15.
Для получения масс-спектра прежде всего необходимо ввести образец в ис-
точник ионов (гл. 1), затем перевести его молекулы в заряженную форму (по-
ложительные или отрицательные ионы, гл. 2), разделить эти ионы по массам и
зарегистрировать их массы и количество (гл. 6). В современных приборах управ-
ление всеми операциями, а также обработку результатов осуществляет компьютер,
являющийся неотъемлемой частью масс-спектрометра. На выходе можно получить
спектр в любом виде, провести вычитание или усреднение спектров, сравнение
с библиотекой масс-спектров. Принципиальная блок-схема масс-спектрометра
представлена на рис. 2.
Для решения более сложных задач (например, анализ неразделенных сме-
сей) схема процесса может быть значительно сложнее (гл. 7, тандемная масс-
спектрометрия).
Фрагментация молекулярных ионов органических соединений в масс-спектро-
метре подчиняется определенным законам (гл. 2, 3), поэтому при отсутствии
спектра анализируемого соединения в компьютерных библиотеках можно устано-
вить его молекулярную массу, состав, наличие функциональных групп, а иногда и
точную структуру по характеру фрагментации (гл. 4). Поскольку во фрагментации
родственных соединений есть много общего (гл. 10 и 11), существует возможность
интерпретации спектров вручную, хотя это и требует определенной практики
(см. задачи и их решение в гл. 13 и 14). Кроме того, масс-спектрометрия является
наиболее чувствительным методом количественного анализа органических со-
единений (гл. 12).
ГЛАВА1
СИСТЕМА ВВОДА ОБРАЗЦА
Для того чтобы избежать нежелательных химических реакций в результате взаи-
модействия молекул и ионов, в источнике большинства масс-спектрометров, как
правило, поддерживается высокий (10–5–10–6 мм рт.ст.), а иногда и сверхвысокий
(10–10 мм рт.ст.) вакуум. Поэтому уже сам ввод образца является самостоятельной
технической задачей.
1.1. Баллон напуска
Одной из первых систем ввода, практически не используемой в настоящее время,
служил баллон напуска (рис. 1.1). Анализируемое вещество находилось в газообраз-
ном состоянии (давление около 10–2 мм рт.ст.) в баллоне, внутренняя поверхность
которого объемом 50–2000 см3 была остеклена для предотвращения нежелательных
химических реакций на стенках сосуда. В поздних вариантах предусматривалась
система нагрева пробы в баллоне. Этот резервуар соединялся с источником ионов
отверстием очень небольшого диаметра, через которое осуществлялось молекуляр-
ное натекание образца в масс-спектрометр.
Альтернативными вариантами такого отверстия служили капилляры или пори-
стые диафрагмы. Такое устройство позволяло получить стабильную концентрацию
вещества в источнике. Оно было необходимо на начальных стадиях развития орга-
нической масс-спектрометрии, когда применялись малоэффективные вакуумные
системы, а скорость развертки масс-спектра составляла минуты. Очевидным недо-
статком данного ввода является необходимость переводить вещество в газовую фазу
в условиях неглубокого вакуума, что для многих образцов весьма проблематично.
Конструкции стыковки баллонов напуска с ионными источниками подробно опи-
саны в фундаментальном труде Джона Бейнона [9].
1.2. Прямой ввод
Развитие техники позволило в 60-х годах перейти на более совершенную систему
ввода, которая является общепринятой и широко распространенной в настоящее
время, хотя в приборах ХХI века эта система часто оказывается лишь опцией.
Это – прямой ввод вещества в область ионизации. Твердый образец помещается
в специальную микрокапсулу (стекло, кварц, керамика, металл), которая штоком
вводится непосредственно в ионный источник, т.е. испарение осуществляется прямо
в источнике ионов в условиях глубокого вакуума. При необходимости образец может
быть нагрет с помощью программируемой печки до температуры 400–500 °С, а в
некоторых случаях, как, например, в условиях десорбционной химической иони-
зации (разд. 5.3), – выше 1000 °С. Понятно, что в этих условиях (глубокий вакуум
и высокая температура) число соединений, переходящих в газовую фазу и становя-
щихся доступными для масс-спектрометрического анализа, значительно возрастает.
Поскольку полное испарение введенного образца в источнике позволяет измерить
количество соединения, прямой ввод дает возможность наряду с идентификацией
проводить и количественное определение веществ (гл. 12).
Важно обращать внимание не только на температуру прямого ввода, но и на
температуру источника ионов. Если вещество труднолетучее, а прямой ввод пере-
грет, оно может конденсироваться на стенках источника, что ведет к его быстрому
загрязнению. Кроме того, последовательные процессы испарения и конденсации
приводят к увеличению роли деструкции вещества и, соответственно, к искажению
масс-спектра. Процессы деструкции имеют место и в случае слишком высокой
температуры источника. Принципиальная схема прямого ввода представлена на
рис. 1.2.
Программируемый нагрев образца в вакууме позволяет решить одновремен-
но три задачи: во-первых, перевести в газовую фазу широкий круг органических
соединений; во-вторых, подобрать оптимальную температуру съемки, когда вос-
производится масс-спектр высокого качества; в-третьих, анализировать смеси со-
единений с разной степенью летучести. Такое фракционное испарение позволяет в
некоторых случаях провести достаточно быстрый качественный и количественный
анализ смеси без ее предварительного разделения.
Поскольку чувствительность метода очень высока, а прямой ввод позволяет
доставить образец в область ионизации без потерь, следует опасаться ввести слиш-
ком много вещества. Считается, что твердый образец в капилляре на конце штока
должен быть едва различим глазом. Избыточное количество образца может при-
вести к искажению масс-спектра из-за протекания ионно-молекулярных реакций
и вызвать быстрое загрязнение источника ионов. Многие масс-спектрометристы
предпочитают наносить вещество из раствора и вводят шток в источник после ис-
парения растворителя.
Еще один важный параметр для наиболее распространенных спектров электрон-
ной ионизации связан с положением образца относительно пучка электронов. Если
образец расположен достаточно далеко, его молекулы достигают пучка электронов
только после ряда последовательных столкновений со стенками источника. При
этом возрастает роль процессов термодеструкции. Однако, если поместить образец
слишком близко к пучку электронов, наконечник штока может приобрести отри-
цательный заряд и начать отталкивать электроны, что приводит к расфокусировке
пучка.
Система прямого ввода применяется в основном в сочетании с методами элек-
тронной и химической ионизации, хотя его модификации используются в случае
бомбардировки быстрыми атомами (разд. 5.10) и в ряде других случаев.
1.3. Мембранный ввод (Membrane inlet mass
spectrometry, MIMS)
Весьма полезным и перспективным является мембранный ввод (МВ) пробы. Метод
был впервые описан более полувека назад [46], а с начала 1990-х годов [47, 48] стал
применяется для проведения анализов в реальном времени. Непрерывное количе-
ственное определение с целью надежной оценки экологической ситуации, напри-
мер экотоксикантов, с помощью МВ существенно предпочтительнее дискретных
измерений классическими методами. Именно МВ позволяет установить динамику
изменения концентраций целевых аналитов за адекватный промежуток времени.
Метод основан на использовании полупроницаемых мембран, которые се-
лективно пропускают молекулы аналитов из газа или жидкости в вакуум масс-
спектрометра. Поскольку МВ не требует отбора проб, их очистки и разделения,
этот метод представляет собой хорошую альтернативу хроматомасс-спектрометрии.
Уменьшается общее время анализа, а также расход органических растворителей.
Мембрана изготавливается из органического материала и пропускает в источник
масс-спектрометра соединения, растворимые или адсорбируемые ею и облада-
ющие высоким коэффициентом диффузии в ней. Анализируемое соединение
должно быть достаточно летучим, чтобы испаряться на вакуумированной стороне
мембраны. В частности, соединения с давлением паров менее 1–3 Па с трудом
десорбируются в поток газа-носителя даже при использования нагрева. В одном
из приводимых ниже вариантов мембрана размещается вне источника ионов
(рис. 1.3) [49], в другом – капиллярная мембрана вводится непосредственно в
источник (рис. 1.4) [50].
Достоинством такого ввода является селективность в пропускании веществ
разной природы. Поскольку мембрана не пропускает воду, неорганические газы и
соли, она может использоваться для эффективного мониторинга загрязнения воз-
духа или воды органическими соединениями, а также для контроля биохимических
процессов. Например, предел обнаружения в воде для широкого круга органических
соединений с молекулярной массой ниже 300 дальтон может достигать нанограммов
в литре [51]. Возможности непрерывного мониторинга уровня органических со-
единений в воде описаны в работах [49, 52, 53], в воздухе – в работе [54], для целей
биологии и медицины – в работах [55, 56].
В последнее время появились работы, демонстрирующие эффективное исполь-
зование МВ с атмосферными методами ионизации, в частности электрораспыле-
нием (ИЭР, разд. 5.13). Новые материалы, методики с применением нагревания,
использование жидких фаз для переноса десорбированных аналитов существенно
расширили круг соединений, которые можно анализировать методом МВ. В част-
ности, разработан мембранный интерфейс на базе капиллярных полых волокон для
работы с метанолом в качестве жидкофазного носителя для доставки целевых ана-
литов в источник ИЭР [57]. В таком варианте при мониторинге в режиме реального
времени полярных и заряженных молекул достижимы пределы обнаружения до ppt.
Система может работать как в режиме постоянного потока, так и с его остановкой.
В последнем варианте удается повысить чувствительность метода. Разработанный
интерфейс был с успехом использован для детектирования лекарственных препа-
ратов, фенолов и ряда других экотоксикантов в природной воде и искусственной
моче. Авторам удалось также продемонстрировать проведение он-лайн контроля
реакции хлорирования фенола в воде [57].
В обзоре [58] представлены основные тенденции развития этого метода за
последнее десятилетие, включая новые материалы для изготовления мембран,
конфигурации интерфейсов и приемлемые методы ионизации. В обзоре приведен
также ряд успешных анализов методом МВ с использованием портативных массспектрометров (разд. 9.8). Такие масс-спектрометры весьма перспективны для
работы с объектами окружающей среды непосредственно в полевых условиях, а
также в биомедицинских исследованиях [59–61].
1.4. Газовая хроматография/масс-спектрометрия
На сегодняшний день газовая хроматография/масс-спектрометрия (хроматомасс-
спектрометрия, хромасс, ГХ/МС) является чрезвычайно широко используемым
методом органической масс-спектрометрии, хотя начиная с 90-х годов ХХ века
многочисленные варианты комбинированного метода жидкостная хроматогра-
фия/масс-спектрометрия (разд. 1.5) используются все шире и во многих областях
исcледований (особенно биомедицинских) заняли лидирующее положение.
Стыковка газового хроматографа и масс-спектрометра была абсолютно ло-
гичной, поскольку оба метода использовались для анализа смесей органических
соединений в газовой фазе и обладали приблизительно равной чувствительностью.
Единственной проблемой для объединения двух методов в едином приборе являлось
рабочее давление. Газовый хроматограф работает при атмосферном давлении, а
масс-спектрометр – в условиях глубокого вакуума. Основные принципы стыковки
были сформулированы и претворены в жизнь в 1957 году [62]. Первоначальные
проблемы, связанные с недостаточной мощностью вакуумных систем и набивными
колонками с рабочими потоками газа-носителя 30 мл/мин, решались установкой
сепараторов различного типа [9]. Эти устройства размещались между выходным
концом колонки хроматографа и ионным источником масс-спектрометра и предна-
значались для обогащения пробы анализируемым веществом за счет избирательной
откачки значительно более легкого газа-носителя (водород, гелий). Появление
более мощных вакуумных систем и капиллярных колонок с меньшими потоками
(0,5–2,0 мл/мин) значительно облегчило задачу, а замена металла или стекла, из
которых изготавливались колонки, на плавленый кварц позволила ввести конец
колонки непосредственно в ионный источник. Все это сделало метод ГХ/МС про-
стым и эффективным.
Не стоит забывать, однако, что стыковка хроматографа и масс-спектрометра
все-таки является компромиссом, поскольку давление в ионном источнике ока-
зывается несколько выше идеального, а выходное отверстие хроматографической
колонки функционирует в условиях вакуума, что несколько ухудшает хроматогра-
фическое разрешение. Подробнее об этом можно прочитать в книге Чепмена [42].
Метод прежде всего предназначен для анализа смесей органических соединений и
заключается в их разделении на колонке хроматографа с последовательным выходом
компонентов из колонки в ионный источник масс-спектрометра, где происходит их
ионизация. Хроматографисты часто рассматривают в этом случае масс-спектрометр
как детектор газового хроматографа.
1.4.1. Ввод пробы в систему ГХ/МС
Метод ГХ/МС позволяет эффективно работать с неполярными и слабополярны-
ми соединениями, обладающими при этом достаточной летучестью. Соединения
средней летучести (полулетучие) вводятся в инжектор хроматографа шприцем в
растворе в органическом растворителе. Для более летучих соединений наиболее
популярными системами ввода являются «выдувание – улавливание» (purge and
trap) и парофазный анализ (headspace).
Условное разделение органических веществ на две группы (летучие и полулету-
чие) возникло в процессе разработки методов анализа органических экотоксикан-
тов. К группе летучих органических соединений (ЛОС) отнесли малорастворимые
в воде соединения, активно переходящие в газовую фазу при выдувании их из воды
инертным газом при комнатной температуре. ЛОС содержат не более 8 атомов
углерода в молекуле и, как правило, имеют молекулярную массу менее 200 даль-
тон и температуру кипения ниже 200 °С. К ЛОС относятся галогенсодержащие
углеводороды, легкие ароматические соединения ряда бензола, кетоны, эфиры и
сероуглерод. Если вводить эти соединения в прибор в органическом растворителе,
они оказываются либо полностью скрыты пиком растворителя, либо выходят на его
хвосте. Велики их потери и при пробоподготовке, например при концентрировании
упариванием растворителя.
Метод парофазного анализа (рис. 1.5) заключается в выдерживании жидкой или
твердой пробы, которая содержит целевые аналиты, в течение некоторого времени
при определенной температуре в закрытой виале. За это время устанавливается
равновесие и ЛОС распределяются в определенном соотношении между конден-
сированной и газовой фазой. Это распределение зависит от значений константы
Генри и определяется простейшей формулой:
Р = НС,
где Р – давление паров ЛОС, С – концентрация ЛОС в жидкости, Н – константа
Генри.
Далее из газовой фазы шприцем отбирается проба (~1 мл) и вводится в инжектор
хроматографа. Такой вариант называется статическим парофазным анализом. Аль-
тернативно можно использовать шприц с иглой, покрытой адсорбирующим слоем.
При внесении этого устройства в газовую фазу (можно и непосредственно в конден-
сированную) аналиты абсорбируются на нем. Последующее введение этой иглы в
нагретый инжектор хроматографа вызывает десорбцию, а все вещества оказываются
в колонке. Варьируя состав пленки адсорбирующей фазы, можно проводить изби-
рательную сорбцию аналитов из анализируемого образца. Этот метод, называемый
твердофазной микроэкстракцией (ТФМЭ, solid phase micro extraction, SPME), стал
весьма популярным в настоящее время для анализа образцов объектов окружающей
среды, пищевых продуктов и т.д. [63].
Для увеличения чувствительности метода можно усложнить прибор и проду-
вать над конденсированной фазой, содержащей аналиты, поток инертного газа в
течение заданного времени. Этот поток далее направляется в ловушку со специ-
альным материалом, в которой происходит сорбция паров аналитов. В качестве
адсорбентов наиболее часто используются силикагель, активированный уголь
или Тенакс (полимерная смола на основе 2,6-дифенил-п-фениленоксида). В за-
висимости от природы целевых аналитов выбирается тот или иной адсорбент либо
несколько адсорбентов используется послойно. Этот вариант метода называется
динамическим парофазным анализом.
Далее резкий нагрев адсорбента, сопровождающийся подачей инертного газа,
приводит к количественному переносу десорбированных соединений в колонку
ГХ. Вариантом улавливания аналитов перед их попаданием в хроматографическую
колонку является криофокусировка. В этом случае на пути потока инертного газа,
несущего молекулы аналитов, устанавливается склянка, охлаждаемая жидким азо-
том. Большинство органических соединений конденсируется, и через некоторое
время резкий нагрев приводит к единовременному переносу всего накопленного
материала в хроматограф. Этот метод характеризуется лучшими показателями, но
технически несколько сложнее.
Метод динамического парофазного анализа очень близок популярному для анализа
водных проб методу «выдувание – улавливание». В этом варианте поток инертного
газа барботируется непосредственно через водную фазу, унося из нее целевые аналиты
(рис. 1.6). Далее вновь используется улавливание аналитов сорбентами или криофоку-
сировка. Чувствительность метода «выдувание – улавливание», как правило, выше, чем
парофазного анализа, поскольку из конденсированной фазы выдувается боjльшая часть
растворенных летучих органических соединений. Если парофазный анализ одной и той
же пробы можно проводить в нескольких повторностях, то вторичное использование
пробы в методе «выдувание – улавливание» приведет к получению значительно мень-
ших концентраций ЛОС.
1.4.2. Запись масс-спектров в режиме ГХ/МС
Если поток элюата из колонки хроматографа идет непрерывно, масс-спектрометр
работает в дискретном режиме, поскольку должен просканировать весь намеченный
диапазон масс и вернуться к начальной массе для проведения нового сканирования.
Понятно, что запись спектра (сканирование) должна осуществляться с достаточной
частотой, чтобы зарегистрировать масс-спектр каждого соединения несколько раз.
В идеале считается, что каждый хроматографический пик должен быть охаракте-
ризован 10–15 масс-спектрами. Это условие является очень важным, поскольку в
условиях ГХ концентрация вещества изменяется очень быстро. В зависимости от
того, на восходящей или нисходящей стороне хроматографического пика записан
масс-спектр, будут дискриминированы или низкие, или высокие массы (рис. 1.7).
Безусловно, лучшим будет спектр, зарегистрированный на вершине хроматогра-
фического пика (рис. 1.7в), где максимальна концентрация вещества и минимальны
ее изменения во времени. Спектры на рис. 1.7а, б значительно искажены, и библио-
течный поиск для идентификации этого компонента может быть затруднен. Жела-
тельно получить не менее 10 спектров каждого компонента смеси, а для улучшения
качества масс-спектра часто необходимо проводить усреднения и вычитания фона.
Продемонстрировать эффект вычитания фона можно на примере, представ-
ленном на рис. 1.8. В данном случае спектр, снятый у подножия хроматографи-
ческого пика, вычитается из спектра, снятого на вершине пика. Эту процедуру
осуществляет компьютер. В некоторых программах (например, ChromaTOF,
LECO) это происходит в автоматическом режиме во время компьютерной об-
работки результатов анализа. Однако в большинстве случаев оператор должен
сам выбрать номера спектров на вершине и у подножия хроматографического
пика и поручить компьютеру провести вычитание. Результирующий спектр
очищен от наложения фона и позволяет значительно улучшить индекс схо-
димости с библиотечным спектром. Очень важна скорость сканирования и
для количественного анализа. Недостаточное число сканирований приводит
к значительному искажению площади хроматографического пика (рис. 1.9).
Современные приборы позволяют сканировать спектр за 0,01–0,5 сек, что удов-
летворительно сочетается с шириной хроматогафического пика (как правило, не-
сколько секунд). Если учесть, что средний хроматомасс-спектрометрический анализ
длится 30 минут, при скорости сканирования 0,1 сек в памяти компьютера должно
остаться 18 000 спектров. Этот факт наглядно демонстрирует невозможность полу-
чения качественных результатов без стыковки прибора с мощным компьютером.
Кстати, времяпролетные спектрометры (разд. 6.7) позволяют регистрировать до
500 полных масс-спектров в секунду. Эта особенность привела к созданию быстрой
хроматомасс-спектрометрии (Rapid GC-MS), позволившей сократить время анализа
смесей в 5–10 раз [64].
На рис. 1.10 представлен пример хроматографического пика додекана в экспе-
рименте методом сверхбыстрой хроматографии. В этих условиях ширина хромато-
графического пика составила всего 100 миллисекунд. При скорости сбора данных
250 спектров в секунду можно получить корректный сигнал додекана. Однако даже
при достаточно высокой скорости сканирования в 10 спектров в секунду результат
крайне искажен. Сравните площади пиков на рис. 1.10. Количественное определе-
ние в таком варианте становится абсолютно невозможным, но и идентификация
соединения оказывается весьма проблематичной, поскольку интенсивности пиков
в зависимости от величин m/z фрагментных ионов будут сильно искажены.
Хромасс добавляет к масс-спектрометрической информации еще один очень
важный параметр – время удерживания. Именно благодаря этому параметру появ-
ляется возможность во многих случаях проводить качественный и количественный
анализ изомеров, масс-спектры которых очень похожи. На рис. 1.11б, в представ-
лены практически неразличимые спектры электронной ионизации изомерных
флуорантена и пирена. Однако времена удерживания этих соединений различаются
почти на 1 минуту (рис. 1.11а), что позволяет легко их идентифицировать.
Хромасс позволяет также детектировать ультрамикрокомпоненты на фоне вы-
соких концентраций других соединений. Для этой цели используется мониторинг
заданных ионов (разд. 12.2). Тем не менее следует отметить, что число соедине-
ний, которые можно проанализировать методом ГХ/МС, значительно меньше,
чем при использовании масс-спектрометра с прямым вводом. Действительно, в
последнем случае можно получить масс-спектр соединения, обладающего хотя
бы слабой летучестью в условиях глубокого вакуума и температуре 300–400 °С,
не говоря уже об альтернативных методах ионизации (гл. 5). В случае же ГХ/МС
необходимо, чтобы вещество прошло через колонку газового хроматографа при
атмосферном давлении и температуре 250–300 °С (в некоторых случаях до 400 °С).
Это приводит к невозможности анализа без предварительной дериватизации труд-
нолетучих, высокополярных, термолабильных соединений. Некоторые примеры
дериватизации для ГХ/МС анализа малолетучих соединений представлены в гл. 12.
1.4.3. ГХ×ГХ/МС
В случае очень сложных смесей органических соединений, например нефтепродук-
тов, или необходимости полного разделения соединений с близкими временами
удерживания очень полезным оказывается метод тандемной газовой хроматогра-
фии – масс-спектрометрии (ГХ×ГХ/МС) [65]. В этом случае разделение осущест-
вляется на двух последовательно соединенных колонках с разными свойствами
(неполярная – полярная, ахиральная – хиральная и т.д.). Например, в варианте
«неполярная – полярная» первая колонка разделяет компоненты по их темпера-
турам кипения, а вторая по полярности.
Между колонками находится криофокусировочное устройство. Первая колонка,
как правило, длинная. Она разделяет компоненты, как и в обычном методе ГХ/МС.
Однако на выходе эти компоненты попадают в охлаждаемую камеру, где собираются
в течение определенного времени (1–5 секунд). Далее резкий нагрев переводит со-
бранные вещества во вторую короткую колонку другого типа, время удерживания
аналитов в которой не превышает тех же самых 1–5 секунд. Пока вещества проходят
вторую колонку, новая порция из первой колонки накапливается в криозатворе.
В коммерческих приборах реализованы варианты с двух- и четырехступенчатыми
модуляторами [65]. Каждый компонент помимо масс-спектра характеризуется
двумя временами выхода по каждой из колонок.
ГХ×ГХ/МС хроматограммы представляют в трехмерном или двумерном (вид
сверху) варианте (рис. 1.12–1.14). В первом случае каждый пик представляет кон-
кретный компонент смеси, а объем пика пропорционален количеству данного
компонента в смеси. Такое представление очень красиво и удобно для демонстра-
ций, поскольку картинку можно поворачивать и демонстрировать под разным
углом для получения оптимального вида. Работать с хроматограммой удобнее в
двумерном варианте (рис. 1.14), поскольку пики не закрывают друг друга. Нагляд-
но представлены все компоненты образца, хотя количественные характеристики
выражены не столь ярко.
Благодаря улучшенному разделению масс-спектры компонентов оказываются
чище, а библиотечный поиск – более эффективным и надежным. При этом за один
ввод образца в прибор можно получить информацию по индивидуальному составу
смесей, содержащих несколько тысяч компонентов. Вторым важным достоинством
метода является возможность устанавливать класс соединения по его расположению
на трехмерной хроматограмме. Так, на рис. 1.13 представлена масс-хроматограмма,
построенная по ионам с m/z 55, характерным для спиртов и алкенов/нафтенов. Масс-
спектры этих классов соединений могут быть очень похожими, поскольку молекуляр-
ные ионы спиртов, будучи нестабильными, легко теряют молекулу воды, превращаясь в
соответствующие углеводороды (гл. 10). Поэтому возможны ошибки в идентификации.
Однако на рис. 1.13 видно, что спирты и нафтены выходят из второй (полярной)
колонки с разным временем удерживания. По положению хроматографического
пика можно сделать однозначный вывод о принадлежности компонента смеси.
Зачастую прикладную задачу с помощью ГХ×ГХ/МС можно решить без пол-
ной расшифровки масс-спектров всех компонентов. Например, на рис. 1.14а, б
предствлены двумерные хроматограммы ГХ×ГХ/МС анализа дизельного топлива
до и после проведения процесса десульфуризации. На рис. 1.14а в выделенных об-
ластях наблюдается большое количество пиков. Они обусловлены серусодержащими
соединениями разного типа. После проведения процесса десульфуризации эти
области оказываются пустыми, т.е. очистка прошла практически количественно
(рис. 1.14б).
Дополнительную информацию о методе ГХ×ГХ/МС можно найти в книгах
[65, 66].
В методе реакционной хроматомасс-спектрометрии перед колонкой хроматографа
или между колонкой и масс-спектрометром устанавливается реакционная камера,
в которой можно осуществлять заданные превращения анализируемых соедине-
ний. В таком варианте дериватизация, разделение и анализ компонентов пробы
осуществляются в режиме on-line. Реакционная хроматомасс-спектрометрия может
использоваться для улучшения разделения компонентов смеси или для проведения
структурных анализов. Например, дейтерирование алкенов в реакционной камере
позволяет установить положение двойной связи в молекуле [30].
Для дополнительной информации о ГХ/МС можно порекомендовать кни-
ги [7, 67].
1.5. Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
(ЖХ/МС, LC/MS)
Решить проблему анализа тяжелых, полярных и термолабильных соединений мож-
но при замене газового хроматографа на жидкостный. При всей принципиальной
очевидности такого решения создать эффективный метод ЖХ/МС оказалось не
столь простой задачей [7, 68, 69]. Наиболее сложным моментом была стыковка
жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. Масс-спектрометр обычно
работает в условиях глубокого вакуума (10–6 мм рт.ст.), а скорость потока через
стандартную колонку жидкостного хроматографа составляет примерно 1 мл/мин.
Две наиболее часто используемые в современной ЖХ/МС жидкие фазы – метанол
и вода. Испаряясь в источнике ионов, 1 мл метанола образует 0,55 л пара, а 1 мл
воды – 1,24 л пара. Учитывая, что вакуумная система масс-спектрометра может
поддерживать требуемое для работы давление только в том случае, если приток
паров в ионный источник не превышает 10 мл/мин, понятно, что соединительный
узел (интерфейс) системы ЖХ/МС должен эффективно осуществлять обогащение
анализируемым соединением примерно в 100 раз. При этом надо помнить, что
проводящие жидкости могут быть причиной возникновения электрической дуги
в магнитных секторных приборах, работающих в условиях высокой разности по-
тенциалов, а нелетучие неорганические соли, используемые в качестве буфера в
хроматографии, приводят к проводящим отложениям на линзах источника ионов,
вызывая расфокусировку прибора.
Поскольку метод ЖХ/МС обычно используется для анализа полярных и мало-
летучих соединений, наиболее эффективно применение обратнофазной хрома-
тографии с неполярной неподвижной фазой и полярным растворителем (вода,
метанол, изопропанол, ацетонитрил). Тем не менее хороших результатов можно
добиться и методом прямофазной ЖХ/МС c неполярной подвижной и полярной
неподвижной фазами. Еще одним популярным вариантом для биологических проб
является жидкостная хроматография гидрофильных взаимодействий (hydrophilic interaction
liquid chromatography, HILIC), когда стационарной фазой служит полярный
недириватизованный силикагель или силикагель модифицированный полярными
аминопропильными или цианопропильными группами, а подвижная фаза состоит
из воды со смешивающимися с ней растворителями: ацетонитрил, метанол [70].
Вода мобильной фазы образует иммобилизованный слой на поверхности стацио-
нарной фазы, в котором и происходит разделение полярных и заряженных молекул
аналита. Этот метод устраняет недостатки и обратнофазной, и прямофазной ЖХ в
ее стыковке с МС, поскольку позволяет разделять высокополярные аналиты и не
использовать растворители, которые плохо стыкуются с МС в режиме атмосферных
методов ионизации.
К настоящему времени существует значительное число интерфейсов ЖХ/МС.
Часть из них уже практически не используется. Ниже представлены наиболее важ-
ные варианты. Самый популярный и эффективный метод стыковки жидкостного
хроматографа с масс-спектрометром – электрораспылительная ионизация – под-
робно представлен в разд. 5.13.
1.5.1. Ленточный транспортер (moving belt)
Исторически первым интерфейсом ЖХ – МС можно считать ленточный транс-
портер [71], появившийся в 1976 году. Принципиальная схема устройства пред-
ставлена на рис. 1.15.
Его основной конструкционной деталью является тонкая полиимидная коль-
цевая лента. Элюат из колонки хроматографа попадает на ленту, движущуюся по
направлению к источнику ионов. На пути следования он проходит вдоль инфра-
красных испарителей, которые переводят в газовую фазу значительную долю по-
движной фазы. Далее лента проходит вакуумный замок, и в условиях вакуума
остатки растворителя откачиваются насосами. В месте перегиба ленты, в ионном
источнике, находится импульсный нагреватель, который переводит в газовую фазу
молекулы образца, подвергающиеся электронной или химической ионизации. Дви-
гаясь в обратном направлении, лента очищается от избытка нанесенного образца
благодаря дополнительным испарителям, а иногда и растворителям и, теоретически,
возвращается за новой порцией элюата в исходном чистом виде.
К достоинствам метода следует отнести:
1) возможность использования стандартных библиотек масс-спектров элек-
тронной ионизации для идентификации исследуемых веществ;
2) возможность работы со стандартными колонками для жидкостной хромато-
графии, поскольку метод использует скорости потока до 1,5 мл/мин. Такие
потоки приемлемы при распылении элюата на ленту;
3) неорганические соли, используемые в качестве буфера при хроматографи-
ровании, не мешают анализу.
Тем не менее ленточные транспортеры не получили широкого признания, по-
скольку лишь незначительно расширяли круг органических соединений, доступных
масс-спектрометрическому анализу. В ионном источнике все равно требовался
термический перевод вещества в газовую фазу. Лента транспортера примерно через
10 прохождений оказывалась загрязненной, что приводило к наложению масс-
спектров друг на друга и мешало надежной идентификации. Качество спектров
и интенсивность характеристических ионов существенно зависели от количества
образца, т.е. воспроизводимость была плохой. В настоящее время ленточные транс-
портеры не используются, хотя в 70–80-х годах прошлого века этим методом было
получено много интересных результатов.
1.5.2. Прямой ввод жидкости (direct liquid introduction, DLI)
Данный метод тоже следует рассматривать, скорее, как историю масс-спектрометрии.
Он более или менее активно использовался в 80-х годах ХХ века, но уступил место
более прогрессивным техникам, основанным на аналогичном принципе. Фак-
тически все современные интерфейсы ЖХ/МС могли бы быть названы прямым
вводом жидкости. Для его реализации на выходе из хроматографической колонки
устанавливается диафрагма с отверстием 2–5 микрон (рис. 1.16). Возникающая
струя мелких капель движется с большой скоростью к источнику ионов. На пути
следования капли проходят через камеру испарения, где большая часть раство-
рителя переходит в газовую фазу. Оказываясь в источнике масс-спектрометра,
молекулы аналита подвергаются химической ионизации (разд. 5.2), тогда как
молекулы растворителя играют роль газа-реагента. Основной недостаток метода –
низкая скорость потока. Давление в источнике становится слишком высоким при
потоках более 50 мкл/мин. Поэтому требуется либо разделять поток из стандарт-
ных хроматографических колонок, уменьшая тем самым чувствительность метода
примерно в 20 раз, либо использовать узкие колонки. Кроме того, узкое отверстие
постоянно забивается, а добавки неорганических солей к подвижной фазе приво-
дят к быстрому ухудшению работы масс-спектрометра.
1.5.3. Поток частиц (particle beam)
В этом варианте интерфейса поток из колонки хроматографа направляется через
капилляр в стеклянный распылитель, где элюат превращается в облако мелких
капель, разорванных концентрическим потоком гелия. Это облако перемещается
внутри стеклянной испарительной камеры, стенки которой подогреваются, а дав-
ление поддерживается на уровне чуть ниже атмосферного. При этом происходит
частичное испарение растворителя, и размер капель уменьшается. Испарительная
камера заканчивается узким отверстием, за которым следует сепаратор молекуляр-
ного пучка с вакуумной откачкой (рис. 1.17). Вылетая из испарительной камеры,
частицы приобретают высокую скорость благодаря сужению потока. Поскольку
более тяжелые молекулы анализируемого вещества менее подвержены диффузии,
чем атомы гелия или молекулы растворителя, именно они и проходят в узкое вход-
ное отверстие сепаратора, а из него в масс-спектрометр.
Частицы анализируемого вещества далее направляются в ионный источник,
где подвергаются химической или электронной ионизации. Получение спектров
электронной ионизации является преимуществом метода, поскольку позволяет
использовать компьютерные библиотеки масс-спектров (разд. 4.5). Такой интер-
фейс может работать с потоками жидкости из хроматографа в диапазоне от 0,1 до
1,0 мл/мин. Чувствительность метода для получения полного масс-спектра лежит
на уровне единиц нанограммов (10–9 г). Этот метод фактически заменил ленточный
транспортер, хотя и не устранил недостатков, связанных с невозможностью работы
с высокомолекулярными, нелетучими и термолабильными соединениями.
1.5.4. Термораспыление, термоспрей (thermospray, TSP),
плазмораспыление, плазмаспрей (plasmaspray)
Принципиальная схема методов термораспыления и плазмараспыления представле-
на на рис. 1.18. В этом случае поток из колонки жидкостного хроматографа направ-
ляется в нагреваемый капилляр. Диаметр капилляра 0,1 мм, что значительно больше
по сравнению с отверстием для метода прямого ввода жидкости. Это устраняет случаи
закупорки – серьезный недостаток прямого ввода жидкости. Температура капил-
ляра поддерживается на уровне температуры кипения растворителя. В результате
из капилляра вырывается струя пара, которая попадает в ионизационную камеру.
В случае плазмаспрея подача напряжения на разрядный электрод или просто пучок
электронов создают условия химической ионизации (разд. 5.2), причем роль газа-
реагента играют пары растворителя.
Работая в режиме плазмаспрея, исследователи замечали, что часто удается ре-
гистрировать ионы даже в случае выключенного электрода. Анализ этого эффекта
привел к возникновению техники термораспыления. Дело в том, что некоторые
анализируемые соединения уже в растворе находятся в виде положительных или
отрицательных ионов. Добавки кислот и оснований в растворители жидкостной
хроматографии, которыми в большинстве случаев являются вода и метанол, при-
водят к протонированию или депротонированию субстрата. Появлению заряда
служат также добавки электролитов, например, ацетата аммония. Струя пара, вы-
ходящая из капилляра, представляет собой аэрозоль небольших заряженных капель.
Нагретый источник ионов и работающие вакуумные насосы заставляют эти капли
при движении уменьшаться в размере. В конечном итоге градиент поля на каплях
может достигать критических значений, что приводит к устранению сольватной
оболочки и появлению свободных ионов в газовой фазе. Выталкивающий по-
тенциал направляет эти ионы в узкое отверстие, ведущее к анализатору, а избыток
растворителя откачивается насосами (рис. 1.18).
Термоспрей и плазмаспрей применимы к потокам жидкости из хроматографа в
диапазоне от 0,5 до 2,0 мл/мин, что позволяет работать с обычными аналитическими
колонками. Следует отметить нежелательность использования в качестве буфера
нелетучих неорганических солей из-за возможного образования отложений в ис-
точнике ионов. В качестве недостатка метода можно отметить его плохую воспроиз-
водимость. Интенсивность спектра, а также наличие или отсутствие фрагментных
ионов существенно зависят от состава раствора, наличия добавок, температуры
капилляра и источника. В связи с этим очень важен выбор оптимальных условий
регистрации спектра для каждого анализируемого вещества. Чувствительность
метода лежит в очень широком диапазоне от единиц нанограммов до десятков
микрограммов. Увеличение доли пиков фрагментных ионов в спектре достигается
увеличением потенциала на выталкивающем электроде. Причиной тому становятся
более эффективные столкновения разогнанных ионов с молекулами, так как в этой
части ионного источника давление достаточно высоко.
Для ознакомления с другими существующими вариантами ЖХ/МС целесо-
образно предварительно усвоить основные методы ионизации веществ. Подробное
описание проточного варианта бомбардировки быстрыми атомами, химической
ионизации при атмосферном давлении, электрораспыления, акустического рас-
пыления представлено в гл. 5.
1.6. Сверхкритическая флюидная хроматография/
масс-спектрометрия (СФХ/МС)
Помимо газа или жидкости, подвижной фазой для хроматографического разделения
органических соединений может служить вещество, находящееся в сверхкритиче-
ском состоянии. Такой вид хроматографии был впервые предложен более полувека
назад [72]. В сверхкритической флюидной хроматографии/масс-спектрометрии
(Supercritical fluid chromatography/mass spectrometry, SFC/MS) используемое в
качестве подвижной фазы вещество можно представить как очень плотный газ.
Наиболее часто используемый диоксид углерода в таком состоянии имеет свой-
ства, промежуточные между жидкостью и газом, т.е. это плотный газ с высокой
сольватирующей способностью. Растворение образца в таком материале можно
рассматривать как процесс, родственный переводу вещества в газовую фазу, но
протекающий при достаточно низкой температуре.
Как уже отмечалось в разд. 1.5, основной проблемой стыковки жидкостного
хроматографа и масс-спектрометра является большой объем вещества (раство-
рителя), поступающего в ионный источник, что трудно совместимо с условиями
высокого вакуума в нем. В СФХ поток подвижной фазы значительно меньше, т.е.
комбинация СФХ/МС осуществима с меньшими сложностями по сравнению с
ЖХ/МС. Мобильная фаза СФХ имеет меньшую вязкость и больший коэффициент
диффузии по сравнению с фазами ЖХ. Фактически, метод является промежуточ-
ным между ЖХ/МС и ГХ/МС и в плане инструментальных требований, и в плане
свойств анализируемых соединений. Важно, что метод позволяет анализировать
более тяжелые и более термолабильные соединения по сравнению с ГХ/МС. Это
же касается полярности аналитов. В случае СФХ/МС идеальные аналиты более
полярны, чем те, для которых предпочтителен метод ГХ/МС, и менее полярны,
чем те, для которых предпочтителен метод ЖХ/МС.
В 80-х годах ХХ века казалось, что метод может существенно потеснить ЖХ/МС
благодаря большей разрешающей способности и уже существующим в то время
эффективным интерфейсам. Однако изобретение электроспрея (разд. 5.13) и
создание метода капиллярного электрофореза (разд. 1.7) отодвинули СФХ/МС на
вторые позиции. Тем не менее метод по-прежнему широко используется для ана-
лиза липидов, пестицидов, силиконов, неионогенных ПАВ, природных соединений
и т.д. Еще одним преимуществом СФХ/МС над ГХ/МС является тот факт, что в
сверхкритическом состоянии вещество, используемое в качестве подвижной фазы,
является отличным растворителем и очень эффективно экстрагирует органические
соединения разных классов из образцов пищевых продуктов, полимерных матери-
алов, биоты, объектов окружающей среды. Это существенно упрощает подготовку
проб для последующего масс-спектрометрического анализа.
Существует огромное разнообразие интерфейсов для стыковки сверхкритиче-
ского флюидного хроматографа с масс-спектрометром [73]. Для метода подходят
практически все интерфейсы, используемые в ЖХ/МС, хотя они могут быть слегка
модифицированы. Результаты часто улучшаются при увеличении полярности под-
вижной фазы, например при использовании в СФХ/МС электроспрея (разд. 5.13).
Положительным образом сказывается добавление к подвижной фазе метанола или
другого полярного органического растворителя [74]. Для улучшения разделения к
жидкостям в суперкритическом состоянии могут добавляться в качестве добавок
кислоты или основания. Это расширяет круг анализируемых соединений. В част-
ности, использование трифторуксусной кислоты в качестве добавки к подвижной
фазе СО2/метанол для предотвращения диссоциации карбоксильных групп и про-
тонирования аминогрупп позволило проводить надежный анализ самых разных по
составу пептидов с длиной цепи до 40 аминокислотных остатков [75].
Помимо электроспрея, активно используется химическая ионизация при атмо-
сферном давлении (разд. 5.11). Применение ленточного транспортера (разд. 1.5.1),
потока частиц (разд. 1.5.3) или специальных капиллярных ограничителей позволяет
работать в режимах электронной (разд. 2.1) и химической (разд. 5.2) ионизации.
Следует подчеркнуть, что в случае химической ионизации газом-реагентом служит
не СО2, а метан, изобутан или аммиак. Последний часто оказывается предпочти-
тельным, поскольку процесс ионизации аммиаком подвержен менее значительному
влиянию изменений парциального давления СО2 в процессе анализа. Это связано
прежде всего с очень низким сродством к протону молекулы углекислого газа. Не-
которое «раскрытие» ионизационной камеры, хотя и ухудшает чувствительность,
позволяет получать классические спектры электронной ионизации, а ионизация
осуществляется как напрямую, при взаимодействии молекул образца с электрона-
ми, так и в результате перезарядки при их взаимодействии с СО2
+•. Такие спектры
перезарядки (разд. 5.2) оказываются практически аналогичными обычным спек-
трам ИЭ. Их даже можно использовать для поиска по компьютерным библиотекам
масс-спектров [76].
Наибольшие успехи СФХ/МС последнего времени связаны с медициной,
прежде всего с липидным анализом. Так, родственные простагландину изопро-
станы являются продуктами окисления полиненасыщенных жирных кислот и
генерируются организмом в условиях оксидативного стресса, например в мозге
людей с болезнью Альцгеймера. Метод СФХ/МС/МС с успехом используется
для идентификации региоизомеров и энантиомеров этих соединений. Хиральная
хроматография позволяет разделить изомеры, а тандемная масс-спектрометрия
(мониторинг заданных реакций, разд. 12.3) провести их идентификацию и коли-
чественное определение [77]. Применение двумерного СФХ/СФХ/МС метода для
разделения и анализа сложных смесей рацематов фармацевтических препаратов с
многочисленными примесями продемонстрировало, что ахиральное и хиральное
разделение могут быть успешно объединены в одном последовательном процессе
как в аналитическом, так и в препаративном варианте [78]. Разработана автомати-
зированная программа для высокопроизводительного профилирования липидов
в биологических жидкостях с использованием СФХ/МС и орбитальной ловуш-
ки [79]. Молекулы липидов подвергались разделению на обычной колонке С18 не
только по длине алкильных радикалов, но и по природе головных групп. Полное
профилирование осуществляется всего за 30 минут, что доказывает эффективность
предложенного подхода. Универсальность метода продемонстрирована при созда-
нии методики одновременного детектирования и количественного определения
17 пестицидов, обладающих широким разбросом молекулярных масс (112–888)
и полярности (log Pow от –4,6 до 7,05). Время СФХ/МС/МС анализа всей группы
пестицидов, для которых обычно используется комплекс и ГХ/МС, и ЖХ/МС,
составило лишь 11 минут [80].
Обзоры последних лет посвящены общим вопросам СФХ/МС [81], ее исполь-
зованию для исследования лекарственных препаратов [82, 83] и решения проблем
липидомики [84]. Благодаря высокому хроматографическому разрешению и воз-
можности разделять изомеры, включая оптические, СФХ/МС во многих случаях
оказывается эффективнее альтернативных подходов.
1.7. Капиллярный электрофорез /масс-спектрометрия,
КЭ/МС (Capillary Electrophoresis/Mass
spectrometry, CE/MS)
Альтернативой хроматографическим методам разделения компонентов образца
перед вводом в масс-спектрометр является капиллярный электрофорез [85]. Появ-
ление капиллярного варианта электрофореза существенно повысило разрешающую
способность разделения компонентов смесей (до 107 теоретических тарелок) и, как
следствие, эффективность анализа. Логичная стыковка электрофоретического ка-
пилляра с масс-спектрометром подняла этот метод на новый уровень [86, 87]. Метод
основан на разделении заряженных компонентов смесей в кварцевом капилляре
под действием приложенного электрического поля. Наиболее распространенным
вариантом метода КЭ в стыковке с масс-спектрометрией является капиллярный
зонный электрофорез (КЗЭ), основанный на различии в электрокинетических
подвижностях заряженных частиц в электролитах. Эта подвижность определяется
зарядом частиц и сопротивлением жидкости, которая зависит от размера и формы
иона.
В данном случае можно с натяжкой говорить о принципиально другой системе
ввода образца в масс-спектрометр, потому что в качестве интерфейса используются
устройства ЖХ/МС. Наилучших результатов удалось достигнуть при использова-
нии на выходе из колонки техники электрораспыления (разд. 5.13). Существуют
интерфейсы с подачей дополнительной жидкости и без нее. Первый вариант ха-
рактеризуется меньшей чувствительностью и хорошей воспроизводимостью, а вто-
рой – повышенной чувствительностью с ухудшенной воспроизводимостью [88, 89].
Возможно также [90–92] использование техники ультразвукового распыления
(разд. 5.13). Есть большое число работ по стыковке КЭ с МАЛДИ [93, 94]. Кстати,
именно фоновые электролиты создают основную сложность в интерфейсах КЭ/МС.
Тем не менее капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия по праву считается
самостоятельным методом анализа прежде всего биологических молекул (белков,
липидов, пептидов, аддуктов с ДНК и т.д.). Очень небольшой объем проб является
преимуществом метода, когда речь идет о работе с биологическими образцами,
доступными в ограниченных количествах. Одновременно этот аспект является
и недостатком, поскольку иногда чувствительности оказывается недостаточно и
требуется проводить концентрирование исходного образца [95]. Поскольку наряду
с очень малым количеством пробы (менее 10–10 литра) капиллярный электрофорез
позволяет проводить сверхбыстрое разделение компонентов смеси с шириной
пика в несколько миллисекунд [96], необходимо осуществлять такое же быстрое
сканирование спектра. В частности, впечатляющие результаты получены при
использовании времяпролетного анализатора с ортогональным ускорением [97].
Однако следует отметить, что в качестве детектора к КЭ может быть использо-
ван масс-спектрометр любого типа, например прибор ионного циклотронного
резонанса с преобразованием Фурье [98]. Несколько сотен ссылок на различные
аспекты и приложения метода КЭ/МС в биомедицинских исследованиях можно
найти в обзорах [99–101].
1.8. Ионная хроматография/масс-спектрометрия (ИХ/МС)
Существенно реже для целей органической химии используется комбинация ионная
хроматография/масс-спектрометрия (Ion chromatography/mass spectrometry, IC/MS).
Тем не менее это весьма перспективное аналитическое направление, особенно для
целей экологии, криминалистики и биомедицинских приложений [102, 103]. Метод
наиболее полезен для неорганических и органических ионов с низкими величинами
m/z, когда другие методы разделения оказываются не столь эффективными.
Первые публикации по этому направлению появились в середине 1990-х го-
дов [104, 105]. Методами ионизации в большинстве случаев оказываются электро-
распыление (разд. 5.13) или индуктивно связанная плазма [106]. В последнем
случае ИХ разделяет конкретные формы элементов в образцах, тогда как масс-
спектрометрический анализ без предварительного разделения позволяет установить
лишь интегральные уровни химических элементов. В качестве примера можно
привести количественное определение в образцах серусодержащих анионов S2–,
SO3
2–, SO4
2– и S2O3
2– [107] или ряда галогенсодержащих анионов [108].
Помимо катионов металлов и неорганических анионов, ИХ/МС может с
успехом применяться и для анализа органических ионов. В частности, пределы
детектирования 100 нг/л при регистрации анионов галогенуксусных кислот полу-
чены методом ИХ/ИЭР/МС [109]. С этими побочными продуктами хлорирования
питьевой воды не так просто работать классическими методами ГХ/МС и ЖХ/МС.
Методика количественного определения восьми органических кислот методом
ИХ/МС описана в работе [110].
Существует несколько вариантов ионной хроматографии. Их обсуждение вы-
ходит за рамки данного пособия. В частности, вариантом анализа ИХ/МС является
формирование ионных ассоциатов, когда, например, из двухзарядного аниона
получают устойчивый продукт с трехзарядным катионным реагентом. В результате
образуется аналит с большей массой, который можно определять в режиме реги-
страции положительных ионов [111, 112].
Поскольку современная ионная хроматография позволяет за один ввод об-
разца работать и с катионами, и с анионами, эффективно использование масс-
спектрометров с чередующейся регистрацией положительных и отрицательных
ионов [104, 105, 113]. Очень песпективен для ИХ/МС вариант капиллярной ионной
хроматографии [114], устраняющий проблемы стыковки со стандартным источником
ИЭР. Хотя на первый взгляд кажется, что масс-спектрометрия высокого разрешения
не должна иметь значительных преимуществ для работы с низкомолекулярными
соединениями, недавние исследования с использованием орбитальных ловушек
продемонстрировали улучшенную чувствительность и надежность идентификации
и количественного определения органических и неорганических анионов [115, 116].
1.9. Атмосферный ввод
Самой простой системой ввода является атмосферный (капиллярный) ввод. Если
мы соединим источник ионов с атмосферой открытым капилляром, то благодаря
вакууму внутри масс-спектрометра через этот капилляр будут поступать молекулы
и ионы самых разных соединений в газообразном или аэрозольном состоянии.
Все современные методы ионизации на открытом воздухе (гл. 9) работают именно
с атмосферным вводом, при этом открытый конец капилляра должен находиться
в непосредственной близости от области образования ионов. Капилляр может
изготавливаться из самых разных материалов, а его длина может достигать не-
скольких метров, что в некоторых случаях остро необходимо. Например, при масс-
спектрометрическом контроле проведения хирургических операций открытый
конец каппиляра закреплен на электроскальпеле хирурга, т.е. достаточно далеко
от масс-спектрометра [117]. Если в работе используется обычный лабораторный
масс-спектрометр, то современные насосы успешно справляются с откачкой. Не-
сколько сложнее обстоит дело с портативными масс-спектрометрами, хотя и здесь
есть эффективные решения [59].
ГЛАВА 2
ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРОЦЕССОВ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ
Поскольку масс-спектрометрия имеет дело с положительными или отрицательными
ионами, после ввода вещества в прибор необходимо провести ионизацию молекул
образца. На сегодняшний день существует более сотни методов ионизации. Часть
из них используется очень активно, часть – только в единичных экспериментах.
Популярность метода может достигать максимума в какой-то момент времени, а
затем с появлением новых, более эффективных, сходить на нет.
2.1. Электронная ионизация (Electron Ionization, EI)
Среди различных методов ионизации особое положение занимает ионизация
электронами (ИЭ). Исторически это первый метод ионизации органических со-
единений. Он же остается и наиболее распространенным на сегодняшний день.
Основными достоинствами метода являются надежность и универсальность.
Кроме того, в существующих компьютерных библиотеках масс-спектров (WILEY
и NIST) используются именно спектры ИЭ. Теории масс-спектрометрической
фрагментации и подходы к интерпретации спектров, о которых идет речь в этой
главе и последующих (гл. 3, 4), также базируются в основном на первоначальном
образовании молекулярного катион-радикала в результате электронной ионизации.
Старое название метода – электронный удар – несколько не соответствова-
ло действительности. Реального удара электронов по молекуле не происходит.
Электрон, пролетая вблизи молекулы, возбуждает ее электронную оболочку. Соб-
ственные электроны молекулы перемещаются на более высокие орбитали и могут
покинуть молекулу. В связи с этим термин «электронный удар» недавно официально
заменен на «электронную ионизацию» или «ионизацию электронами».
Пучок электронов генерируется катодом (проволока или пластина из рения
или вольфрама) и ускоряется потенциалом 12–70 В по направлению к аноду
(рис. 2.1). Вещество в газовой фазе (давление 10–5–10–6 мм рт.ст.) взаимодействует
с электронами и ионизируется. Формально можно представить процесс ионизации
уравнением (2.1):
M + ē = M+• + 2ē (2.1)
В результате образуется молекулярный ион (М+•). Это – нечетноэлектронный
ион, т.е. катион-радикал. Эффективность ионизации очень низка. Ионизируется при-
мерно одна из десяти тысяч молекул образца. Более 99,99% неионизованных молекул
вещества откачивается из источника вакуумными насосами. Этот факт тем не менее
позволяет еще раз подчеркнуть высочайшую чувствительность масс-спектрометрии,
поскольку для получения спектра нужны пикограммовые (10–12) количества вещества.
Эффективность ионизации меняется от вещества к веществу. Эта характеристика
соединения имеет количественный показатель, называемый сечением ионизации.
Важным параметром является энергия ионизирующих электронов. График зави-
симости ионного тока (количество образующихся ионов) от энергии ионизирующих
электронов представлен на рис. 2.2. Ионный ток достигает максимума при энергиях
электронов около 50 эВ. Именно такая энергия использовалась в советских приборах
1960–1970-х годов. Однако уже более 40 лет стандартные масс-спектры ИЭ во всем
мире принято регистрировать, используя ионизирующие электроны с энергией
около 70 эВ. Именно такая энергия, помимо высокой эффективности ионизации,
дает возможность получать и наболее стабильные спектры. Пучок электронов не
монохроматичен, причем разброс по энергиям, как правило, очень велик и может
достигать 5 эВ. Это приводит к тому, что условия взаимодействия вещества с низ-
коэнергетическими электронами (крутая часть графика на рис. 2.2) нестабильны, а
соответственно, не стабилен и масс-спектр. Чем меньше угол наклона кривой эф-
фективности ионизации в какой-либо точке, тем выше стабильность масс-спектра,
поэтому высокоэнергетическая часть кривой предпочтительна. Уменьшение энергии
от 70 эВ приведет к меньшей стабильности спектра, а увеличение – к меньшей чув-
ствительности. Следует также отметить, что все существующие библиотеки, включая
последнюю версию наиболее популярной библиотеки NIST14, созданы на базе
масс-спектров, полученных при энергиях ионизирующих электронов 70 эВ.
Для того чтобы молекула образца потеряла свой электрон, необходима энергия
ионизирующих частиц выше какого-то определенного критического значения.
Эта энергия характеристична для каждого индивидуального соединения и называется
энергией ионизации (ЭИ). Поскольку каждая молекулярная или атомная орбиталь имеет
свою собственную энергию, молекула имеет несколько значений энергии иониза-
ции (см. метод фотоэлектронной спектроскопии [118]). В масс-спектрометрии под
энергией ионизации подразумевается минимальная энергия, требуемая для потери
наиболее доступного электрона, т.е. энергия высшей занятой молекулярной орбитали.
Величина ЭИ для большинства органических соединений лежит в диапазоне 6–12 эВ.
Если энергия электронов, эмиттируемых катодом, ниже ЭИ, ионизация образца не-
возможна, и масс-спектра не будет.
В процессе ионизации молекулярный ион получает избыточную внутреннюю
энергию в диапазоне 0–20 эВ. Эта избыточная энергия равномерно распределяется
по всем связям, причем превышение энергии какой-либо связи ведет к ее разрыву с
отщеплением нейтральной радикальной частицы и образованием четноэлектронно-
го осколочного (фрагментного) иона. Вторым важнейшим процессом фрагментации
являются перегруппировки с выбросом нейтральной молекулы и образованием
нечетноэлектронного (катион-радикала) перегруппировочного иона. Минимальная
энергия ионизирующих электронов, при которой в масс-спектре, помимо молеку-
лярного, будет регистрироваться фрагментный ион, называется энергией появления
(ЭП) данного иона. Чем выше энергия ионизирующих электронов, тем большее
число направлений распада М+• реализуется, причем, если внутренняя энергия
осколочного иона остается высокой, могут идти вторичные процессы его распада.
Принимая во внимание, что различия в ЭП осколочных ионов очень незначи-
тельны, небольшие изменения энергии ионизирующих электронов могут приво-
дить к весьма существенным изменениям в масс-спектре. Если учесть отсутствие
монохроматичности пучка ионизирующих электронов, понятно, что оптимальные
условия получения спектра достигаются при энергиях электронов 50–70 эВ, когда
максимален выход ионов, минимален наклон кривой эффективности ионного
тока (рис. 2.2), а также задействованы все возможные направления распада М+•.
Наряду с однозарядными, образуются двух- и многозарядные ионы. Количество
многозарядных ионов существенно меньше, чем однозарядных, и зависит прежде
всего от структуры молекул образца, а также от условий эксперимента. Например,
повышенным выходом многозарядных ионов характеризуются полициклические
ароматические углеводороды (разд. 10.5).
В некоторых случаях, когда хотят увеличить интенсивность пика М+•, снимают
спектр, используя ионизирующие электроны с энергией 12–20 эВ. Следует подчер-
кнуть, что в этом случае возрастает только относительная интенсивность пика М+• и
пиков перегруппировочных ионов по отношению к интенсивности пиков осколоч-
ных ионов, тогда как абсолютная интенсивность всех пиков в спектре падает. Кроме
того, происходит потеря определенной информации, так как не все направления
фрагментации реализуются в таких условиях. Это положение проиллюстрирова-
но на рис. 2.3. Видно, что при уменьшении энергии ионизирующих электронов
уменьшается число и интенсивность пиков в спектре, а относительная доля моле-
кулярного иона возрастает. Хотя М+• становится максимальным в спектре, растет
именно относительное количество этих ионов, а абсолютное количество становится
меньше, чем при 70 эВ, поскольку падение интенсивностей осколочных ионов идет
значительно активнее. Нормирование спектра в результате осуществляется по М+•
и создается впечатление, что его интенсивность становится значительно выше.
Важный вывод, который следует помнить: если пик молекулярного иона отсутствует
в масс-спектре, полученном при энергии ионизирующих электронов 70 эВ, его не будет
и при меньшей энергии электронов. В этом случае можно говорить о нестабильности
молекулярного иона данного соединения. Кстати, значительное число органических
соединений характеризуется нестабильными молекулярными ионами в условиях
ИЭ [119]. Это один из существенных недостатков данного метода ионизации.
Стоит отметить, что, если снизить внутреннюю энергию молекул образца до ми-
нимума, можно получать интенсивные пики молекулярных ионов даже при работе
с алканами (при обычных условиях съемки они ничтожно малы либо вообще от-
сутствуют). Например, метод ГХ/МС с интерфейсом ультразвуковых молекулярных
пучков [120] позволяет получать спектры алканов, в которых молекулярные ионы
имеют 100% интенсивность (рис. 2.4). Это достигается направлением элюата, разбав-
ленного струей гелия, из колонки в источник открытого типа с большой скоростью
(до 100 мл/мин). При расширении в вакууме кинетическая энергия пучка возрастает,
а внутренняя (колебательная) понижается в связи с «охлаждением» аналитов до тем-
пературы нескольких десятков градусов Кельвина. В отсутствие столкновений с горя-
чими стенками источника большая часть образующихся молекулярных ионов имеет
энергию, недостаточную для протекания фрагментации. Подробнее о методе ГХ/МС
с интерфейсом ультразвуковых молекулярных пучков можно прочитать в обзоре [65].
В условиях ионизации электронами наряду с положительными образуются и
отрицательные ионы (молекулярные анион-радикалы). К сожалению, качество
спектров отрицательных ионов в этом случае оставляет желать лучшего. В част-
ности, доминирующий пик в спектре зачастую обусловлен малоинформативным
ионом (Cl–, F–, CN–). Кроме того, выход отрицательных ионов значительно мень-
ше, чем положительных. Тем не менее информация, заключенная в масс-спектрах
отрицательных ионов, может служить хорошим дополнением к полученной с ис-
пользованием положительных ионов. Детали фрагментации молекулярных анион-
радикалов основных классов органических соединений, полученных в условиях
ИЭ, подробно рассмотрены в работе [121].
Качество и информативность спектров отрицательных ионов можно повысить
при использовании электронов с малыми (тепловыми) энергиями. Метод называ-
ется резонансный захват электрона и заключается в ассоциации электрона одной из
молекулярных орбиталей молекулы образца [35]. Как правило, ионы образуются
в нескольких резонансных областях с захватом электронов с энергиями 0–10 эВ.
Эти области могут характеризоваться разными выходами ионов и разными на-
правлениями фрагментации молекулярных анион-радикалов. Например, молекулы
4-циано-5-гидрокси-1,2,3-триазола и изомерного 2-диазо-2-цианоацетамида захва-
тывают электроны в четырех резонансных областях энергий: 0,1; 1,5; 5,0 и 7,5 эВ,
причем в трех последних ионные токи оказываются на 2–3 порядка ниже [122].
Наличие нескольких резонансных областей придает масс-спектру дополнительное
измерение, поскольку каждое химическое соединение, фактически, характеризу-
ется несколькими масс-спектрами. Этот факт открывает хорошие перспективы
по масс-спектрометрической идентификации структурно близких соединений.
К сожалению, эти потенциальные возможности резонансного захвата электрона
реализованы на сегодняшний день далеко не в полной мере, хотя в последнее вре-
мя метод электронного захвата все шире и эффективнее используется для анализа
биологических молекул [123, 124]. Другим примером использования электронного
захвата является метод селективного определения соединений, содержащих гетеро-
атомы, в нефти. Он основан на разности энергий электронов, которые захватываются соединениями разных типов. Если большинство углеводородов нефти захва-
тывают электроны только с энергиями более 10 эВ, то гетероатомные компоненты
образуют анион-радикалы при взаимодействии с электронами, энергия которых
приближается к нулю [125].
Возвращаясь к классическому варианту спектров ионизации электронами,
можно отметить, что, поскольку давление в источнике ионов в условиях ИЭ
10–5–10–6 мм рт.ст., а образец можно нагревать до нескольких сот градусов, в газо-
вую фазу переходят многие органические соединения. Тем не менее у ионизации
электронами есть существенные недостатки. Метод не пригоден для анализа
термолабильных, высокомолекулярных, труднолетучих соединений. В спектрах
ИЭ многих веществ пик М+• имеет низкую интенсивность либо вообще отсутству-
ет [119]. Широкий разброс по энергиям ионизирующих электронов не позволяет
с достаточной точностью определять характеристики молекул и ионов (энергии
появления и ионизации). Работа над устранением этих недостатков привела к
созданию представительного ряда альтернативных методов ионизации (гл. 5).
2.2. Физические основы масс-
спектрометрической фрагментации
Существует ряд более или менее строгих подходов к описанию процессов образо-
вания и фрагментации молекулярных ионов. К сожалению, на сегодняшний день
ни один из них не может надежно предсказать массовые числа и интенсивности
пиков всех ионов в спектре даже достаточно простых органических соединений. Во
избежание чрезмерного углубления в физику и математику в данном разделе будут от-
ражены лишь основные подходы, преимущества и недостатки существующих теорий.
Практически любой процесс генерирования заряженной частицы сопряжен с
передачей ей дополнительной внутренней энергии. В частности, в случае наиболее
распространенного (и наиболее жесткого) метода ионизации, каким является ио-
низация электронами, образующиеся молекулярные ионы могут иметь избыточную
энергию в диапазоне 0–20 эВ. Для химии растворов 20 эВ на частицу означало
бы, что энергия системы составляет порядка 2000 кДж/моль, т.е. значительно
выше энергии реакционных частиц, образуемых в растворах. Распределение об-
разовавшихся молекулярных ионов по энергиям (верхняя часть рис. 2.5) можно
представить в виде вероятностной функции Р(Е). Эта кривая в определенной мере
напоминает фотоэлектронный спектр данной молекулы. В растворах в результате
столкновений происходит усреднение энергии частиц. В ионизационной камере
масс-спектрометра все определяется процессом ионизации. В случае, например,
химической ионизации (гл. 5) достаточно высокое давление в источнике приво-
дит к многочисленным столкновениям ионов, радикалов и молекул, т.е. можно
говорить об определенном усреднении их внутренней энергии. Напротив, условия
высокого вакуума при использовании ионизации электронами препятствуют стол-
кновениям частиц, и судьба образовавшегося иона зависит исключительно от той
внутренней энергии, которую он приобрел в результате ионизации. Именно эта
энергия определяет то, что одна часть ионов достигнет детектора без фрагмента-
ции, другая в виде каких-либо перегруппировочных ионов, третья – каких-либо
осколочных ионов, четвертая – фрагментных ионов второго поколения и т.д. Сле-
дует подчеркнуть, что, поскольку речь идет о мономолекулярных реакциях изоли-
рованных частиц, живущих очень короткое время, набор и количество продуктов
реакции определяются прежде всего кинетическими, а не термодинамическими
факторами.
Здесь имеет смысл напомнить, что молекулярный ион образуется в результате
ионизации молекулы (потеря электрона). Его величина m/z соответствует молеку-
лярной массе соединения (за минусом массы электрона, что необходимо учитывать,
используя масс-спектрометрию высокого разрешения). Фрагментные ионы об-
разуются при распаде молекулярного. Осколочные ионы образуются в результате
простых разрывов связей. Перегруппировочные ионы наряду с разрывами связей
требуют образования новых связей между атомами (группами), не связанными
напрямую в исходной молекуле.
2.2.1. Квазиравновесная теория
В 1952 году практически одновременно возникли две теории, направленные на
интерпретацию мономолекулярных реакций в газовой фазе в условиях глубокого
вакуума. Розенштоком [126] было предложено физическое описание процессов
в источнике масс-спектрометра. Эта теория была названа квазиравновесной,
поскольку постулировала, что за 10–12 секунды избыточная энергия равномерно
распределяется по всем связям в молекуле, точнее, по всем энергетическим состо-
яниям молекулярного иона, т.е. квазиравновесие между всеми этими состояниями
достигается до того, как начнется фрагментация. Вероятности путей фрагментации
определяются только энергией и структурой каждого конкретного иона, а не методом
ионизации, механизмом образования или структурой предшественника (для фраг-
ментных ионов). Исключения связаны, как правило, с простейшими молекулами,
случаями далеко отстоящих друг от друга возбужденных электронных состояний
и быстрыми (k >1011) процессами распада. Близкая КРТ теория описывает про-
цессы в нейтральных молекулах. Она была названа по фамилиям ее авторов Райса,
Рампсберга, Касселя и Маркуса РРКМ [127].
Обе теории базируются на определенных допущениях.
1. Вращательные, колебательные, электронные и поступательные движения
частиц независимы друг от друга.
2. Движения ядер могут быть описаны уравнениями классической механики,
хотя и с учетом квантовохимических коррекций.
3. Все микросостояния частиц равновероятны, т.е. энергия равновероятно рас-
пределяется по всем степеням свободы иона.
4. Существует энергетическая граничная поверхность, разделяющая ионы-пред-
щественники и ионы-продукты. Эта поверхность может пересекаться только
в одном направлении, т.е. для любого иона-предшественника достижение
этого переходного состояния означает необратимый распад с образованием
продуктов.
Основная задача теорий – расчет скоростей фрагментации частиц с разрывом
любой химической связи в зависимости от избытка внутренней энергии. Рассмо-
трим несколько подробнее ионизацию электронами. Сам процесс потери электрона
нейтральной молекулой протекает за 10–16 секунды. По принципу Франка – Кондо-
на [128] расстояния между ядрами при этом не изменяются. Колебания ядер могут
начаться через 10–12–10–13 секунды. После ионизации молекулярные ионы могут
оказаться на любых уровнях всех возбужденных (вращательных, колебательных,
электронных) состояний. Важно, что ион в возбужденном электронном состо-
янии живет не более 10–8 секунды. За это время в результате излучательных или
безызлучательных процессов ион переходит в основное электронное состояние,
либо фрагментирует. Поскольку время присутствия ионов в источнике иониза-
ции электронами 10–6 секунды, около 99% времени ион находится там в основном
электронном состоянии. Когда, представляя схему фрагментации, указывают заряд
иона на конкретном атоме, это не означает, что в результате ионизации электрон
удален именно из этого места. Речь идет об изображении иона в основном электрон-
ном состоянии.
Вероятность какой-либо трансформации (изомеризация, фрагментация) мо-
лекулярного иона зависит от его внутренней энергии (рис. 2.5 нижняя часть), т.е.
от константы скорости k(E) конкретной реакции. Та часть молекулярных ионов,
энергия которых ниже критической энергии (Е0) для самой низкоэнергетической
реакции фрагментации, регистрируется в виде М+•. Предположим, что молеку-
лярный ион соединения АВХY может распадаться с разрывом центральной связи
В–Х, или претерпевать перегруппировку с образованием химической связи между
ранее несвязанными А и Y (схема 2.1).
Вернемся к рис. 2.5. Если Е(М+•) < Е0(АY+•), ион стабилен и регистрируется
как М+•. Обозначим как Е1/2(АY+•) такую энергию, при которой ровно половина
М+• фрагментирует с образованием АY+•, а половина остается в виде М+•. Анало-
гично Е1/2(АВ+) соответствует энергии, при которой половина М+• фрагментирует
с образованием АУ+•, а половина – с образованием АВ+, т.е. для представленного
на рис. 2.5 случая все молекулярные ионы с энергией выше Е1/2(АВ+) будут рас-
падаться с образованием АВ+, так как в этой точке скорость образования АВ+
становится выше скорости образования АY+•. Формально, площади под кривыми
на рис. 2.5 с обозначениями М+•, АY+•, АВ+ соответствуют долям тока этих ионов
в полном ионном токе. Однако необходимо подчеркнуть, что эти доли являются
начальными. Для вычисления реальной интенсивности соответствующих пиков
в масс-спектре необходимо учитывать вторичные процессы фрагментации этих
первичных ионов.
При изменении распределения внутренней энергии М+• (функция Р(Е)) вид
масс-спектра может существенно меняться. Некоторые реакции частично или
полностью подавляются более выгодными для данной энергии ионов. Изменением
распределения Р(Е) объясняется, в частности, изменение спектра ИЭ при снижении
энергии ионизирующих электронов (рис. 2.3).
Один из вариантов записи масс-спектрометрической информации в графиче-
ском виде представлен на рис. 2.6. Пусть молекулярный ион АВХY+• фрагментирует
(схема 2.1) в результате простого разрыва связи (ион АВ+) или с перегруппировкой
(ион АY+•). Рисунок 2.6 демонстрирует изменение спектра с изменением внутренней
энергии М+•. Вертикальное сечение позволяет получить масс-спектр при конкрет-
ном значении энергии М+•.
Как видно из рис. 2.5 и 2.6, реакция с низшей Е0 далеко не всегда приводит к
наиболее интенсивному фрагментному иону. Для рассматриваемой молекулы АВХY
реакция образования иона АY+• имеет предпочтительную энтальпию, в то время как
энтропийный фактор благоприятствует возникновению иона АВ+. Действительно,
в первом случае рвутся две связи (АВ и ХY) и две связи (АY и ВХ) образуются, т.е.
энергетические затраты невелики. Во втором случае происходит разрыв одной связи
(ВХ), но новых связей не образуется. С другой стороны, стерические требования в
первом случае значительно строже. Ион АВ+ может образоваться, как только связь
ВХ будет обладать достаточной для разрыва колебательной энергией, а для возникнове-
ния иона АY+• необходим подход А к Y с искажением валентных углов на достаточное
для образования новой связи расстояние, что реализуется лишь для небольшой ча-
сти многочисленных конформаций М+•, имеющих достаточную для такого процесса
энергию. Этот простой пример демонстрирует конкуренцию различных направлений
фрагментации и объясняет сложность масс-спектров в случае многоатомных молекул.
Изменение потенциальной энергии вдоль координаты реакции для простого
разрыва связи и перегруппировки представлено на рис. 2.7. Для реакции простого
разрыва связей (рис. 2.7, левая часть) обратный процесс протекает практически
всегда без энергии или с минимальной энергией активации (Er), а для перегруп-
пировок (рис. 2.7, правая часть) обратный процесс может иметь значительную
энергию активации.
Ранее были введены определения энергии ионизации (ЭИ) молекулы и энергии
появления (ЭП) иона. Если для установления ЭП(АY+•) фиксировать появление в
спектре пика иона АY+•, будет измерена не Е0(АY+•), а Е1/2(АY+•). Величина Е1/2 – Е0
называется кинетическим сдвигом. Обычно он невелик (0,01–0,1 эВ), но для орга-
нических молекул может достигать величин до 2 эВ. Для случая АВ+ измерение
Е0(АВ+) еще больше усложнено, поскольку дополнительно к кинетическому сдвигу
возникает так называемый конкурентный сдвиг; при Е < Е1/2(АВ+) М+• будет пред-
почтительно фрагментировать с образованием АY+•.
Для больших молекул ситуация несколько отличается, поскольку внутренняя
тепловая энергия, распределенная по многочисленным степеням свободы, зна-
чительно больше. В частности, для белковой молекулы с молекулярной массой
8400 Да она составит примерно 30 эВ при 430 К [129]. Кинетические сдвиги для
белковых молекул очень велики. Они могут превосходить Е0 на 5 эВ. Например,
при поверхностно-индуцированной диссоциации пептидов (8-членные с массой
около 1000) с Е0 около 1,3, чтобы увидеть фрагментный ион, внутренняя энергия
должна была быть повышена на 8 эВ [130].
Тем не менее следует отметить, что масс-спектрометрическое измерение ЭИ,
ЭП и сродства к электрону в сочетании с известными термохимическими характе-
ристиками нейтральных частиц позволяет вычислять теплоты образования ионов и
энергии связей. Масс-спектрометрически можно изучать нестабильные радикалы
и получать информацию об энергиях химических связей, недостижимую при ис-
пользовании других методов.
Измерение ЭП фрагментных ионов является важным методом установления их
структур. Пусть необходимо установить структуру иона АВ+, образующегося при
распаде АВХY+•. Если ионы такого же состава были изучены ранее (например, при
их образовании из АВСD+•, АВ2Y+• и т.д.) и для них были установлены структуры
и теплоты образования, необходимо измерить ЭП иона АВ+, образующегося из
АВХY+•, и рассчитать теплоту его образования по уравнению (2.2):
ΔH(АВ+) = ЭП + ΔH(АВХY) – ΔH(ХY) (2.2)
Совпадение полученной величины ΔH(АВ+) с аналогичной величиной для иона
АВ+ известной структуры, полученного в результате другого процесса, является
весомым свидетельством в пользу их единой структуры. Понятно, что, если вели-
чина ΔH(АВ+) значительно отличается от ΔH всех изученных ранее ионов АВ+,
можно утверждать, что исследуемый ион обладает другой структурой. Развитие
компьютерных расчетов с помощью эмпирических методов или ab inicio позволило
проверять приписываемые ионам структуры при сравнении экспериментальных и
расчетных величин теплот их образования.
2.2.2. Фотодиссоциация, разрешенная во времени
Метод фотодиссоциации, разрешенной во времени (Time-Resolved Photodissociation,
TRPD), предложен Данбаром [131] для измерения кинетики медленных про-
цессов диссоциации, инициированных фотонами, и расчетов соответствующих
пороговых энергий на базе измеренных скоростей диссоциации [132]. Метод
применяется к ион-радикалам, генерированным фотоионизацией из нейтральных
молекул в газовой фазе. Перевод в газовую фазу обычно осуществляется лазерной
десорбцией [133]. Фотодиссоциативный импульс прикладывается после термали-
зации ионов-предшественников и удаления всех фрагментов, образовавшихся в
процессе фотоионизации. Длина волны для фотодиссоциации выбирается таким
образом, чтобы передать молекуле известное количество внутренней энергии для
инициирования фрагментации по конкретному хромофору. Хорошо подобранная
частота фотодиссоциативного импульса приводит к появлению единственного
фрагмента. Общая внутренняя энергия диссоциирующего иона принимается равной
E* = Ephoton + Etermal. Спектры записываются с различными временными задержками,
а относительные интенсивности фрагментных ионов регистрируются относительно
времени задержки. Таким образом строится кривая TRPD. Метод позволяет из-
мерять константы скоростей в диапазоне от 1 до 106 с–1.
Например, образование иммониевого иона лейцина из катион-радикалов ис-
ходных LeuTyr и LeuLeuTyr характеризуется константами скорости 4,8 × 103 с–1 и
2,9 × 102 с–1 соответственно. Существенно более низкая скорость для большего
пептида объясняется внутримолекулярным перераспределением колебательной
энергии, т.е. рандомизацией полученной энергии перед диссоциацией. Это со-
гласуется с теорией РРКМ, согласно которой рандомизация энергии предшествует
фрагментации.
Термохимическая информация может быть извлечена из кривых TRPD при
их моделировании с использованием расчетов РРКМ в комбинации с квантово-
химической теорией [133]. В частности, для примера иммониевого иона лейцина
достигнуто отличное совпадение между экспериментальной и рассчитанной на
основании кривых TRPD величиной E0 = 1,4 эВ и ΔS‡ = 64–77 Дж/моль × К.
Возможности современных методов для определения величин энергий разрыва
химических связей в катионах представлены в обзоре [134].
2.3. Метастабильные ионы
Кинетический сдвиг при определении ЭП обусловлен тем, что осколочный ион
появляется в масс-спектре только из тех М+•, энергия которых достаточна для
протекания соответствующей реакции с константой скорости не ниже 106. Однако
существует возможность регистрировать процессы с константой скорости 105. Де-
ло в том, что ион покидает источник ионизации электронами за 10–6 секунды, но
достигает детектора за 10–5 секунды, т.е., обладая достаточной энергией, он может
фрагментировать по пути следования.
Рассмотрим, как будет регистрироваться этот ион, называемый метастабиль-
ным, в магнитном секторном приборе. Пусть ион m1
+ покидает ионный источник,
ускоряется напряжением V и распадается с образованием иона m2
+ и нейтральной
частицы m3
0 в бесполевом пространстве между источником и магнитным анализа-
тором.
m1
+ → m2
+ + m3
0
Пусть vn скорость иона с массой mn. Тогда в бесполевом пространстве право-
мерны уравнения сохранения энергии и момента количества движения:
m1v1
2 = m2v2
2 + m3v3
2 (2.3)
m1v1 = m2v2 + m3v3 (2.4)
Так как m1 = m2 + m3, оба уравнения могут быть справедливы только в случае
v1 = v2 = v3, т.е. в первом приближении можно считать, что продукты фрагментации
движутся в том же направлении и с теми же скоростями, что и ион-предшественник.
Магнитный сектор масс-спектрометра является анализатором моментов. Поэтому
метастабильный ион с реальной массой m2 и скоростью v1 будет регистрироваться
вместе со стабильным ионом m*, обладающим скоростью v*, при равенстве их
моментов (уравнение (2.5)).
m*v* = m2v1 (2.5)
Уравнение (2.6) справедливо для любого стабильного иона.
.
2 2
* * 2
1 1
2
eV
m v m v
(2.6)
Исходя из двух уравнений (2.5) и (2.6), получаем уравнение (2.7) для расчета
регистрируемой массы метастабильного иона:
m
(2.7)
Таким образом, метастабильный ион, образующийся в первом бесполевом про-
странстве однофокусного магнитного масс-спектрометра, будет регистрироваться в
спектре с кажущейся массой, рассчитываемой по уравнению (2.7). Метастабильные
ионы проявляются в спектре в виде слабых уширенных пиков. Низкая интенсив-
ность обусловлена незначительной долей молекулярных ионов, энергия которых
благоприятствует их распаду вне источника. Даже наиболее низкоэнергетический
процесс (перегруппировка с образованием иона АY+•, рис. 2.5) приводит к слабому
пику метастабильного иона. Для более высокоэнергетических реакций образование
стабильного иона в результате менее энергоемкого процесса выгоднее образования
альтернативных метастабильных ионов. Пики последних могут вообще не наблю-
даться в спектре. Уширение пика метастабильного иона связано с высвобождением
части внутренней энергии при фрагментации. Эта энергия переходит в кинетиче-
скую, причем направление приращения может быть от полностью совпадающего до
прямо противоположного относительно скорости движения распадающегося иона.
Регистрация в спектре метастабильного иона очень полезна, поскольку по-
зволяет доказать протекание конкретной реакции, связывающей ион-продукт и
ион-предшественник. Схемы масс-спектрометрической фрагментации считаются
надежно доказанными, если они подтверждены пиками метастабильных ионов.
С другой стороны, пики метастабильных ионов ухудшают разрешение в спектре.
В зависимости от количества энергии, выделяющейся при фрагментации в бес-
полевом пространстве, форма пиков метатабильных ионов может быть разной
(рис. 7.5). К сожалению, эти пики исчезают из спектра в результате его компью-
терной обработки.
Так как электростатический анализатор пропускает ионы в зависимости от их
энергии, метастабильные ионы, обладающие меньшей энергией по сравнению со
стабильными, через него не проходят. Тем не менее пики метастабильных ионов
проявляются в масс-спектре, полученном на двухфокусном приборе прямой гео-
метрии (разд. 6.2), если фрагментация идет во втором бесполевом пространстве
после прохождения электростатического анализатора.
Многие масс-спектрометры позволяют работать в режиме получения спектров
исключительно метастабильных ионов с дефокусировкой стабильных. В данном
случае речь идет о варианте тандемной масс-спектрометрии (гл. 7). Так можно
получать все виды спектров (ионов-продуктов, ионов-предшественников, выбро-
сов идентичных нейтральных частиц). Такие спектры позволяют устанавливать
направления фрагментации, решать структурные задачи. Однако интенсивность
сигналов и даже наличие или отсутствие пиков конкретных ионов в спектрах зависит
от энергии ионов-предшественников. Поэтому в отличие от спектров активации
соударением (разд. 7.1) различия в спектрах метастабильных ионов-продуктов двух
ионов-предшественников не обязательно свидетельствуют об их разной структуре.
Примером использования метастабильных ионов может служить масс-спектро-
метрическое исследование N-фенил-4-циано-5-гидрокси-1,2,3-триазола [135].
Ионы [M–N2]+• триазолов обычно циклизуются в азирины [136] (схема 2.2). Однако
спектр метастабильных ионов-продуктов свидетельствует о том, что одним из на-
правлений фрагментации [M–N2]+• ионов N-фенил-4-циано-5-гидрокси-1,2,3-
триазола является отщепление радикала NCO•. Такой процесс невозможен для
азирина и заставляет предположить более сложную трансформацию первичного
иона [M–N2]+•, например образование оксиндола при взаимодействии радикаль-
ного центра с бензольным ядром (схема 2.2).
Метастабильные ионы позволяют также получать важную физико-химическую
информацию. Например, Кукс [137] предложил метод определения основности
молекул, базирующийся на спектрах метастабильных ионов. Он основан на срав-
нении скоростей конкурентных реакций фрагментации метастабильных ионов
(cхема 2.3).
В1Н+ + В2 ← В1НВ2
+ → В2Н+ + В1
Схема 2.3
Поскольку у таких реакций частотные факторы должны быть идентичными, их
скорости определяются исключительно энергиями активации конкурентных про-
цессов. Так как энергия активации обратных процессов (ион-молекулярная реакция
без перегруппировки) ничтожно мала, разница в энергиях активации определяется
исключительно разницей в сродстве к протону соответствующих оснований.
Если в источнике химической ионизации генерировать ионы В1НВ2
+ и выделить
их с помощью магнитного анализатора, можно исследовать их фрагментацию в бес-
полевом пространстве, регистрируя продукты метастабильного распада в электро-
статическом анализаторе (гл. 7). Различие в интенсивностях пиков B1H+ и В2Н+
соответствует различию их величин сродства к протону, а следовательно, позволяет
сравнивать основности молекул. Благодаря тому, что метастабильные ионы обла-
дают минимальной энергией возбуждения, достаточной для фрагментации, метод
обладает высочайшей чувствительностью, причем лучшие результаты получаются
для наиболее близких по силе оснований, так как интенсивности соответствующих
пиков в спектре оказываются близки по интенсивности.
2.4. Полуколичественная теория фрагментации
К сожалению, строгая математизированная теория (КРТ или РРКМ) не применима
к реальным органическим соединениям. За исключением простейших молекул эти
подходы требуют слишком большого времени даже для современной компьютерной
базы. Кроме того, значительные ошибки могут быть вызваны незнанием реальных
структур ни ионов-предшественников, ни ионов-продуктов, ни переходного со-
стояния. Распределение энергии по связям также не очевидно. Максимальным
успехом строгих физических теорий можно считать расчеты спектров легких алканов
(пропан, бутан), т.е. простейших молекул с одним типом химических связей. Воз-
можно, в будущем с созданием следующих поколений компьютеров эти проблемы
удастся преодолеть.
Существует упрощенная полуколичественная КРТ теория описания процессов
фрагментации более сложных молекул. Для расчета констант скоростей реакций
распада используется уравнение (2.8):
(2.8)
где k – константа скорости, v – частотный фактор, Е – избыток внутренней энергии,
Е0 – критическая энергии конкретной реакции, N – число осцилляторов.
Частотный фактор обратно пропорционален мере стерических затруднений в
активированном комплексе (переходном состоянии) и фактически является чис-
ленной характеристикой изменения энтропии в процессе. Для простого разрыва
связи он принимается равным ее колебательной частоте (ИК-спектроскопия).
Для перегруппировочного процесса требуется конкретное расположение атомов
в пространстве, что приводит к уменьшению величины v. Число осцилляторов в
молекуле, содержащей n атомов, рассчитывается по формуле: N = 3n – 6. Однако
на практике оказывается, что не все осцилляторы равноценны, и величина k завы-
шается. Поэтому число осцилляторов обычно уменьшают в три раза.
При использовании этой упрощенной теории для расчета интенсивностей фраг-
ментных ионов в спектре нельзя забывать про вторичные процессы распада этих
ионов при наличии у них достаточной внутренней энергии. Интенсивность пика
иона в спектре зависит и от скорости его образования, и от скорости его распада.