eng
Содержание
Содержание
Список авторов 18
Список переводчиков 21
Предисловие к русскому изданию 22
Введение 23
Литература 28
Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии 29
1.1.
Базовые аспекты 29
1.2.
Ввод образца 32
1.3.
Ионизация 33
1.3.1.
Электронная ионизация 34
1.3.2.
Химическая ионизация 35
1.3.3.
Полевая ионизация 36
1.3.4.
Ионизация электрораспылением 38
1.3.5.
Химическая ионизация и фотоионизация при атмосферном давлении 39
1.3.6.
Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация 40
1.4.
Масс-анализаторы 40
1.4.1.
Секторные приборы 40
1.4.2.
Квадрупольные приборы 44
1.4.3.
Ионные ловушки 46
1.4.4.
Времяпролетные масс-спектрометры 46
1.4.5.
Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса
с преобразованием Фурье 47
1.4.6.
Орбитальные ловушки 48
1.5.
Детектирование ионов 49
Литература 49
Глава 2. Газовая хроматография /масс-спектрометрия — «рабочая лошадка»
для анализа объектов окружающей среды 52
2.1.
Общие вопросы 52
2.2.
Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 53
2.3.
Скорость сбора данных 63
2.4.
Какие соединения можно анализировать методом ГХ/МС 65
2.5.
Количественный анализ 69
2.6.
Выводы 73
Литература 73
Глава 3. Жидкостная хроматография / масс-спектрометрия — оптимальный метод
качественного и количественного анализа загрязнений окружающей среды 74
3.1.
Введение 74
3.2.
Методы и оборудование для мониторинга окружающей среды 75
3.2.1.
Почему для мониторинга окружающей среды используется
жидкостная хроматография? 75
3.2.2.
Почему ЖХ/МС (жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим
детектором) используется для мониторинга окружающей среды ? 76
3.3.
Соединение ЖХ с масс-спектрометром: проблемы и их решение 77
3.4.
Ионизация при атмосферном давлении 79
3.5.
Типы масс-спектрометров и их возможности для анализа образцов
из объектов окружающей среды 82
3.5.1.
Приборы с низким разрешением 82
3.5.2.
Приборы с высоким разрешением 85
3.6.
Анализ образцов 86
3.7.
Наиболее распространенные приложения 87
3.8.
Подтверждающий анализ 87
3.9.
Целевые подходы с использованием тандемной квадрупольной
масс-спектрометрии 89
3.10.
Скрининговые и исследовательские методы с использованием
масс-спектрометров типа QTOF 95
3.11.
Почему приборы типа QTOF используются для экологического контроля? 95
3.12.
Исследовательская работа по изучению продуктов трансформации 99
3.13.
Ближайшие и долговременные перспективы 100
Литература 101
Глава 4. Применение тандемной масс-спектрометрии для анализа загрязнений
окружающей среды 103
4.1.
Введение 103
4.2.
Тандемные масс-спектрометры 104
4.2.1.
Масс-спектрометрия высокого разрешения 104
4.2.2.
Тройные квадруполи 105
4.2.3.
Ионные ловушки 106
4.2.4.
Времяпролетная масс-спектрометрия (ВПМС) 108
4.2.5.
Линейные ионные ловушки 108
4.2.6.
Орбитрэп 110
4.3.
Приложения МС/МС к экологическому мониторингу 110
4.3.1.
Новые загрязняющие вещества 113
4.3.2.
Лекарственные препараты 115
4.3.3.
Пестициды и гербициды 115
4.3.4.
Аддукты ДНК и маркеры оксидативного стресса 118
4.3.5.
Поверхностно-активные вещества и красители 120
4.3.6.
Озон 120
4.4.
Заключение 121
4.5.
Замечание 122
Литература 122
Глава 5. Использование специализированного программного обеспечения
и библиотек масс-спектров в анализе объектов окружающей среды 128
5.1.
Введение 128
5.2.
Базы данных масс-спектров и программы библиотечного поиска 132
5.3.
Развитие баз данных масс-спектров 133
5.4.
Базы данных масс-спектров 135
5.5.
Другие базы данных масс-спектров 137
5.6.
Выбор диапазона сканирования в случае проведения поиска
по базам данных масс-спектров 139
5.7.
Программное обеспечение, используемое для проведения поиска
по базам данных масс-спектров 140
5.8.
Пример проведения правильной идентификации с помощью
программного обеспечения Agilent ChemStation 142
5.9.
Пример проведения правильной идентификации с помощью
программного обеспечения NIST MS Search 148
5.10.
Какой алгоритм библиотечного поиска является наилучшим? 152
5.11.
Интерпретатор масс-спектров NIST 152
5.12.
Использование базы данных масс-спектров ИЭ NIST при проведении
анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / масс-
спектрометрии 153
5.13.
База данных индексов удерживания NIST 156
5.14.
Программа для автоматического поиска компонентов и выделения
чистых масс-спектров AMDIS 158
5.15.
Определение точных значений m/z 162
5.16.
Дополнительное программное обеспечение, представляющее интерес
для масс-спектрометристов, работающих в области анализа объектов
окружающей среды 164
5.17.
Заключение 168
Литература 168
Глава 6. Передовые методы на основе ГХ/МС 170
6.1.
Режим быстрой ГХ/МС 170
6.1.1.
Оптимизация газохроматографической составляющей
в условиях быстрой ГХ/МС 171
6.1.2.
Вклад масс-спектрометрической составляющей при использовании
техники быстрой ГХ/МС 176
6.2.
ГХ / МС с интерфейсом ультразвуковых молекулярных пучков 179
6.3.
Двумерная газовая хроматография — масс-спектрометрия ГХ × ГХ/МС 188
6.3.1.
Принцип метода 188
6.3.2.
Преимущества метода ГХ × ГХ/МС 191
6.4.
Заключение 196
Литература 196
Глава 7. Масс-спектрометрия в нормальных условиях (Ambient Mass Spectrometry) —
анализ объектов окружающей среды без пробоподготовки 198
7.1.
Введение 198
7.2.
Наиболее часто используемые методы
масс-спектрометрии в нормальных условиях 200
7.2.1.
Десорбционная электрораспылительная ионизация (ДЭРИ, DESI)
и ионизация спреем с бумаги (paper spray ionization, PSI) 200
7.2.2.
Прямой анализ в режиме реального времени (ПАРВ, DART) 202
7.2.3.
Атмосферный зонд для анализа твердых образцов (ASAP) 203
7.2.4.
Экстракционная электрораспылительная ионизация (ЭЭРИ, EESI) 204
7.2.5.
Низкотемпературная плазма (LTP) 205
7.2.6.
Ионизация акустическим распылением в нормальных условиях —
easy ambient sonic-spray ionization (EASI) и ионизация акустическим
распылением в нормальных условиях с использованием эффекта
Вентури (Venturi easy ambient sonic-spray ionization, V-EASI) 206
7.3.
Применения в анализе объектов окружающей среды 208
7.4.
Заключение 215
Литература 216
Глава 8. Масс-спектрометрия десорбционной электрораспылительной ионизации 223
8.1.
Введение 223
8.2.
Экспериментальные установки и условия 224
8.3.
Реакционная десорбция 227
8.4.
Масс-спектрометрическое изображение поверхности c помощью ДЭРИ 229
8.5.
Количественные измерения 230
8.6.
Анализ воды 232
8.7.
Анализ аэрозолей 234
8.8.
Прямой анализ 238
Литература 239
Глава 9. Миниатюрные масс-спектрометры для анализа объектов окружающей среды 242
9.1.
Введение 242
9.2.
Основы конструкции приборов 244
9.2.1.
Методы ввода проб 244
9.2.2.
Методы ионизации 249
9.2.3.
Масс-анализаторы 254
9.2.4.
Вакуумные системы 260
9.2.5.
Детекторы 261
9.3.
Экологические приложения для миниатюрных масс-спектрометров 262
9.3.1.
Подводная масс-спектрометрия для регистрации летучих органических
соединений (ЛОС) и растворенных в воде газов 263
9.3.2.
Мониторинг вулканических выбросов для контроля вулканической
активности 267
9.3.3.
Детектирование перфторированных соединений 270
9.3.4.
Анализ углеводородов 271
9.3.5.
Детектирование пестицидов 273
9.3.6.
Анализ полициклических ароматических углеводородов 275
9.3.7.
Детектирование примесей в продуктах питания 277
9.4.
Заключение 278
Литература 279
Глава 10. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой
в экологическом анализе 288
10.1.
Введение 288
10.2.
Основы метода 289
10.3.
Преимущества и недостатки 290
10.3.1.
Спектральные интерференции 291
10.3.2.
Неспектральные интерференции (матричные эффекты) 292
10.4.
Практическое применение 293
10.4.1.
Анализ воздуха 293
10.4.2.
Анализ воды 293
10.4.3.
Анализ твердых образцов 295
10.4.4.
Установление формы нахождения элементов 296
10.4.5.
Определение изотопного состава 297
10.4.6.
Лазерный пробоотбор в ИСП-МС 299
10.4.7.
Стандартные образцы 299
Литература 300
Глава 11. Роль масс-спектрометрии в исследовании летучих органических соединений 306
11.1.
Летучие органические загрязняющие вещества 306
11.1.1.
Происхождение летучих органических веществ и их влияние
на окружающую среду 306
11.1.2.
Воздействие ЛОС на здоровье человека 307
11.1.3.
Экономический эффект биогенного загрязнения 308
11.2.
Масс-спектрометрия летучих загрязнящих веществ 309
11.2.1.
Протоколы пробоподготовки 310
11.2.2.
Реакция переноса протона 312
11.2.3.
Прямой анализ в режиме реального времени 314
11.3.
Мониторинг летучих загрязняющих веществ в обычных условиях и при
пожарах 315
11.3.1.
Определение антропогенных загрязняющих веществ 315
11.3.2.
Определение биогенных загрязняющих веществ в окружающей среде 317
11.3.3.
Влияние температуры на определение биогенных соединений 320
11.3.4.
Анализ загрязняющих веществ, выделяемых при пиролизе различных
частей растений 323
11.4.
Заключение и будущее направление работы 327
Благодарность 328
Литература 328
Глава 12. Идентификация и количественное определение токсикологически значимых
побочных продуктов дезинфекции воды методами масс-спектрометрии 333
12.1.
Введение 333
12.2.
Аналитические методы идентификации и количественного
определения ППД 339
12.2.1.
Методы экстракции/концентрирования 339
12.2.2.
Масс-спектрометрические методы детектирования 343
12.2.3.
Методы дериватизации 349
12.3.
Что нас ждет в будущем? 352
Благодарность 353
Литература 353
Глава 13. Новые типы приоритетных загрязняющих веществ в окружающей среде 360
13.1.
Введение 360
13.2.
Масс-спектрометрия и НПЗВ 363
13.2.1.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия 364
13.2.2.
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия 364
13.3.
Выводы 376
Литература 378
Глава 14. Анализ пестицидов в образцах объектов окружающей среды современными
методами хроматомасс-спектрометрии 386
14.1.
Введение 386
14.2.
Анализ остаточных количеств пестицидов 388
14.3.
ГХ/МС 391
14.4.
ЖХ/МС 395
14.5.
Тенденции 400
Благодарность 405
Литература 405
Глава 15. Определение стойких галогенсодержащих соединений:
хлорированные дибензо-п-диоксины и дибензофураны 409
15.1.
Введение 409
15.1.1.
Хлорированные диоксины в окружающей среде 409
15.1.2.
Стадии ультраследового анализа объектов окружающей среды 411
15.1.2.
Почему нужна масс-спектрометрия? 412
15.2.
Подготовка проб для определения ХДД/ХДФ на следовом уровне 413
15.2.1.
Методы экстракции 413
15.2.2.
Очистка экстрактов 414
15.2.3.
Замечания по контролю качества 414
15.3.
Количественный анализ и метод изотопного разбавления 417
15.3.1.
Внутренняя и внешняя градуировка 417
15.3.2.
Особенности масс-спектрометрии с изотопным разбавлением 418
15.3.3.
Стандартные образцы и другие средства оценки эффективности 419
15.3.4.
Воспроизводимость, точность и неопределенность 420
15.4.
Газохроматографические методы 420
15.4.1.
Основные положения газовой хроматографии 420
15.4.2.
Колонки, используемые для определения ХДД/ХДФ 421
15.5.
Масс-спектрометрические методы 422
15.5.1.
Масс-спектрометрия и интегрированные ГХ/МС-системы 422
15.5.2.
Магнитные секторные приборы 424
15.5.3.
Тандемный масс-спектрометр 426
15.5.4.
Масс-спектрометр сверхвысокого разрешения 427
15.5.5.
Методы ионизации для определения ХДД/ХДФ 427
15.5.6.
Мониторинг заданных ионов (МЗИ) и мониторинг
заданных реакций (МЗР) 428
15.6.
Полный набор аналитических методов для определения ХДД/ХДФ
и других стойких галогенированных соединений 428
15.7.
Будущее многокомпонентных методов 430
15.7.1.
Времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения 430
15.7.2.
Автоматизация методов 431
15.7.3.
Ограничения анализа 433
Литература 434
Глава 16. Масс-спектрометрия атмосферных аэрозолей 438
16.1.
Введение 438
16.2.
Свойства аэрозолей и их воздействие на окружающую среду 438
16.3.
Приборы и их применение 443
16.3.1.
Анализ атмосферных газов 444
16.3.2.
Основные режимы работы приборов при анализе атмосферных частиц 447
16.3.3.
Времяпролетные приборы для анализа частиц, работающие в режиме
онлайн 449
16.3.4.
Применение масс-спектрометров дла анализа одиночных частиц
в исследованиях аэрозолей 452
16.3.5.
Многоцелевые времяпролетные приборы для анализа частиц 460
16.3.6.
Использование ионных ловушек для анализа одиночных частиц 463
16.3.7.
Масс-спектрометры для анализа ансамблей частиц 466
16.4.
Итоги и перспективы 470
Литература 471
Глава 17. Использование масс-спектрометрии для изучения взаимодействия ДНК
с экотоксикантами 478
17.1.
Введение 478
17.2.
Источники ДНК для анализа ДНК-аддуктов 480
17.3.
Подготовка образцов 481
17.4.
Приборы для ВЭЖХ-ЭРИ/МС/MС-анализа ДНК-аддуктов 482
17.4.1.
Валидация масс-спектрометрического метода 490
17.5.
Примеры использования ВЭЖХ/MС/МС для анализа ДНК-аддуктов 491
17.5.1.
Аддукты, образующиеся при воздействии ароматических аминов 491
17.5.2.
Аддукты с нитрозаминами 492
17.5.3.
Экзоциклические аддукты ДНК 494
17.5.4.
Этанол/ацетальдегидные аддукты 494
17.5.5.
Аддукты с полициклическими ароматическими
углеводородами (ПАУ) 495
17.5.6.
ДНК-аддукты с эпоксидами 497
17.6.
Новые подходы к повышению чувствительности аналитических методов
при анализе ДНК-аддуктов 498
17.6.1.
Капиллярная ВЭЖХ/наноэлектроспрейная МС 499
17.6.2.
МС-анализ с использованием ВЭЖХ-наноколонок и ионизацией
наноэлектроспреем 500
17.6.3.
Очистка образцов в режиме онлайн 501
17.6.4.
ЖХ/МС на микрочипах 504
17.7.
Выводы 506
Благодарность 506
Литература 506
Глава 18. ИЦРФП-анализ сложных органических смесей. Петролеомика 515
18.1.
Введение 515
18.2.
МС-ИЦРФП 517
18.3.
Разрешение по массе, разрешающая способность
и точное измерение массы 521
18.4.
Точная масса и дефект массы 524
18.5.
Степень ненасыщенности (DBE) и Z-число 527
18.6.
Масса в шкале Кендрика и дефект масс Кендрика 528
18.7.
Визуализация данных: график масс Кендрика, диаграммы ван Кревелена,
распределение гетероатомных классов соединений, график зависимости
DBE от числа атомов углерода 530
18.7.1.
График масс Кендрика 530
18.7.2.
Диаграммы ван Кревелена 532
18.7.3.
График распределения гетероатомных классов 533
18.7.4.
График зависимости DBE от числа атомов углерода 534
18.8.
Методы ионизации для МС-ИЦРФП-анализа сложных смесей 536
18.9.
Применение МС-ИЦРФП для решения экологических задач 537
Литература 541
Глава 19. Применение масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения с масс-
анализатором ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье
для анализа природного органического вещества в объектах окружающей среды 547
19.1.
Введение 547
19.1.1.
Значение природного органического вещества и способы его анализа 547
19.1.2.
Характеристики масс-спектров ПОВ и композиционное пространство 549
19.1.3.
Визуализация данных сложных масс-спектров 551
19.1.4.
Примеры анализа масс ПОВ 552
19.2.
Материалы и методы 553
19.2.1.
Масс-спектрометры ИЦР ПФ 553
19.2.2.
Расчет масс для молекул, содержащих C, H, N, O, S 553
19.3.
Результаты и обсуждение 553
19.4.
Заключение 563
Литература 563
Глава 20. Метод масс-спектрометрической визуализации (имиджинг) 568
20.1.
Введение 568
20.2.
Микрозондирование и молекулярная визуализация 568
20.3.
Визуализация пространственного распределения молекулярного состава 570
20.4.
Влияние матрицы 573
20.5.
Применение масс-спектрометрии вторичных ионов (МСВИ) в биоанализе 575
20.6.
Качество изображения и аналитический предел обнаружения 576
20.7.
MС-визуализация как метод качественного анализа 577
20.8.
MС-визуализация как точный аналитический метод 578
20.9.
Идентификация и характеристика 580
20.10.
МС-имиджинг в исследованиях объектов окружающей среды 581
20.11.
Перспективы 584
Литература 585
Глава 21. Масс-спектрометрия изотопных отношений 587
21.1.
Введение 587
21.2.
Величина δ 588
21.3.
Причины вариаций распределения стабильных изотопов в природе 588
21.4.
Масс-спектрометрия изотопных отношений в газах 590
21.4.1.
Ионизация 591
21.4.2.
Разделение по массам 592
21.4.3.
Регистрация нескольких ионов 592
21.4.4.
17O- и HD-коррекция 593
21.5.
Оборудование для подготовки проб и интерфейсы 593
21.5.1.
Изотопный масс-спектрометр непрерывного потока 593
21.5.2.
Элементный анализатор (сжигание и высокотемпературная
конверсия) — изотопный масс-спектрометр 595
21.5.3.
ГХ/МСИО 595
21.5.4.
ЖХ/МСИО 596
21.5.5.
МСИО с многократными инжекциями через петлю 597
21.6.
Некоторые приложения 597
21.6.1.
Науки о Земле 597
21.6.2.
Биология и экология 599
21.6.3.
Археология и миграция людей 599
21.6.4.
Контроль лекарств и наркотиков 601
21.6.5.
Контроль допинга 601
21.6.6.
Аутентичность продуктов питания и напитков 602
Литература 603
Дополнение 1. Основы и достижения масс-спектрометрии на основе орбитальной
ловушки ионов. Краткий обзор 605
Как устроена Орбитальная ловушка ионов 605
Семейство серийных масс-спектрометров Orbitrap 608
Современные тенденции практического использования Orbitrap 609
Пищевая безопасность и объекты окружающей среды 610
Заключение 611
Дополнение 2. Высокопроизводительные хроматомасс-спектрометры Shimadzu UFMS:
применение для анализа объектов окружающей среды, питьевой воды, пищевой
и сельскохозяйственной продукции 613
Список литературы 630
Предисловие к русскому изданию
Современная масс-спектрометрия является наиболее чувствительным, информа-
тивным и надежным методом идентификации и количественного определения эко-
токсикантов любого типа в образцах объектов окружающей среды любой сложности.
Возможности работать с самыми разными аналитами (от химических элементов до
сложнейших биомолекул) в сложнейших матрицах без предварительного разделения,
действительно, ставят масс-спектрометрию в приоритетное положение по сравнению
с любыми другими методами анализа. Еще одним преимуществом масс-спектрометрии
является возможность получения информации о сотнях и тысячах аналитов в процес-
се единичного анализа одной пробы. При этом результаты масс-спектрометрических
исследований позволяют делать выводы, которые подготавливают административные
решения, влияющие на здоровье населения и экосистем в целом.
Бурное развитие метода в начале XXI века привело к созданию новых приборов,
новых методов ионизации образцов. Появилась возможность работать с минимальной
пробоподготовкой или вовсе без пробоподготовки. Популярным направлением стала
масс-спектрометрия в нормальных условиях, активные работы ведутся по миниатюри-
зации масс-спектрометров. Появление простых и чувствительных портативных масс-
спектрометров, работающих при нормальных условиях, станет прорывом в аналити-
ческой химии. При снижении стоимости таких масс-спектрометров они могут стать
бытовыми приборами.
Данная книга предназначена, в первую очередь, для людей, работающих в смежных
дисциплинах (экология, геология, биология, гидрология, медицина и т. д.). Она состоит
из 21 главы, написанной ведущими масс-спектрометристами из 12 стран мира, которые
постарались в простой форме рассказать о достижениях и потенциальных возможно-
стях метода для решения самых разнообразных экологических проблем. Хотя диапазон
возможностей современной масс-спектрометрии необычайно широк, многие из них
остаются неизвестными непрофессионалам. Поэтому основная цель — продемонстри-
ровать, что самые разные научные задачи, стоящие перед учеными разных специаль-
ностей, могут быть решены масс-спектрометрически.
Оригинальное издание вышло на английском языке. Русскоязычное издание, на
мой взгляд, еще более актуально, поскольку в России и в странах бывшего СССР про-
паганда возможностей масс-спектрометрии крайне необходима. Хотя Всероссийское
масс-спектрометрическое общество (www.vmso.ru) проводит регулярные конференции,
школы, издает журнал, выпустило несколько книг, дополнительная литература, осо-
бенно учебно-научная, очень нужна русскоязычному научному сообществу.
Я надеюсь, читатели (студенты, аспиранты, научные сотрудники) найдут в этом из-
дании много интересной и полезной информации, а масс-спектрометрия станет для них
неотъемлемым методом исследований.
А. Т. Лебедев
Если проблему нельзя решить с помощью масс-спектрометрии,
возможно, ее и не надо решать.
Фред МакЛафферти
Красота спасет мир.
Федор Достоевский
Введение
Делая в последнее время доклады по разным аспектам масс-спектрометрии на кон-
ференциях химиков, биологов, токсикологов, экологов, медиков в самых разных
странах, я обнаружил, что большинство исследователей не представляют уникаль-
ных возможностей этого метода даже в плане решения своих научных задач. Читая
лекции аспирантам МГУ имени М. В. Ломоносова, я также обратил внимание, что
молодые ученые относятся к масс-спектрометрии как к весьма сложному аналити-
ческому методу, предпочитая использовать для решения задач альтернативные под-
ходы: ЯМР, ИК-, УФ-спектроскопию. Так родилась идея написания этой книги, по-
скольку эффективность, надежность, простота и широта применимости современной
масс-спектрометрии поистине впечатляющи. Помимо классических наук (физика,
химия, биология) масс-спектрометрия чрезвычайно успешно используется в медици-
не, космических исследованиях, археологии, антропологии, антитеррористической
деятельности, экспертизе предметов искусства, экологии, допинг-контроле, метроло-
гии, ядерной физике и т. д. Благодаря масс-спектрометрии недавно родились новые
дисциплины: петролеомика, гуминомика, метабономика, протеомика. Фактиче-
ски трудно назвать раздел науки, в которой нельзя было бы эффективно применить
масс-спектрометрию.
Современная масс-спектрометрия — наиболее чувствительный, быстрый и ин-
формативный аналитический метод. Ей доступны любые аналиты: от химических эле-
ментов до сложнейших биологических молекул (белки, сахара, нуклеиновые кислоты).
Качественный и количественный анализ индивидуальных компонентов сверхсложных
смесей, состоящих из многих тысяч ингредиентов, может осуществляться быстро и без
какого-либо предварительного разделения. Вы можете отобрать пробу воды из реки,
лужи, бутылки и в течение пары часов проверить наличие в ней сотен индивидуаль-
ных веществ. Любое значимое с точки зрения экологии соединение может быть надежно
определено масс-спектрометрически. Если вы не нашли соответствующей готовой ме-
тодики в литературе, это означает лишь то, что это соединение до этих пор не интересо-
вало масс-спектрометристов.
Масс-спектрометрия обладает непревзойденной чувствительностью. Метод опе-
рирует фемто-, зепто- (10—15—10—21) молярными уровнями аналитов в образце. Если
принять во внимание число Авогадро (6,022 1023), становится понятно, что масс-
спектрометрия приближается к абсолютному теоретическому пределу анализа. Клас-
сические, не разгадываемые без волшебства задачи уровня нахождения ржаного зер-
нышка в мешке пшеницы или иголки в стоге сена могут быть легко решены с помощью
масс-спектрометрии. На самом деле, когда речь идет о возможности детектирования со-
единения на уровне 10—18, это значительно «круче», чем обнаружение одной-единствен-
ной иголки в миллионе стогов сена.
Разнообразие типов масс-спектрометров очень велико. Различные задачи ре-
ализуются с помощью разных детекторов, источников ионов и методов иониза-
ции. В частности, различие в размерах может быть прекрасно проиллюстрировано
рис. 1а,б. Масс-спектрометр Mini 11.5 — хороший представитель переносных при-
боров (рис. 1б), а KATRIN (рис. 1a) — самый большой на сегодняшний день прибор,
созданный для проведения сверхтонких измерений масс, например измерения массы
нейтрино (Kluge, 2010).
Рис. 1. a — Транспортирование масс-спектрометра через деревню Леопольдсхафен в ис-
следовательский центр Карлсруэ (с разрешения EJMS); б — Грэм Кукс выполня-
ет измерения с помощью портативного масс-спектрометра Mini 11.5. (Фото Jon
Dagleish)
a
Теория метода достаточно проста, также как и его основные применения. Фактиче-
ски уже выпускник школы может регистрировать спектры и работать с ними, особенно
когда речь идет о серийных образцах или поиске целевых аналитов.
Основная идея данной книги — рассказать о возможностях масс-спектрометрии
в решении экологических и родственных задач с демонстрацией того, как элегантно
могут быть разрешены весьма сложные вопросы. Книга дает ключ к возможному реше-
нию проблем, стоящих перед биологом, геологом, врачом, экологом, химиком, нефте-
химиком, криминалистом и т. д. Студенты, как, впрочем, и профессиональные масс-
спектрометристы, также найдут в ней достаточно много весьма полезных сведений,
которые расширят их горизонты в этой области, поскольку целый ряд современных ме-
тодов (петролеомика, имиджинг, изотопная и атмосферная масс-спектрометрия) описа-
ны простыми словами в форме лекции для начинающих. Широкий круг реальных при-
меров решенных задач красиво подкрепляет теорию различных методов исследования.
Зачастую результат эксперимента может быть удивительным и неочевидным для не-
посвященных. Например, измерив соотношение природных изотопов углерода, кисло-
рода и азота в образце, можно установить район производства наркотиков, виновника
разлива нефти, подлинность напитка или даже различить по остаткам костей древних
европейцев и американцев.
Помимо указанных превосходных технических характеристик масс-спектро-
метрия — это очень красивый метод. Я надеюсь, читатели смогут разделить со мной
это чувство, ознакомившись с богатым иллюстративным материалом книги, демон-
стрирующим результаты реальных исследований. Именно поэтому я использовал ци-
тату из «Идиота» Ф. М. Достоевского в качестве одного из эпиграфов к книге. Второй
эпиграф — высказывание «отца-основателя» органической масс-спектрометрии Фреда
МакЛафферти. Безусловно, будучи шутливым, оно, тем не менее, прекрасно отражает
возможности метода и диапазон его применимости.
Каждая из 21 главы повествует об отдельном направлении масс-спектрометрии
объектов окружающей среды. Главы 1—5 посвящены основам масс-спектрометрии.
Они раскрывают наиболее распространенные общие приемы. Материал этих глав по-
зволит легче схватывать идеи последующих разделов книги.
Основные принципы масс-спектрометрии коротко изложены в главе 1. Это форма
представления масс-спектров, системы ввода, анализаторы масс и методы ионизации,
играющие основную роль в экологической масс-спектрометрии.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия (ГХ/МС) остается на сегодняшний
день наиболее эффективным методом качественного и количественного определения
наиболее распространенных загрязняющих веществ: фенолов, полициклических аро-
матических углеводородов, полихлорированных бифенилов, дибензодиоксинов и ди-
бензофуранов и т. д. Важнейшие аспекты этого комбинированного метода представлены
в главе 2.
С момента успешной стыковки масс-спектрометра с жидкостным хроматогра-
фом метод ЖХ/МС становится все более и более востребованным, поскольку огром-
ное число полярных и термолабильных соединений вошли в рабочий диапазон масс-
спектрометрии. Глава 3 повествует об основных деталях, особенностях и преимуществах
метода ЖХ/МС.
26 Введение
Курс на повышение чувствительности и надежности анализов привел ко все более
частому приложению тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) к проблемам окружаю-
щей среды. Ранее этот метод использовался в основном в фундаментальных исследова-
ниях. Экологические приложения тандемной масс-спектрометрии рассмотрены в гла-
ве 4. Этот метод надежнее, чем обычная масс-спектрометрия. Кроме того, он позволяет
создавать различные автоматизированные программы для эффективного качественно-
го и количественного определения сотен экотоксикантов и(или) биомаркеров за один
ввод пробы. Метод МС/МС незаменим, когда речь идет об установлении структуры со-
единений в нецелевых анализах.
Поскольку за регистрацией всегда следует какая-либо процедура обработки масс-
спектра, эта часть эксперимента имеет особое значение. Сейчас в большинстве случаев
работы с экотоксикантами нет необходимости проводить установление структуры ана-
лита вручную. Представительные базы данных и постоянно совершенствующееся про-
граммное обеспечение — неотъемлемая часть современных масс-спектрометров. Имен-
но таким базам данных и компьютерным программам посвящена глава 5.
Следующий блок (главы 6—9) представляет инновации XXI века. Усовершенство-
ванные ГХ/МС-методы: ГХ/ГХ/МС и быстрая ГХ/МС (глава 6) расширили возможно-
сти метода. Первый из них делает возможным получение информации о тысячах ин-
дивидуальных компонентов сложнейших смесей за однократный ввод пробы, второй
позволяет сократить время анализа в 5—10 раз. Недавно внедренный интерфейс сверх-
звуковых молекулярных пучков продемонстрировал новые впечатляющие возможности
классического метода электронной ионизации и позволил расшить круг соединений,
которые можно эффективно анализировать ГХ/МС.
Долгие годы основным недостатком масс-спектрометрии считалась необходимость
пробоподготовки, зачастую весьма трудоемкой. Начало XXI века ознаменовалось рево-
люционными подвижками в преодолении этой трудности. Сегодня предложены более
40 масс-спектрометрических методов с ионизацией в нормальных (природных) услови-
ях с применением плазмы или распыления. Глава 7 посвящена наиболее эффективным
среди них: ДЭРИ, ПАРВ, EASY, ЭЭРИ и т. д. Во многих случаях процедура пробоподго-
товки может быть полностью устранена.
Исторически первый метод ионизации в нормальных условиях был назван десорб-
ционной электрораспылительной ионизацией (ДЭРИ, DESI). Он уникален по скорости,
кругу анализируемых молекул и области применения, включая, например, онлайн-де-
тектирование биомаркеров во время хирургических операций. Глава 8 посвящена воз-
можностям этой замечательной техники.
Другим недостатком масс-спектрометрии прошлых лет был размер приборов. Сей-
час производится много мощных и надежных настольных масс-спектрометров. Тем не
менее борьба за сокращение размеров не прекращается. Например, размер играет едва
ли не ключевую роль в создании приборов для размещения на космических кораблях.
В последние годы созданы портативные приборы (до нескольких килограммов), спо-
собные решать весьма сложные задачи. Один из авторов главы 9, посвященной мини-
атюризации, Грэм Кукс отметил в своей лекции на недавней международной масс-
спектрометрической конференции в Бремене (Cooks et al., 2010), что будет правильно,
если в недалеком будущем обычный человек сможет использовать масс-спектрометр
для замеров на «кухне», например для проверки качества пищевых продуктов, простых
экологических тестов или контроля здоровья.
С главы 10 начинается блок, посвященный наиболее значимым типам загрязнений
окружающей среды. Метод индуктивно связанной плазмы с масс-спектрометрическим
детектированием (ИСП МС) является наиболее быстрым и информативным для каче-
ственного и количественного определения химических элементов в пробах. Менее ми-
нуты достаточно для того, чтобы получить надежную информацию о наличии и уровнях
большинства химических элементов таблицы Д. И. Менделеева. Поскольку диапазон
линейности метода достигает 12 порядков, за один ввод пробы можно получить инфор-
мацию и о макроэлементах, и об элементах, присутствующих в ультраследовых количе-
ствах. Этому замечательному методу посвящена глава 10.
Достаточно большая группа химических соединений в объектах окружающей сре-
ды объединяется термином «летучие». Это связано исключительно с низкой величиной
давления их паров. В эту группу входят самые разнообразные органические вещества.
Опасность соединений этой группы для человека и экосистемы в целом лежит в широ-
ком диапазоне, а их присутствие должно контролироваться в атмосфере, воде, других
образцах и продуктах. Масс-спектрометрическому анализу таких соединений, которые
можно разделить на антропогенные и биогенные, посвящена глава 11.
Побочные продукты дезинфекции, возникающие при подготовке питьевой воды,
а также при эксплуатации плавательных бассейнов и утилизации отходов, представля-
ют собой серьезную экологическую проблему, нанося существенный вред здоровью че-
ловека. Не существует лучшего метода качественного и количественного определения
этих соединений, чем масс-спектрометрия. Об этом повествуется в главе 12.
Глава 13 посвящена опасным современным экотоксикантам: фармацевтическим
препаратам, наночастицам, металлоорганическим соединениям. Набор этих ксеноби-
отиков неуклонно возрастает год от года с появлением новых продуктов, часто не самых
экологичных. И вновь следует сказать, что для их детектирования не существует более
эффективного метода, чем масс-спектрометрия.
Пестициды всегда считались приоритетными загрязняющими веществами. Раз-
личные варианты ГХ/МС или ЖХ/МС показали свою эффективность в определении
этих экотоксикантов в объектах окружающей среды. Тем не менее в связи с широчай-
шим разнообразием структур и наличием очень жестких требований по чувствитель-
ности и надежности определение пестицидов продвинутыми хроматомасс-спектроме-
трическими методами представлено в главе 14.
Масс-спектрометрия является единственным аналитическим методом, способным
надежно определять суперэкотоксиканты: полихлорированные дибензодиоксины и ди-
бензофураны. Благодаря своей высочайшей токсичности и стабильности эти ксенобио-
тики должны контролироваться на постоянной основе. Более 30 лет им уделяется особое
внимание. Ежегодный представительный научный форум посвящен исключительно
этим соединениям. Детали масс-спектрометрического определения этих веществ пред-
ставлены в главе 15.
Загрязнение атмосферы является важным аспектом химии окружающей среды.
Глава 16 названа «Масс-спектрометрия атмосферных аэрозолей». Уникальные резуль-
таты, включая анализ единичных частиц, наглядно демонстрируют преимущество
масс-спектрометрии перед другими аналитическими методами в подобных анализах.
28 Введение
Что происходит, когда загрязняющее вещество попадает в организм человека? Воз-
можность масс-спектрометрического изучения взаимодействия экотоксикантов с ДНК
является предметом главы 17. Чрезвычайная сложность задачи требует высочайшей чув-
ствительности метода и возможности работать как с целевыми, так и нецелевыми ад-
дуктами ксенобиотиков с биомолекулами.
В четырех последних главах рассматриваются масс-спектрометрические подходы,
которые привели к созданию новых направлений научных исследований. В частности,
появилась возможность прямого анализа состава самых сложных смесей природных
соединений. Сверхвысокая разрешающая способность масс-спектрометрии с преоб-
разованием Фурье позволяет идентифицировать и оценить уровни тысяч индивиду-
альных родственных природных соединений без какого-либо предварительного разде-
ления. Главы 18 и 19 знакомят читателя с новейшими дисциплинами: петролеомикой
и гуминомикой.
Масс-спектрометрия изображений (имиджинг) — еще одно уникальное научное
направление, возникшее в самом конце XX века. Этот удивительный метод позволяет
детектировать и картировать распределение тысяч самых разнообразных соединений
в органах и тканях животных и растений, в минералах, овощах и фруктах, произведе-
ниях искусства. Стало возможным устанавливать распределение экотоксиканта, лекар-
ственного препарата или его метаболитов в целом организме лабораторного животного
или определять, какие белки и где конкретно генерируются организмом в качестве от-
клика на проникновение чужеродного вещества в организм. Эти аспекты рассматрива-
ются в главе 20.
Глава 21 посвящена изотопной масс-спектрометрии — красивому методу, базирую-
щемуся на существовании природных изотопов химических элементов. Соотношение
этих изотопов зависит от происхождения образца. Измерив отношения D/H или 13C/12C,
можно делать выводы о подлинности произведений искусства, определять, на каком за-
воде синтезировано данное вещество, устанавливать, природным или синтетическим
является полезный ингредиент (аскорбиновая или лимонная кислота) в соках и напит-
ках. Этот мощный метод полезен в криминалистике (анализ наркотиков) и в допинг-
контроле (различие между эндогенными и синтетическими стероидами).
Таким образом, я надеюсь, что читатель не только обнаружит в этой книге мно-
го полезной для своей будущей работы информации, но и просто получит удоволь-
ствие, знакомясь с фантастическими возможностями современной экологической
масс-спектрометрии.
Литература
[1]. Cooks R. G., Ifa D. R., Sharma G., Tadjimukhamedov F. Kh., Ouyang Zh. (2010). «Persrectives
and retrospectives in mass spectrometry: one view». European Journal of Mass Spectrometry,
16, 3: 283—300.
[2]. Kluge H.-Jurgen (2010). «High accuracy mass spectrometry for fundamental studies». European
Journal of Mass Spectrometry, 16, 3: 269—282
Глава 1
Основные принципы масс-спектрометрии
Альберт Лебедев
1.1.Базовые аспекты
Для того чтобы получить масс-спектр, необходимо ввести образец в ионный ис-
точник масс-спектрометра, ионизировать молекулы (получить положительные или
отрицательные ионы), разделить эти ионы по величинам m/z (отношение их массы
к заряду) и установить число ионов с каждым m/z. Компьютер управляет всеми про-
цессами и проводит обработку данных. Принципиальная схема масс-спектрометра
представлена на рис. 1.1. Дополнительные узлы могут добавляться для решения более
сложных задач.
Таким образом, масс-спектрометрия является аналитическим методом, оперирую-
щим заряженными атомами и молекулами химических соединений. Принципиальным
моментом является ионизация молекул образца или перевод ионов, уже имеющихся
в растворе или в твердой матрице, в газовую фазу. Отношение массы к заряду (m/z) ио-
нов может быть точно измерено, что позволяет установить молекулярные массы ингре-
диентов образца. Можно также инициировать фрагментацию исходных молекулярных
ионов с получением набора фрагментных ионов. Эти ионы представляют собой наибо-
лее стабильные фрагменты исходной молекулы и позволяют делать выводы о ее струк-
туре. Интенсивности и величины m/z молекулярного и фрагментных ионов на графике
по осям y и x соответственно называются масс-спектром. Обычно график нормализу-
ется на 100 % по наиболее интенсивному пику в спектре. Масс-спектр — уникальная
характеристика химического вещества. Для работы с масс-спектром необходимы толь-
ко атомные массы химических элементов, точнее природных изотопов этих элементов.
Поскольку атомные и молекулярные массы — простые и широко используемые характе-
ристики, масс-спектры значительно проще для интерпретации, чем ЯМР, ИК, УФ, ЭПР
и другие типы спектров.
ввод ионизация разделение масс-
спектр
детекти-
рование
обработка
данных
компьютер
Рис. 1.1. Принципиальная схема масс-спектрометра
Существуют определенные правила, определяющие направления фрагментации
химических соединений в масс-спектрометре. Поэтому на основе масс-спектра можно
установить молекулярную массу, элементный состав, присутствие определенных функ-
циональных групп, а зачастую и полную структуру аналита. Во многих случаях уже но-
вичок может успешно решать задачи даже без использования спектральных баз данных
и специального программного обеспечения.
Спектр электронной ионизации бензоилхлорида в классической графической фор-
ме представлен на рис. 1.2. Абсцисса соответствует массам ионов (точнее величинам
m/z), а ордината — относительным интенсивностям пиков этих ионов. Для новичка
проще принимать во внимание только наиболее интенсивные пики в спектре. Менее
интенсивные пики, следующие сразу за интенсивными, обусловлены наличием в со-
ставе молекул образца природных стабильных изотопов. Они играют важную роль при
установлении структуры и далее будут обсуждаться подробнее.
Пик иона с самой большой массой соответствует молекулярному иону анали-
та. В спектре на рис. 1.2 — это 140. Следует также обратить внимание на ион с m/z 142,
интенсивность пика которого составляет 1/3 от интенсивности пика иона с m/z 140.
Эти два пика обусловлены существованием двух природных изотопов хлора: 35Cl и 37Cl.
Их природное соотношение ~ 3 : 1. Первичный фрагментный ион с m/z 105 образует-
ся при потере 35 единиц массы из молекулярного иона с m/z 140 или 37 единиц мас-
27 38 62 85 111 122 140
m z /
105
20
9000
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
77
51
Рис. 1.2. Спектр электронной ионизации бензоилхлорида (NIST 27422)
m z /
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
I/%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 237
295
266
208
324
Рис. 1.3. Спектр электронной ионизации тетраэтилсвинца (NIST45993)
1.1. Базовые аспекты 31
сы из изотопного иона с m/z 142. Оба выброса обусловлены атомами хлора (35Cl и 37Cl).
Первичный ион с m/z 105 теряет молекулу CO с образованием вторичного фрагментного
иона (m/z 77), который, однако, может образоваться и напрямую из молекулярного иона
при разрыве связи С-С. Даже человек с минимальным опытом работы по расшифровке
масс-спектров знает, что ион с m/z 77 может считаться визитной карточкой фенильной
группы (C6H5
+). Это стабильный в газовой фазе ион, который указывает на ароматиче-
скую природу аналита. Продукт следующей стадии фрагментации, ион с m/z 51, образу-
ется при отщеплении из фенил-катиона молекулы ацетилена (C2H2). Измерение точной
массы (см. ниже) может надежно подтвердить сделанные выводы, поскольку дает воз-
можность установить элементный состав всех упомянутых выше ионов.
Существование природных изотопов химических элементов облегчает установле-
ние структуры и позволяет определить элементный состав анализируемого соединения
по его масс-спектру. На рис. 1.3 представлен хороший пример простоты и информатив-
ности масс-спектра, демонстрирующий важность учета изотопных пиков. Три основных
природных изотопа свинца имеют атомные массы 206, 207 и 208 единиц с распростра-
ненностью 25,15 %, 21,11 % и 52,38 % (грубо 1 : 1 : 2) соответственно. Тетраэтилсвинец —
топливная добавка. Будучи хорошо известным экотоксикантом, он запрещен в на-
m z /
9000
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
9000
9500
8500
7500
6500
5500
4500
3500
2500
1500
500
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
40 60
31
81 112
270
191
61
74
92
110
128
150
185
220
292
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
m z /
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
a
б
Рис. 1.4. Масс-спектры электронной ионизации тетрахлорбифенила NIST 169679 (верх)
и трибромфосфина NIST 150824 (низ)
32 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
стоящее время в подавляющем большинстве стран. В области высоких масс, начиная
с m/z 324, в спектре отчетливо видны 5 триплетов (иногда искаженные) с соотношением
интенсивностей 1 : 1 : 2 и отстоящих друг от друга на 29 единиц массы. Эти группы ионов
обусловлены последовательными выбросами четырех этильных групп из молекулярно-
го иона Pb(C2H5)4. Детали работы с изотопными пиками представлены в (Lebedev, 2009;
Лебедев, 2003).
Хлор и бром часто присутствуют в молекулах приоритетных загрязняющих веществ
(пестициды, фармацевтические препараты, побочные продукты дезинфекции, анти-
пирены). Благодаря уникальному соотношению природных изотопов (35Cl : 37Cl ~ 3 : 1;
79Br : 81Br ~ 1 : 1) присутствие этих элементов в анализируемых образцах может быть мо-
ментально установлено по масс-спектру. Для этого надо обращать внимание на мульти-
плеты, пики в которых отстоят друг от друга на две единицы массы. Число атомов этих
элементов в молекуле также однозначно определяется по изотопной картинке. Так, два
атома хлора в молекуле дадут изотопный кластер (триплет) с относительными интенсив-
ностями (3 : 1)2 = 9 : 6 : 1; три атома — (3 : 1)3 = 27 : 27 : 9 : 1 и т. д. Вид мультиплетов ионов в за-
висимости от числа атомов хлора и брома в молекуле представлен на рис. 12.9 в главе 12.
Примеры масс-спектров экологически важных тетрахлорбифенила и трибромфосфина
представлены на рис. 1.4. Последовательные выбросы атомов хлора и брома с образо-
ванием характеристических изотопных кластеров ионов позволяют легко идентифи-
цировать эти токсиканты. Спектр трибромфосфина особенно прост, поскольку после-
довательное элиминирование трех атомов брома приводит к иону атомарного фосфора
с m/z 31. При этом дублет с m/z 79 и 81 определяется двумя стабильными изотопами брома.
1.2. Ввод образца
Любой масс-спектрометрический эксперимент начинается с ввода образца в прибор.
На этой стадии наиболее серьезная проблема связана с тем, что большинство приборов
функционирует в условиях глубокого вакуума (10–5—10–6 торр). Существует несколько
подходов: прямой ввод, ввод через полупроницаемую мембрану, интерфейсы с много-
численными хроматографами (ГХ, ВЭЖХ, СКФХ, КЭ) и даже самостоятельное натека-
ние молекул или ионов из атмосферы в прибор, работающий в условиях пониженного
давления. Последний вариант будет детально рассматриваться в последующих главах,
посвященных миниатюризации и современным методам анализа без пробоподготовки
(главы 7—9).
В случае прямого ввода жидкий или твердый образец направляется в ион-
ный источник через вакуумный шлюз. Поскольку обычное давление в источнике
10–5—10–6 мм рт. ст., а образец может быть нагрет до 400 °C и более, значительное число
органических соединений может быть переведено в газовую фазу и проанализировано.
Однако, если образец представляет собой смесь соединений с близкими летучестями,
зарегистрированный масс-спектр будет представлять собой суперпозицию спектров
компонентов. Этот факт может существенно усложнить процесс идентификации, при-
чем как компьютеризованный, так и производимый вручную.
Полупроницаемые мембраны могут с успехом применяться в экологическом мо-
ниторинге. Например, пусть вода протекает по трубке из полимерного материала.
При этом липофильные соединения могут адсорбироваться на поверхности такого ма-
териала, просачиваясь через тонкие стенки. С наружной стороны они попадают в поток
инертного газа, доставляющего их непосредственно в ионный источник, где и проис-
ходит их детектирование. Подобные устройства успешно используются в онлайн-ре-
жиме для определения конкретных соединений в реках, промышленных сбросах и т. д.
(глава 9). Аналогичные системы используются для детектирования целевых соединений
в биологических жидкостях. К сожалению, метод не универсален и должен несколько
модифицироваться для каждого нового аналита. Вариант мембранного ввода представ-
лен на рис. 1.5.
Наиболее популярными являются системы ввода в виде различных интерфей-
сов между блоком разделения (хроматографы) и масс-спектрометром. Несколько глав
(2, 3, 6) посвящены подробному изложению вариантов такого комбинированного
метода — хроматомасс-спектрометрии.
1.3. Ионизация
Масс-спектрометрия регистрирует исключительно заряженные частицы. Ни молеку-
лы, ни радикалы не могут быть исследованы в своей исходной нейтральной форме. Сле-
довательно, молекулы образца должны быть ионизированы. Альтернативно ионы целе-
вого вещества, уже существующие в конденсированной фазе, могут быть каким-либо
образом переведены в газовую фазу. За столетнюю историю масс-спектрометрии описа-
но несколько десятков методов ионизации, причем следует отметить, что значительное
число новых атмосферных методов были предложены совсем недавно, уже в XXI веке.
Частота использования того или иного метода с годами изменяется. Одни из них про-
должают играть важную роль в современных исследованиях, другие уже прошли свой
«золотой период» и заменены более эффективными.
Все существующие методы могут быть грубо разделены на две группы: «мягкие»
и «жесткие». Это разделение основано на величине избытка внутренней энергии в об-
разующемся молекулярном ионе. Если эта величина мала, фрагментация незначи-
тельна и ион регистрируется как молекулярный. Такой процесс называется «мягкой
ионизацией». Определенный избыток внутренней энергии запускает процесс разрыва
конкретных химических связей в исходном молекулярном ионе, приводя к появлению
различных фрагментных ионов. Иногда молекулярный ион вообще не удается зареги-
Источник ионов
Мембрана
Выход
He
Вход
Рис. 1.5. Вариант мембранного ввода с положением мембраны вне источника ионов
34 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
стрировать. Подобный процесс называется «жесткой» ионизацией. Оба варианта по-
лезны. Первый дает информацию о молекулярной массе соединения и его элементном
составе (масс-спектрометрия высокого разрешения), второй позволяет получить струк-
турную информацию благодаря массам фрагментных ионов.
В этой главе будут рассмотрены только наиболее значимые для экологической масс-
спектрометрии методы ионизации. Несколько новых методов описаны в главах 7 и 8.
Для дополнительной информации может быть рекомендована книга (Westman-Brinkmalm
and Brinkmalm, 2009) и литература, процитированная в ней.
1.3.1. Электронная ионизация
Электронная ионизация (традиционно называвшаяся «электронным ударом»), пред-
ложенная Демпстером еще в 1921 году (Dempster, 1921), исторически была первым и до
сих пор остается одним из наиболее востребованных методов ионизации. Она особен-
но важна для масс-спектрометрии образцов объектов окружающей среды. В процессе
электронной ионизации (ИЭ) газообразные молекулы образца должны оказаться в ион-
ном источнике, функционирующем в условиях высокого вакуума (10–5—10–6 мм рт. ст.).
Испускаемые катодом электроны, пролетая через ионный источник к противоэлектро-
ду, взаимодействуют с этими молекулами. В результате собственные электроны молекул
переходят на более высокие орбитали или совсем покидают молекулу с образованием
ионов. Процесс может быть представлен следующим уравнением:
M + ē = M+• + 2 ē. (1.1)
Теряя электрон, молекула превращается в катион-радикал. Более 95 % образую-
щихся ионов однозарядные, хотя образуются двух- и даже многозарядные ионы. Их ко-
личество зависит от природы молекул образца. Стандартная энергия ионизирующих
электронов — 70 эВ, что близко к максимуму сечения ионизации для большинства ор-
ганических молекул. Внутренняя энергия образующихся молекулярных ионов лежит
в диапазоне от 0 до 20 эВ, приводя к интенсивной фрагментации. В условиях высоко-
го вакуума отсутствуют ионно-молекулярные взаимодействия, т. е. перераспределение
энергии между частицами за счет их столкновений отсутствует. В результате образо-
вавшиеся молекулярные ионы ведут себя далее исключительно в зависимости от при-
обретенной в процессе ионизации внутренней энергии. Определенный избыток этой
энергии запускает соответствующий процесс фрагментации. Поскольку статистиче-
ски в результате ионизации образуются миллиарды и триллионы молекулярных ио-
нов с очень широким диапазоном внутренней энергии, активируются все возможные
пути фрагментации. Поэтому спектры электронной ионизации предоставляют богатую
структурную информацию и характеризуются высокой воспроизводимостью независи-
мо от типа масс-спектрометра. Последняя особенность позволила создать и эффектив-
но использовать библиотеки масс-спектров (глава 5).
Электронная ионизация — это универсальный метод, позволяющий исследовать
разные классы химических соединений. Однако у него есть существенный недостаток,
связанный с необходимостью перевода молекул образца в газовую фазу. Именно поэто-
му метод непригоден для полярных, термолабильных и тяжелых молекул. Тем не менее
электронная ионизация прекрасно справляется с анализом подавляющего большин-
ства экологически значимых соединений в самых разных матрицах.
Хотя в процессе ионизации электронами образуются и отрицательные ионы, их вы-
ходы существенно ниже, что лимитирует использование этого режима на практике.
1.3.2. Химическая ионизация
В 1966 г. Мансон и Филд описали «мягкий» метод ионизации (Munson and Field, 1966),
названный химической ионизацией (ХИ, chemical ionization, CI). Поскольку внутрен-
няя энергия образующихся в результате ХИ ионов обычно ниже 5 эВ, фрагментация
практически отсутствует. Иногда в спектре наблюдается исключительно пик молеку-
лярного иона. Наиболее полное описание процессов ХИ можно найти в книге А. Гарри-
сона (Harrison, 1992).
Основное различие между ИЭ и ХИ связано со значительно более высоким давле-
нием в источнике (~1 мм рт. ст.) во втором случае. Это давление достигается введением
так называемого газа-реагента, в качестве которого можно использовать практически
любое вещество (воду, аммиак, метан, бензол, гелий, этилендиамин и т. д.). Взаимодей-
ствие молекул газа-реагента с электронами высокой энергии (200—500 эВ) приводит
к ионизации. Благодаря высокому давлению образующиеся молекулярные ионы вза-
имодействуют с нейтральными молекулами. В результате самых разнообразных ион-
но-молекулярных реакций создается газовая плазма, существующая в динамическом
равновесии. Наиболее распространенные и реакционноспособные ионы в этой плазме
называются ионами-реагентами. Это могут быть молекулярные, фрагментные ионы
или ионы — продукты реакций исходных молекул газа-реагента. Уравнения (1.2) дают
представление о некоторых основных процессах в случае химической ионизации мета-
ном. Два иона (CH5
+ — 44 % и C2H5
+ — 30 %) являются доминирующими ионами-реаген-
тами в образующейся плазме.
CH4 → CH4
+•, CH3
+, CH2
+• …
CH4
+• + CH4 → CH5
+ + CH3
•
CH3
+ + CH4 → C2H5
+ + H2 (1.2)
CH2
+• + CH4 → C2H3
+ + H2 + H
C2H3
+ + CH4 → C3H5
+ + H2
Когда молекула образца вводится в ионный источник, она взаимодействует с ио-
нами-реагентами. Возможны несколько типов реакций. Наиболее значимым является
протонирование (перенос протона). Если сродство к протону у аналита M выше, чем
у газа-реагента B (например метана в случае CH5
+), протекает следующая реакция:
М + ВН+ → MH+ + B. (1.3)
Необходимо подчеркнуть два момента. Во-первых, протонирование приводит
к возникновению четноэлектронных катионов (протонированных молекул), кото-
рые значительно стабильнее катион-радикалов, образующихся в условиях ионизации
электронами. Во-вторых, избыток внутренней энергии MH+ может быть легко вычислен
по уравнению
E = СП(M) – СП(B), (1.4),
где СП — сродство к протону M и B соответственно.
36 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
Таким образом могут быть генерированы протонированные молекулы аналита с из-
вестной внутренней энергией.
Помимо протонирования возможны три других важных процесса ионизации.
Перенос заряда. Если молекула газа-реагента не имеет водородных атомов (напри-
мер He), образуются катион-радикалы M+• аналита.
М + X+• → M+• + X (1.5)
В отличие от ИЭ их внутренняя энергия может быть легко рассчитана на основе зна-
чений энергии ионизации (ЭИ) аналита и энергии рекомбинации (ЭР) газа-реагента.
Е = ЭР(Х+•) – ЭИ(М) (1.6)
Электрофильное присоединение. Если сродство к протону молекулы аналита недоста-
точно велико, она может сформировать с ионом-реагентом стабильный комплекс.
М + X+ → MX+ (1.7)
Например, пики ионов [M + NH4]+ и [M + NO]+ весьма интенсивны в условиях ХИ
аммиаком и окисью азота соответственно.
Отрыв аниона. Такой процесс протекает при взаимодействии ионов-реагентов пере-
носа протона с аналитами с низким СП.
АВ + Х+ → AX + B+ (1.8)
Наиболее распространенный пример — это образование ионов [M – H]+ в условиях
химической ионизации алифатических углеводородов метаном.
В отличие от ИЭ в условиях ХИ образование отрицательных ионов может быть
весьма выраженным. Четыре основных процесса образования отрицательных ионов
аналита во многом напоминают процессы образования положительных ионов: перенос
протона (депротонирование), перенос заряда, нуклеофильное присоединение и нукле-
офильное замещение (Лебедев, 2003).
Химическая ионизация отрицательных ионов (ХИОИ, negative ion chemical ionization,
NICI) — это эффективный метод анализа соединений с высоким сродством к элек-
трону. В этом случае выигрыш в чувствительности по сравнению с режимом положи-
тельных ионов может быть весьма существенным. Хорошим примером использования
ХИОИ в экологических исследованиях является качественный и количественный ана-
лиз полихлорированных соединений (глава 15).
Недостатками химической ионизации являются необходимость перевода образца
в газовую фазу, слабо выраженная фрагментация и быстрое загрязнение источника ио-
нов. Тем не менее комбинация ХИ и ИЭ может быть очень успешной, поскольку первая
дает возможность зарегистрировать молекулярный ион, а вторая предоставляет исчер-
пывающую структурную информацию.
1.3.3. Полевая ионизация
Еще одним популярным «мягким» методом является полевая ионизация (ПИ, fi eld ionization,
FI). Само явление было открыто Е. Мюллером в 1951 году. Он создал полевой
ионный микроскоп, наблюдая за появлением катионов вблизи металлической поверх-
ности в сильном электростатическом поле (Muller, 1951). Через несколько лет источ-
1.3. Ионизация 37
ник ПИ был использован в масс-спектрометре (Inghram and Gomer, 1954). Тем не менее
успешное внедрение ПИ в систему ГХ/МС произошло только 20 лет спустя (Beckey, 1969;
Damico and Barron, 1971). Метод основан на эффекте туннелирования электрона. Ио-
низация происходит, когда молекула образца в газовой фазе оказывается вблизи эмит-
тера, к которому приложен очень высокий потенциал (8—10 кВ). В качестве эмиттера
обычно используются острые металлические поверхности (лезвие бритвы, острие иглы)
или острые иголочки, образующиеся при пиролизе бензонитрила. Кривизна поверх-
ности приводит к очень высоким значениям плотности электрического поля (~1 В/A).
В результате электрон молекулы аналита туннелирует с образованием катион-радика-
ла практически без избытка внутренней энергии. Помимо того, этот катион не может
долго находиться рядом с положительно заряженным эмиттером (8—10 кВ) и выталки-
вается из источника за 10—12 с, т. е. в 106 раз быстрее, чем в случае ЭИ. Фрагментация ока-
зывается практически невозможной, а масс-спектр очень часто состоит исключительно
из пика молекулярного иона.
Если образец наносится непосредственно на поверхность эмиттера при атмосфер-
ном давлении, а затем эмиттер вводится в ионный источник и на него подается напря-
жение, протекает аналогичный процесс ионизации, а метод называется полевой де-
сорбцией (ПД, fi eld desorption, FD). Этот метод был весьма популярен в 1970—1980-е гг.,
поскольку позволил впервые получить масс-спектры целого ряда нелетучих соедине-
ний. Механизм в этом случае связан с туннелированием электрона из твердофазного
образца с последующей десорбцией с эмиттера образовавшегося иона.
Некоторое время назад казалось, что ПИ утратила свое значение, но недавно по-
явившиеся приборы, способные попеременно снимать масс-спектры ЭИ и ПИ, вдохну-
ли новую жизнь в этот метод. Самые разнообразные экотоксиканты могут быть надеж-
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
10
0
10
74,04
55,05
87,05
75,04
298,29
143,11 255,23
101,06 129,09
199,17
157,12 185,16 213,19 241,22
267,27
269,25 299,29
298,29
299,30
300,31
EI
FI
Рис. 1.6. Масс-спектры электронной ионизации (верх) и полевой ионизации (низ) метил-
стеарата (с разрешения Waters Corp.)
38 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
но идентифицированы, когда их молекулярные ионы зарегистрированы в режиме ПИ,
а структурная информация получена в режиме ЭИ (рис. 1.6).
Еще три метода ионизации могут быть отмечены как наиболее приемлемые для
экологических исследований, связанных с определением полярных, термолабильных
и тяжелых молекул, т. е. таких, для которых предпочтительным методом разделения яв-
ляется ЖХ (глава 3).
1.3.4. Ионизация электрораспылением
Ионизация электрораспылением, или электроспрей (ЭРИ, еlectrospray ionization, ESI),
позволила совершить научный прорыв в область масс-спектрометрических исследо-
ваний нелетучих, нестабильных молекул, высокомолекулярных соединений, включая
природные полимеры (белки, сахара, нуклеиновые кислоты и т. д.). Основу для создания
метода заложили теоретические работы Доула (Dole et al., 1968). За пионерской работой
группы Л. Н. Галль (Александров и др., 1984) последовала публикация Дж. Фенна (Yamashita
and Fenn, 1984), который в 2002 году получил за создание электрораспыления
Нобелевскую премию.
Часто ионы аналита присутствуют уже в растворе, а если исходное полярное сое-
динение нейтрально, оно может быть легко переведено в ионную форму добавкой к его
раствору кислоты или основания. Для того чтобы использовать масс-спектрометрию
для регистрации этих ионов, надо всего лишь избавиться от молекул растворителя.
Для этой цели раствор аналита распыляется при атмосферном давлении в ионный ис-
точник прибора через тонкий капилляр (рис. 3.4 в главе 3), на который подается высо-
кое напряжение (3—7 кВ). Ионы одинаковой полярности в образующихся капельках
спрея стараются отойти друг от друга как можно дальше, распределяясь по поверхно-
сти сферической капли. Нагрев и поток инертного газа вызывают испарение раство-
рителя непосредственно из капелек спрея. В какой-то момент силы поверхностного
натяжения больше не могут компенсировать силы кулоновского расталкивания, вы-
зывая микровзрыв с образованием таких же капелек меньшего размера. Этот процесс
может повторяться многократно, приводя каждый раз к образованию капель мень-
шего размера. Предложено два основных механизма высвобождения ионов аналита.
Первый (Mora et al., 2000) базируется на том, что свободные ионы аналита образуются
исключительно благодаря последовательным микровзрывам, в результате которых ис-
ходные заряженные частицы мало-помалу теряют свою сольватную оболочку. Второй
ставит во главу угла ионное испарение за счет кулоновских взаимодействий (Iribarne
and Thomson, 1976). Серьезным аргументом в пользу ионного испарения служит не-
давнее исследование, проведенное группой Р. Зеноби методом ионной спектроскопии
(Chingin et al., 2010).
Существует несколько вариантов стыковки электрораспыления с жидкостным
хроматографом. Для улучшения процесса испарения могут использоваться несколько
дополнительных газовых потоков. Скорость потока элюента через колонку может со-
ставлять от нескольких миллилитров до нескольких нанолитров. В частности, режим
наноспрея с потоком 20—200 нЛ/мин. завоевал широкую популярность для анализа
биополимеров. В таком варианте достигаются сразу две цели: чувствительность значи-
тельно улучшается, а расход образца значительно уменьшается.
1.3. Ионизация 39
Важной особенностью ионизации электрораспылением является преимуществен-
ное образование многозарядных ионов. Поскольку анализаторы масс разделяют ионы
по их значениям m/z, спектры очень сложных соединений могут быть получены на до-
статочно простых приборах. Например, ион с массой 100 000 дальтон и зарядом +100 бу-
дет зарегистрирован прибором в том же месте спектра, что и однозарядный ион с массой
1000. По этой причине электрораспыление успешно используется для исследования со-
единений с молекулярными массами от сотен до миллионов дальтон. Рекордная зареги-
стрированная молекулярная масса составляет 110 миллионов дальтон (Chen et al., 1995).
Авторам удалось детектировать молекулярные ионы ДНК бактериофага T4 с зарядами
от 28000 до 35000.
Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением обладает превосходной
чувствительностью, достигая аттомолярных (10—18) и даже зептомолярных (10—21) уров-
ней. С источником электрораспыления, помимо жидкостной хроматографии, успешно
сочетается и капиллярный электрофорез. Возможен и прямой ввод раствора образца.
Перечисленные преимущества сделали ионизацию электрораспылением одним из наи-
более эффективных и востребованных методов сегодняшнего дня.
1.3.5. Химическая ионизация и фотоионизация при
атмосферном давлении
Впервые о химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД, atmospheric pressure
chemical ionization, APCI) заявил Хорниг в 1973 году (Horning et al., 1973), а в 1974 она
уже была успешно использована в сочетании с ЖХ (Horning et al., 1974). Метод основан
на подаче растворенного образца в источник ионов, работающий при атмосферном дав-
лении. Высокое напряжение, приложенное к электроду в виде острой иглы, создает ко-
ронный разряд, который и генерирует ионную плазму (рис. 3.5 в главе 3). Большинство
этих ионов обусловлено молекулами растворителя и атмосферных газов: азота и кисло-
рода. В таких условиях самые разнообразные ионно-молекулярные реакции неизбеж-
ны. Так, реакция первичных ионов с молекулой воды может привести к образованию
катиона H3O+ и аниона OH–. Реакции этих ионов-реагентов с молекулами аналита ведут
к появлению протонированных MH+- и депротонированных [M – H]–-молекул, которые
вытягиваются в анализатор. ХИАД демонстрирует лучшие результаты по сравнению
с электрораспылением, когда речь идет об умеренно полярных или легких органиче-
ских соединениях. ХИАД превосходит электроспрей и в том, что касается толерант-
ности по отношению к солям и компонетам буферных растворов, часто используемых
в жидкостной хроматографии.
Если необходимо проанализировать сложную смесь неполярных соединений (на-
пример нефть, см. главу 18 — «Петролеомика»), эффективным может быть метод фотоио-
низации при атмосферном давлении (ФИАД, atmospheric pressure photoionization, APPI).
Фотоионизация традиционно использовалась в основном для установления физико-хи-
мических характеристик молекул. Первый коммерческий прибор был создан в 1956 году
(Lossing and Tanaka, 1956). Однако вариант метода при атмосферном давлении был пред-
ложен только в 1986 году, когда И. А. Ревельский (Revelskii, 1985, 1986) продемонстриро-
вал его успешное использование для решения проблем анализа объектов окружающей
среды. Дополнительные преимущества ФИАД для ЖХ/МС были представлены Роббом
в 2000 году (Robb et al., 2000). ФИАД требует распыления раствора аналита в ионный ис-
40 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
точник (рис. 3.6 в главе 3), где УФ-излучение вызывает ионизацию молекул аналита в ре-
зультате прямого или вторичных процессов. Образуются одновременно как положитель-
ные, так и отрицательные ионы. ФИАД особенно полезна при работе с неполярными
соединениями, когда альтернативные электрораспыление и ХИАД не столь эффектив-
ны. Процесс ионизации можно модифицировать, введя в систему избыток специально-
го реагента (допанта). Толуол, ацетон, некоторые другие простые молекулы легко иони-
зуются в условиях ФИАД, а затем передают заряд молекуле аналита. В таком варианте
правильнее называть процесс фотохимической ионизацией при атмосферном давлении.
1.3.6. Матрично-активированная лазерная
десорбция/ионизация
Еще один эффективный метод ионизации, созданный в 1980-х, был назван матрично-
активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ, matrix assisted laser desorption/
ionization, MALDI). Его важность для науки была подтверждена присуждени-
ем за его создание (в тандеме с электрораспылением) Нобелевской премии в 2002 году.
Пока он не столь популярен в масс-спектрометрии окружающей среды, но в будущем
может оказаться весьма полезным. Метод основан на предварительной сокристаллиза-
ции молекул образца и матрицы. Облучение такого образца короткими лазерными им-
пульсами приводит к поглощению энергии лазера молекулами матрицы с практически
взрывным переносом этих молекул вместе с молекулами аналита в газовую фазу. По-
следующие реакции в образовавшейся плазме приводят к образованию ионов аналита.
Метод позволяет работать с очень сложными молекулами, включая природные и синте-
тические полимеры. МАЛДИ также является одним из наиболее эффетивных методов
для масс-спектрометрического имиджинга (глава 20).
1.4. Ìàññ-àíàëèçàòîðû
После того как ионы образца получены, необходимо их разделить. Для этой цели исполь-
зуются масс-анализаторы. Существует несколько типов анализаторов. Каждый из них
имеет свои преимущества и недостатки. Поэтому, покупая масс-спектрометр, очень
важно представлять диапазон задач, которые вы собираетесь решать с его помощью.
1.4.1. Секторные приборы
Исторически магнитные секторные приборы были первыми масс-спектрометрами.
Эти приборы могут иметь один магнитный анализатор или несколько магнитных и элек-
тростатических анализаторов. Чем больше анализаторов имеет масс-спектрометр, тем
более сложные исследования могут осуществляться с его помощью. Схема секторного
масс-спектрометра прямой геометрии с двойной фокусировкой (магнитный анализатор
следует за электростатическим) представлена на рис. 1.7. Покидая источник, ионы уско-
ряются по направлению к анализаторам.
Формула 1.9 — уравнение разделения ионов в магнитном секторе:
m/z e = B2R2/2V, (1.9)
1.4. Масс-анализаторы 41
где m — масса иона, e — элементарный заряд, z — число зарядов, B — напряженность
магнитного поля, R — радиус магнита, V — ускоряющее напряжение (обычно несколь-
ко кВ). Таким образом, магнитный анализатор может разделять ионы по их значениям
m/z при изменении напряженности поля, радиуса или ускоряющего напряжения, при-
чем предпочтительно изменять именно напряженность поля. Электростатический сек-
тор называется анализатором «энергий», поскольку пропускает только ионы с опреде-
ленной кинетической энергией (в обычном режиме напряжение электростатического
поля равно ускоряющему напряжению).
Объединение в приборе двух и более анализаторов позволяет проводить тандемные
масс-спектрометрические эксперименты (глава 4). Помимо этого, электростатический
анализатор (рис. 1.7) привносит дополнительную особенность — высокую разрешаю-
щую способность (разрешение по массе).
Разрешение по массе (R) означает способность масс-спектрометра разделять два
иона с массами m и (m + Δm). Формально для двух соседних пиков однозарядных ио-
нов равной интенсивности (рис. 1.8) разрешающая способность определяется как
R = m/Δm. Другой часто используемый термин «разрешение по массе» определяется
как Δm. Если Δm = 1, то R — теоретический предел измеряемой массы на приборе (когда
еще возможно увидеть два разделенных сигнала от соседних ионов целочисленной мас-
сы). Единичное разрешение означает, что масс-спектрометр позволяет разделять ионы
с точностью до целочисленных масс. Например, разрешающей способности 1000 доста-
точно для разделения ионов с m/z 999 и m/z 1000. Рис. 1.8 иллюстрирует определение
разрешающей способности (10%-я ложбина). Следует отметить, что для разрешающей
способности других анализаторов обычно пользуются 50%-й ложбиной.
Возникает вопрос, зачем необходима высокая разрешающая способность (сот-
ни тысяч и даже миллионы), когда речь идет о молекулах с молекулярными массами
в пределах нескольких сотен единиц? Ответ заключается в том, что любой изотоп любо-
го химического элемента имеет свой уникальный дефект массы. Поскольку в качестве
стандарта был выбран основной изотоп углерода 12C (12,000000…), массы всех осталь-
Источник ионов
Детектор
1 БП
2 БП
Магнитный
анализатор
Электростатический
анализатор
Рис. 1.7. Принципиальная схема двухфокусного масс-спектрометра (прямая геометрия).
БП — бесполевое пространство
42 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
ных изотопов нецелочисленны. Например, 1H — 1,00782506…; 14N — 14,00307407…; 16O —
15,99491475… . Измерив точную массу иона, можно установить его элементный состав,
поскольку не существует ионов с одинаковой массой и разным составом. Эти аспекты
будут детально рассмотрены в главе 18 при обсуждении петролеомики.
Важность высокого разрешения можно продемонстрировать на простейшем приме-
ре разделения мультиплета с целочисленной массой 28 дальтон. Три соединения с такой
молекулярной массой всегда присутствуют в фоне масс-спектрометра. Это азот, окись
углерода и этилен. Если разрешающая способность прибора ниже 500, молекулярные
ионы всех трех соединений регистрируются как один пик (рис. 1.9а). Постепенное уве-
личение разрешающей способности существенно меняет картину, приводя сначала
к дублету, а в конечном счете — к триплету (рис. 1.9б, в, г).
Чтобы разделить пики ионов составов СО и С2Н4 с точными масса-
ми 27,994915 и 28,03300 соответственно, необходима разрешающая способность
R = 28/(28,03300 – 27,994915) = 770, а для разделения пиков СО и N2 (масса молекулы
азота 28,006148 единиц) — 2500.
Установление элементного состава соединения, содержащего любые химические
элементы, за пару минут — важное преимущество масс-спектрометрии над трудоем-
ким определением состава с помощью классического элементного анализа. Тем не ме-
m
10%
m m m
Рис. 1.8. Определение разрешающей способности масс-спектрометра
R250 R1200 R2000 R3500
a б в г
Рис. 1.9. Форма пика фоновых ионов с m/z 28 при разной разрешающей способности
прибора
1.4. Масс-анализаторы 43
нее следует отметить, что элементный анализ дает информацию о составе всего образца
(включая примеси), тогда как масс-спектрометрия устанавливает элементный состав
индивидуальных соединений (отдельно всех компонентов и примесей образца).
Принимая во внимание, что число возможных элементных составов резко возрас-
тает с увеличением массы иона, масс-спектрометрия высокого разрешения становится
крайне важной при использовании во время работы с биомолекулами методов электро-
распыления и МАЛДИ. В этих случаях для надежного определения точных масс необ-
ходимы очень высокая разрешающая способность и точность измерения.
Кстати, разрешение по массе не является синонимом точности измерения массы.
Первый из этих параметров определяет способность масс-спектрометра получить раз-
дельные изображения (пики) ионов с близкими массами, а второй — установить точное
и правильное значение m/z иона, обычно для последующего определения его элементно-
го состава. Не стоит думать, что увеличение разрешения всегда ведет к автоматическому
улучшению точности измерения масс. Как только разрешение оказывается достаточ-
ным для разделения пиков измеряемых ионов, бессмысленно увеличивать его далее, по-
скольку интенсивность сигналов будет уменьшаться с неизбежным уменьшением точ-
ности измерений масс.
Рис. 1.10 иллюстрирует важность применения масс-спектрометрии высокого раз-
решения для экологических исследований. Наблюдение широкого пика со временем
Рис. 1.10. Форма хроматографического пика в режиме SIM (см. главу 2) при использова-
нии разрешающей способности 3000 (широкий пик) и 10000 (два узких пика)
(с разрешения Thermo)
Высокое разрешение
Низкое разрешение
Относительная интенсивность
m/z
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
321,3 321,4 321,5 321,6 321,7 321,8 321,9 322,0 322,1 322,2 322,3 322,4 322,5
5
0
Другое
хлорированное
соединение
ТХДД
44 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
выхода 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксина на масс-хроматограмме (глава 2) по току
ионов с m/z 321,9 может привести к выводу о присутствии в образце значительных ко-
личеств этого суперэкотоксиканта. Тем не менее более точные измерения массы (4 де-
сятичных знака) наглядно демонстрируют, что этот широкий пик обусловлен супер-
позицией двух пиков ионов с m/z 321,8936 и 321,8678. Первый из них действительно
обусловлен 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксином, однако второй принадлежит значи-
тельно менее токсичному гептахлорбифенилу; т. е., возможно, экологическая ситуация
не настолько плоха, как могло показаться исходя из результатов анализа с недостаточ-
ным разрешением.
Измеряя массы с очень высоким разрешением, фактически можно измерять энер-
гии. Работает знаменитое уравнение Эйнштейна E = mc2. В частности, энергия связи,
складывающаяся из сильных, слабых и электромагнитных взаимодействий, может быть
определена при измерении масс всей молекулы и ее составляющих.
Возвращаясь к секторным масс-спектрометрам, следует отметить следующие
аспекты. Современные приборы этого типа обладают великолепным разрешением
по массе, точностью измерения масс, чувствительностью, а также надежностью ко-
личественного определения. Их динамический диапазон остается непревзойденным,
а диапазон измеряемых масс уступает только времяпролетным приборам. К недостат-
кам этих анализаторов можно отнести небольшую скорость сканирования и достаточ-
но большие размеры.
1.4.2. Квадрупольные приборы
Прорыв масс-спектрометрии в область экологии произошел в 1970-х с внедрением ква-
друпольных приборов в широкую практику. Это устройство часто называют фильтром
масс. Оно состоит из четырех параллельных стержней (рис. 1.11), к которым приложено
переменное и постоянное напряжения, создающие квадрупольное поле, способное фо-
кусировать, удерживать и анализировать ионы. Низкая стоимость, небольшие размеры,
высокая скорость сбора данных, превосходный динамический диапазон, хорошая вос-
Ось поля
z
y
x
(U V cos t)
(U V cos t )
Рис. 1.11. Принципиальная схема квадрупольного анализатора
1.4. Масс-анализаторы 45
производимость и пониженные требования к вакуумной системе являются основными
достоинствами квадрупольных масс-спектрометров.
Благодаря этим характеристикам даже невысокое разрешение по массе не оста-
новило активного продвижения квадруполей на приборный рынок. Поскольку моле-
кулярные массы подавляющего большинства приоритетных загрязняющих веществ
редко превосходят 500 Дальтон, квадрупольные масс-спектрометры с разрешающей
способностью 1000 оказались идеальным инструментом для качественного и количе-
ственного определения этих соединений в самых разнообразных образцах. Неплохая
чувствительность квадруполей в режиме сканирования может быть увеличена при-
мерно в 100 раз при работе в режиме масс-фрагментографии (мониторинга заданных
ионов, см. главу 2).
Комбинация трех квадруполей (QqQ) позволяет использовать несколько режимов
тандемной масс-спектрометрии (MС/MС, глава 4). Этот подход активно применяется
в настоящее время для надежной идентификации и количественного определения за-
грязняющих веществ и природных соединений, включая пептиды и белки.
Предположим, у нас имеется смесь нескольких соединений. Можно ли установить
масс-спектрометрически их структуры без предварительного разделения (хроматогра-
фии), а введя непосредственно в ионный источник всю смесь? Действительно, магнит-
ные секторные и тройные квадрупольные приборы, ионные ловушки, приборы ионного
циклотронного резонанса, орбитальные ловушки (см. ниже) могут справиться с этой
задачей.
Использование «мягкого» метода ионизации (ХИ, ПИ, МАЛДИ, электрораспы-
ление) дает возможность получить молекулярные ионы компонентов смеси. Молеку-
лярные ионы каждого типа (рис. 1.12, белые, розовые или зеленые шарики) по очереди
проходят через первый квадруполь и направляются к следующему анализатору (Q3).
На пути следования они попадают в специальную ячейку (Q2), в которой их внутрен-
няя энергия повышается каким-либо образом для того, чтобы инициировать их фраг-
ментацию. Существует достаточно много реакций активации, хотя соударение с ато-
мами инертного газа остается наиболее популярным процессом. Фрагментные ионы
(рис. 1.12, синие, красные и черные шарики) исходного молекулярного иона (рис. 1.12,
зеленые шарики) достигают второго анализатора, в котором они разделяются по m/z,
т. е. происходит регистрация масс-спектра первого компонента образца. Далее про-
Рис. 1.12. Схема эксперимента МС/МС в пространстве. В качестве примера использован
тройной квадруполь (с разрешения Applied Biosystems)
ввод N2
Радио-
частотный
ионный фильтр
Q1 Q2
Камера соударений
Q3
Детектор
МС/МС
в пространстве
46 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
цедура повторяется со вторым молекулярным ионом (например, розовые шарики
на рис. 1.12) и так далее. Когда будет осуществлена фрагментация всех молекулярных
ионов, анализ образца без его предварительного разделения будет завершен. Обыч-
но такой режим занимает значительно меньше времени, чем, например, ГХ/МС или
ЖХ/МС. Очевидным недостатком является невозможность анализировать изомеры.
Кстати, при наличии соответствующих конструкционных характеристик каждый
из фрагментных ионов может быть выделен аналогично молекулярному и после про-
цедуры активации фрагментации мы получим его масс-спектр. Этот метод называет-
ся МС3. Ионные ловушки способны зарегистрировать спектры до 10 поколений фраг-
ментных ионов. Этот метод называется МСn. Детали тандемной масс-спектрометрии
будут рассмотрены в главе 4.
1.4.3. Ионные ловушки
Впервые ионная ловушка в качестве устройства для удерживания ионов была предложе-
на Паулем (Paul, Steinwedel, 1953) в 1953 году. Существует много разных ионных ловушек:
квадрупольные, цилиндрические, линейные и т. д. (подробнее см. главу 9). Принцип ра-
боты наиболее популярной цилиндрической ловушки мало отличается от такового для
квадруполя. Разница заключается в геометрии. Обычно ловушки состоят из двух торце-
вых и одного кольцевого электрода, которые создают рабочий объем для экспериментов
с ионами. Ловушки оказались еще дешевле и меньше по размеру, чем квадруполи. Более
того, сложные тандемные эксперименты (МСn) могут осуществляться в любой ионной
ловушке, а при использовании низкой скорости сканирования разрешающая способ-
ность этих приборов может достигать 107 (March, 1998). Кстати, МС/МС-эксперименты
в ионных ловушках называются МС/МС во времени в противоположность МС/МС
в пространстве в тройных квадрупольных и магнитных секторных приборах. Эти осо-
бенности сделали ионные ловушки вполне конкурентоспособными квадруполям,
несмотря на меньший динамический диапазон и ухудшенные характеристики коли-
чественного анализа. В любом случае ионные ловушки позволяют работать с разноо-
бразными экотоксикантами в требуемых диапазонах концентраций. В экологических
исследованиях для повышения чувствительности и скорости сбора данных они обычно
стыкуются с газовым или жидкостным хроматографом и функционируют с разрешени-
ем в 1 единицу массы. Линейная квадрупольная ионная ловушка — еще один вариант
анализаторов этого типа. Она отлично зарекомендовала себя в качестве устройства для
инициирования фрагментации в режиме МС/МС.
1.4.4. Времяпролетные масс-спектрометры
Пусть у нас есть полая труба, а ионы с разными значениями m/z находятся на стартовой
линии около входа в эту трубу. Если, приложив потенциал (V), мы ускорим одновремен-
но все эти ионы, они полетят по трубе, причем их кинетическая энергия будет одинако-
вой (см. также главу 9).
eV = mv2/2 или m = 2eV/v2 (1.10)
Это означает, что более тяжелые ионы достигнут конца трубы позже, чем более лег-
кие. Это основной принцип времяпролетной масс-спектрометрии (time-of-fl ight, TOF).
1.4. Масс-анализаторы 47
Хотя теоретические основы этого метода были заложены в середине XX века (Wolff and
Stephens, 1953), использование этих приборов для изучения самых разнообразных ор-
ганических соединений началось только через 40 лет. Проблемы были связаны с раз-
бросом по времени старта, энергии и в пространстве, а также с необходимостью иметь
очень быстрые детекторы, поскольку ионы с разной величиной m/z достигают детек-
тора с очень небольшой разницей по времени (если, конечно, труба имеет реальную
длину). Однако теперь при наличии современной электроники и после изобретения
рефлектрона (Mamyrin, 1973), применения фокусировки с временной задержкой (Wiley
and McLaren, 1955) и техники ортогонального ускорения (Dodonov et al., 1994, Dawson and
Guilhaus, 1989) времяпролетные приборы стали наиболее популярными, а их перспек-
тивы — самыми радужными. Разрешающая способность современных времяпролетных
масс-спектрометров достигает сотен тысяч, они обладают высокой точностью измере-
ния масс, теоретически неограниченным диапазоном масс. Их чувствительность до-
статочно высока, а скорость сбора данных непревзойденная. Например, прибор LECO
Pegasus IVD может регистрировать до 500 спектров в секунду. Эта особенность привела
к созданию быстрой хроматографии (глава 6). Кроме того, благодаря единовременному
старту ионов со всеми значениями m/z к детектору масс-спектры оказываются идентич-
ными вне зависимости от того, в какой части хроматографического пика они были за-
регистрированы (рис. 2.6, глава 2). Это важное преимущество времяпролетных анали-
заторов по сравнению с другими масс-спектрометрами.
Времяпролетные анализаторы лучше других подходят для работы с импульсными
методами ионизации типа МАЛДИ, однако техника ортогонального ускорения позво-
ляет эффективно использовать их и в комбинации с непрерывными источниками ионов.
Времяпролетные приборы могут применяться и для МС/МС-экспериментов. При этом
они являются идеальным анализатором ионов-продуктов в различных гибридных при-
борах типа QTOF, IT-TOF.
1.4.5. Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса
с преобразованием Фурье
История наиболее мощных анализаторов (масс-спектрометрия ионного циклотронного
резонанса с преобразованием Фурье, ИЦР ПФ, Fourier transform ion cyclotron resonance,
FTICR) связана с тремя датами. Принцип ионного циклотронного резонанса был пред-
ложен Лоуренсом в 1930-м году (Lawrence and Edelfsen, 1930), первый прибор был создан
Соммером в 1950 (Hipple et al., 1949), а в 1974 Маршалл и Комисаров впервые применили
преобразования Фурье (Comisarow and Marshall, 1974). В противоположность ранее опи-
санным анализаторам в масс-спектрометрах ионного циклотронного резонанса ионы
удерживаются в ячейке прибора благодаря приложенным перпендикулярным магнит-
ным и электростатическим полям. При этом ионы движутся по круговым траекториям,
перпендикулярным магнитному полю. Частоты движущихся в ячейке ионов зависят
от их значений m/z. Можно провести возбуждение ионов радиочастотным импульсом
и перевести их на резонансные орбиты. Движение ионов в ячейке генерирует во внеш-
них пластинах детектора наведенный ток, причем его частота точно соответствует зна-
чению m/z ионов в ячейке. Затухание этих наведенных токов регистрируется как времен-
ной сигнал, который может быть конвертирован в классическую форму масс-спектра
48 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
приложением преобразований Фурье. Поскольку ионы не покидают ячейку, процесс
возбуждения и детектирования может повторяться многократно. Подробнее этот метод
изложен в главе 18.
Метод ИЦР ПФ дает возможность инициировать каким-либо образом фрагмен-
тацию интересующих исследователя ионов и осуществить эксперимент тандемной
масс-спектрометрии. Кроме того, можно изучать реакции целевых ионов с разными
нейтральными или заряженными частицами. В этом случае речь идет об ионно-моле-
кулярных и ионно-ионных реакциях в газовой фазе.
Основным достоинством метода ионного циклотронного резонанса является его
сверхвысокая разрешающая способность. Именно благодаря ей элементный состав ио-
нов может быть установлен с высокой надежностью. Метод эффективен для решения
фундаментальных научных проблем, а на его базе были созданы новые прикладные
дисциплины, занимающиеся сверхсложными смесями природных соединений типа
нефтей и нефтепродуктов (глава 18) или гуминовых веществ (глава 19).
Основным недостатком масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса яв-
ляется очень высокая стоимость оборудования и его эксплуатации. Этот момент суще-
ственно сдерживает распространение этого фантастического метода.
1.4.6. Орбитальные ловушки
К концу XX века казалось, что будущее масс-спектрометрии будет связано исключи-
тельно с усовершенствованием известных типов анализаторов. Это мнение базирова-
лось на факте, что за несколько прошедших десятилетий не было предложено никаких
новых систем. Поэтому, когда Александр Макаров объявил о создании орбитальной ло-
вушки (рис. 1.13), это было воспринято в качестве революционного события (Makarov,
1999, 2000). Избегая технических деталей, не являющихся необходимыми для целей
данной книги, следует лишь отметить, что в орбитальных ловушках, как и в приборах
ИЦР, для измерения масс используются преобразования Фурье. Однако дорогостоящие
супермагниты в этом случае не нужны. Обладая высокой разрешающей способностью
Ионный
источник ХИАД
Линейная
ионная ловушка С-ловушка
Дифференциальная
откачка Орбитальная
ловушка
Рис. 1.13. Принципиальная схема орбитальной ловушки (с разрешения A. Макарова)
Литература 49
и высокой точностью измерения масс, орбитальные ловушки за 5 лет стали самыми вос-
требованными приборами на масс-спектрометрическом рынке.
1.5. Äåòåêòèðîâàíèå èîíîâ
Конечный блок масс-спектрометра отвечает за детектирование ионов. В первых клас-
сических приборах использовалась фотопластинка. Ионы с одинаковым значением m/z
попадали на конкретный участок фотопластинки, а уровень засвечивания позволял
проводить количественные измерения.
Токи ионов с одной величиной m/z в конкретном эксперименте очень малы (10–9—
10—17 А) для прямого измерения. Поэтому детектированию предшествует процедура уси-
ления сигнала. Умножители генерируют вторичные токи, более мощные в 104—108 раз.
Когда ион проходит анализатор и попадает в детектор, он инициирует эмиссию вторич-
ных частиц, например фотонов или электронов. Детекторы конвертируют энергию вхо-
дящих частиц в ток, который измеряется соответствующими устройствами.
Электронные умножители могут быть разделены на две основные группы: с дискрет-
ным динодом (несколько раздельных динодов) и непрерывным динодом (непрерывная
эмиссионная поверхность с высокой способностью ко вторичной эмиссии, например
мультиканальная пластина). Несколько эффективных конструкций детекторов описаны
в (Westman-Brinkmalm and Brinkmalm, 2009). Для регистрации отрицательных ионов на пер-
вой стадии регистрирующей системы находится конверсионный динод. Отрицательный
ион, попадая на этот динод, генерирует разные частицы, включая положительные ионы,
которые регистрируются далее обычным образом. В случае приборов ионного цикло-
тронного резонанса и орбитальных ловушек процесс регистрации ионов недеструктивен
и основан на измерении наведенных токов. Важнейшими характеристиками детекто-
ров являются линейность, коэффициент умножения, время восстановления и уровень
шума. Дополнительная полезная информация о детекторах представлена в главе 9.
Ëèòåðàòóðà
[1]. Aleksandrov M. L., Gall L. N., Krasnov V. N., Nikolaev V. I., Pavlenko V. A., Shkurov V. A.
(1984). «Ion extraction from solutions at atmospheric pressures: a mass spectrometric method
of analysis of bioorganic compounds». Doklady Akademii Nauk SSSR. 277, 2: 379—383.
[2]. Beckey H. D., Hilt E., Maas A., Migahed M. D., and Ochterbeck E. (1969). «A method for
strong activation of fi eld ion emitters». International Journal of Mass Spectrometry and Ion
Physics. 3, 1—2: 161—165.
[3]. Chingin K., Frankevich V., Balabin R. M., Barylyuk K., Chen H., Wang R., and Zenobi R.
(2010). «Direct access to isolated biomolecules under ambient conditions». Angewandte Chemie.
International Edition., 49, 13: 2358—2361.
[4]. Chen R., Cheng X., Mitchell D. W., Hofstadler S. A., Wu Q., Rockwood A. L., Sherman
M. G., and Smith R. D. (1995). «Trapping, Detection, and Mass Determination of
Coliphage T4 DNA Ions by Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance
Mass Spectrometry». Analytical Chemistry. 67, 7: 1159—1164.
50 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
[5]. Comisarow M. B., and Marshall A. G. (1974). «Fourier transform ion cyclotron resonance
spectroscopy». Chemical Physics Letters. 25, 2: 282—283.
[6]. Damico J. H., and Barron R. P. (1971). «Application of fi eld ionization to gas-liquid chromatography-
mass spectrometry (GLC-MS) studies». Analytical Chemistry. 43, 1: 17—21.
[7]. Dawson J. H. J., and Guilhaus M. (1989). «Orthogonal-acceleration time-of-fl ight mass
spectrometer». Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 5: 155—159
[8]. Dempster A. J. (1921). «Positive ray analysis of lithium and magnesium». Physical Reviews.
18, 6: 415—422.
[9]. Dodonov A. F., Chernushevich I. V., and Laiko V. V. (1994). Electrospray Ionization on a Refl
ecting Time-of-Flight Mass Spectrometer. In: Cotter R. J. Time-of-Flight Mass Spectrometry.
ACS Symposium Series 549, Washington, DC, 108—123.
[10]. Dole M., Mack L. L., Hines R. L., Mobley R. C., Ferguson L. D., and Alica M. B. (1968).
«Molecular beams of macroions». Journal of Chemical Physics. 49, 5: 2240—2249
[11]. Harrison A. G. (1992). Chemical Ionization Mass Spectrometry, CRC Press, Boca Raton,
USA.
[12]. Hipple J. A., Sommer H., and Thomas H. A. (1949). «A precise method of determining the
Faraday by magnetic resonance». Physical Reviews. 76, 12: 1877—1878
[13]. Horning E. C., Horning M. G., Carroll D. I., Dzidic I., and Stillwell R. N. (1973). «New
picogram detection system based on a mass spectrometer with an external ionization source
at atmospheric pressure». Analytical Chemistry. 45, 6: 936—943
[14]. Horning E. C., Carroll D. I., Dzidic I., Haegele K. D., Horning M. G., and Stillwell R. N.
(1974). «Liquid chromatograph-mass spectrometer-computer analytical systems: a continuous-
fl ow system based on atmospheric pressure ionization mass spectrometry». Journal
Chromatography A. 99, 13—21.
[15]. Inghram M. G., and Gomer R. (1954). «Mass spectrometric analysis of ions from the fi eld
microscope». Journal of Chemical Physics. 22, 7: 1279—1280.
[16]. Iribarne J. V., and Thomson B. A. (1976). «On the evaporation of small ions from charged
droplets». Journal of Chemical Physics. 64, 6: 2287—2294.
[17]. Lawrence E. O., and Edelfsen N. E. (1930). «On the production of high speed protons». Science.
72, 376—377
[18]. Lebedev A. T. (2009). Introduction to mass spectra interpretation: Organic chemistry. In: Ekman
R., Silberring J., Westman-Brinkmalm A. M., and Kraj A. (Ed.), Mass spectrometry.
Instrumentation, interpretation and applications. John Wiley @ Sons Inc., Hoboken, New
Jersey.
[19]. Lossing F. P., Tanaka I. J. (1956). «Photoionization as a source of ions for mass spectrometry
». Journal of Chemical Physics. 25, 5: 1031—1034.
[20]. Makarov A. A., Mass Spectrometer. US Pat. 5,886,346, 1999.
[21]. Makarov A. (2000). «Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance
technique of mass analysis». Analytical Chemistry. 72, 6: 1156—1162.
[22]. Mamyrin B. A., Karataev V. I., Shmikk D. V., and Zagulin V. A. (1973). «The mass refl ectron,
a new non-magnetic time-of-fl ight mass spectrometer with high resolution». Zurnal
Experimentalnoi y Teoreticheskoi Physiki. 64, 1: 82—90
[23]. March R. E. (1998). «Quadrupole ion trap mass spectrometry: Theory, Simulation, Recent
Developments and Applications». Rapid Communications in Mass Spectrometry. 12, 21:
1543—1554
Литература 51
[24]. Mora J. F., Van Berkel G. J., Enke C. G., Cole R. B., Martinez-Sanchez M., and Fenn J. B.
(2000). «Electrochemical processes in electrospray ionization mass spectrometry». Journal
of Mass Spectrometry. 35, 8: 939—952.
[25]. Muller E. W. (1951). «Das Feldionenmikroskop». Zeitschrift fur Physic. A131, 1: 136—142.
[26]. Munson M. S. B., Field F. H. (1966). «Chemical ionization mass spectrometry. I. General
introduction». Journal American Chemical Society. 88, 12: 2621—2630.
[27]. Paul W., and Steinwedel H. (1953). Ein neues Massenspektromrter ohne Magnetfeld. Z. Naturforsch,
A8: 448—450
[28]. Revelskii I. A. (1985). The method of mass spectrometric analysis of the gas mixtures. USSR
Patent 1159412, Bulletin 47.
[29]. Revelskii I. A., Yashin Yu. S., Voznesenskii V. N., Kurochkin V. K., Kostyanovskii R. G.
(1986). Mass spectrometry with phjtjionization of n-Alkanes, Alkohols, Ketones, Esters and
Amines at atmospheric pressure. Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimiya, 9:
1887—1892.
[30]. Robb D. R., Covey T. R., and Bruins A. P. (2000). «Atmospheric pressure photoionization:
an ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry». Analytical Chemistry.
72, 15: 3653—3659
[31]. Westman-Brinkmalm A. M., and Brinkmalm G. (2009). A mass spectrometer´s building
blocks. In: Ekman R., Silberring J., Westman-Brinkmalm A. M., and Kraj A. (Ed.), Mass
spectrometry. Instrumentation, interpretation and applications. John Wiley @ Sons Inc.,
Hoboken, New Jersey.
[32]. Wiley W. C., and McLaren I. H. (1955). «Time-of-fl ight mass spectrometer with improved
resolution». The review of Scientifi c Instruments. 26, 12: 1150—1157
[33]. Wolff M. M., and Stephens W. E. (1953). «A pulsed mass spectrometer with time dispersion
». The review of Scientifi c Instruments. 24. 8: 616—617.
[34]. Yamashita M., and Fenn J. B. (1984). «Electrospray ion source: another variation on the
free-jet theme». The Journal of Physical Chemistry. 88, 20: 4451—4459.
[35]. А. Т. Лебедев. Масс-спектрометрия в органической химии. Бином, 2003
ÃËÀÂÀ 2
ÃÀÇÎÂÀß ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈß /
ÌÀÑÑ-ÑÏÅÊÒÐÎÌÅÒÐÈß —
«ÐÀÁÎ×Àß ËÎØÀÄÊÀ»
ÄËß ÀÍÀËÈÇÀ ÎÁÚÅÊÒÎÂ
ÎÊÐÓÆÀÞÙÅÉ ÑÐÅÄÛ
А. Т. Лебедев
2.1. Îáùèå âîïðîñû
Соединение газового хроматографа и масс-спектрометра было абсолютно логично, по-
скольку оба метода обладали примерно равной чувствительностью и успешно исполь-
зовались для анализа органических соединений. Газовый хроматограф разделяет ком-
поненты образца, а масс-спектрометр отвечает за их детектирование и идентификацию.
Однако благодаря синергетическому эффекту эта комбинация стала одним из наиболее
мощных аналитических методов современной науки. Основные принципы стыковки
были выдвинуты и реализованы в 1957 году. Единственной технической сложностью
объединения этих методов было рабочее давление. Если газовая хроматография работа-
ет в условиях атмосферного давления, то масс-спектрометрия требует условий высокого
вакуума. Разница достигает 8 порядков. В первых приборах вслед за набивной хрома-
тографической колонкой устанавливались специальные сепараторы, которые снижали
поток газа-носителя (30 мл/мин). Появление капиллярных колонок и более мощных
насосов устранило эту проблему. Теперь конец гибкой колонки из плавленого кварца
вводится непосредственно в ионный источник масс-спектрометра.
Более 20 лет потребовалось для того, чтобы состыковать масс-спектрометр с жид-
костным хроматографом. Подробнее о приборах и применении метода «жидкостная
хроматография/масс-спектрометрия» повествует Глава 3.
Безусловно, круг соединений, которые можно исследовать методом газовой хро-
матографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС) значительно уже, чем тот, который можно
исследовать методом масс-спектрометрии индивидуально. По счастью, для подавляю-
щего большинства антропогенных загрязняющих веществ газовая хроматография при-
менима. Поэтому ГХ/МС является чрезвычайно эффективным аналитическим мето-
дом в экологических исследованиях.
Говоря о методах ионизации в ГХ/МС, следует отметить, что более 90 % проводи-
мых анализов основано на электронной ионизации (ИЭ, глава 1), которая обеспечивает
интенсивную фрагментацию и позволяет эффективно применять компьютерные би-
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 53
блиотеки масс-спектров (глава 5). Существенно реже, но весьма успешно применяются
химическая ионизация (ХИ) и полевая ионизация (ПИ). Основная цель этих методов —
регистрация пика молекулярного иона, поскольку он зачастую отсутствует в спектрах
электронной ионизации. В этом случае эти методы являются отличным дополнением
к ИЭ. Поочередная регистрация ИЭ- и ХИ- (ПИ-) спектров во время ГХ/МС-анализа
дает информацию и о молекулярном ионе, и о наиболее значимых фрагментных ионах
(рис. 1.6 в главе 1). Кроме того, поскольку в спектрах ХИ и ПИ часто присутствует лишь
один пик молекулярного иона, они могут характеризоваться лучшими пределами обна-
ружения при количественном определении аналитов.
Хроматография привносит в комбинированный метод ГХ/МС (ЖХ/МС) очень важ-
ный параметр — время выхода (удерживания). Благодаря этому параметру появляется
возможность различать изомеры, даже в тех случаях, когда их масс-спектры очень близ-
ки друг другу. Это особо значимо для экологических исследований, поскольку токсич-
ности изомеров могут отличаться в миллионы и миллиарды раз (например, бенз[a]пи-
рен и бенз[e]пирен; 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксин и его многочисленные изомеры).
Таким образом, время удерживания может играть ключевую роль в установлении (под-
тверждении) структуры аналита.
2.2. Òèïû õðîìàòîãðàìì ñ ðåãèñòðàöèåé èîííîãî òîêà
Покидая колонку, элюат попадает в источник ионов масс-спектрометра, где осущест-
вляется ионизация. Образующиеся молекулярный и фрагментные ионы аналитов разде-
ляются в масс-анализаторе, причем осуществляется постоянная запись масс-спектров
в заданном диапазоне масс. Результирующая хроматограмма (рис. 2.1а) демонстрирует
последовательность пиков, обусловленных индивидуальными соединениями — ком-
понентами анализируемого образца. Каждый пик, как правило, охарактеризован не-
сколькими масс-спектрами. По абсциссе откладывается время выхода ингредиентов,
а по ординате — величина полного ионного тока (ПИТ), зарегистрированная в данный
момент времени. Другими словами, ПИТ — это абсолютное количество всех ионов,
образующихся в данный момент времени и регистрирующихся за одно сканирование
спектра во всем заданном диапазоне масс. Чем больше ионный ток, тем выше положе-
ние сигнала данного скана на оси ординат. Количественное определение достаточно
очевидно, так как площадь хроматографического пика пропорциональна количеству
данного компонента в образце.
Хроматограмма такого типа называется хроматограммой по полному ионному
току или ПИТ (рис. 2.1а). Компьютер обычно автоматически перестраивает ПИТ-
хроматограмму, чтобы устранить фоновые пики, дрифт нулевой линии, остаточные
сигналы растворителя, артефакты и т. д., создавая реконструированную хроматограм-
му по полному ионному току (РПИТ). Рис. 2.1 демонстрирует различия между ПИТ-
и РПИТ-хроматограммами. Почти все пики на РПИТ-хроматограмме разрешены до ну-
левой линии, что улучшает возможности как идентификации, так и количественного
определения. Таким образом, ГХ/МС позволяет проводить качественный и количе-
ственный анализ, оперируя с очень сложными смесями соединений без их предвари-
тельного разделения.
54 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
Компьютерная обработка может существенно улучшить качество масс-спектров.
Наиболее распространенными вариантами являются усреднение спектров и вычитание
фона. В первом случае интенсивность пиков ионов с конкретной величиной m/z в масс-
спектрах по всему профилю хроматографического пика суммируется и делится на чис-
ло спектров. В частности, усреднение минимизирует искажение спектров (см. ниже).
На рис. 2.2 представлена процедура вычитания фона. Она позволяет детектировать, на-
пример, следовые количества аналита на фоне значительного матричного фона в слож-
ных образцах. Хотя два основных кластера пиков ДДЕ (m/z 246 и 318) едва различимы
в масс-спектре, зарегистрированном на вершине хроматографического пика (рис. 2.2а),
после процедуры вычитания сходимость очищенного спектра со стандартным (библио-
течным) составила 88 % (рис. 2.2в).
Фоновый спектр необходимо выбрать на расстоянии нескольких сканирований
справа или слева от пика аналита, в точке, в которой интенсивность пиков ионов ана-
лита близка к нулю. Сигналы ионов каждого значения m/z в фоновом спектре должны
быть вычтены из аналогичных сигналов (с тем же значением m/z) в спектре, зарегистри-
рованном на вершине хроматографического пика. Результирующий пик практически
не содержит фоновых сигналов. В этом случае идентификация по спектральным базам
данных становится значительно надежнее и эффективнее. Иногда таким образом мож-
но расчистить сигналы аналитов, присутствующих в пробе в следовых количествах.
Чтобы улучшить качество спектра, полезно также перед вычитанием фона провести
усреднение фонового спектра. В этом варианте интенсивности ионов с каждым значе-
500
2,5е+007
2е+007
1,5е+007
1е+007
5е+006
0
2е+007
1,75е+007
7,5е+006
1,5е+007
1,25е+007
1е+007
5е+006
2,5е+006
0
600 700 800 900 1000 1100
500 600 700 800 900 1000 1100
a
б
Время, с
Время, с
РПИТ
ПИТ
Рис. 2.1. ГХ/МС-анализ. Органические загрязняющие вещества в образце природной
воды. (a) Хроматограмма по полному ионному току (ПИТ); (б) реконструирован-
ная хроматограмма по полному ионному току (РПИТ)
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 55
нием m/z суммируются по двум спектрам, зарегистрированным справа и слева у подно-
жия хроматографического пика, а полученные величины делятся на два. Усредненный
спектр вычитается из спектра аналита, как уже описано выше.
Существует две основные стратегии использования ГХ/МС. Первая связана с де-
тектированием целевых соединений. В этом случае задача обычно заключается в коли-
чественном определении заранее выбранных аналитов. При этом все остальные компо-
ненты образца, как правило, игнорируются. Вторая стратегия называется скринингом,
нецелевым анализом или анализом полного спектра. Эта существенно более сложная
задача включает идентификацию всех компонентов образца с последующим выбором
среди них наиболее значимых исходя из целей анализа. Точное количественное опре-
Рис. 2.2. (а) Масс-спектр, зарегистрированный на вершине хроматографического пика;
(б) масс-спектр фона; (в) масс-спектр аналита после вычитания фона (степень
идентичности 88 %); (г) библиотечный (NIST) масс-спектр ДДЕ
a
б
в
г
56 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
деление в режиме скрининга, как правило, невозможно. Однако по результатам можно
сделать более или менее точные количественные оценки. Наиболее полезные варианты
ГХ/МС-анализа в рамках этих двух стратегий описаны далее.
Существует еще один крайне полезный момент, невозможный в обычной газовой
хроматографии. Он особенно хорош для целевого анализа и заключается в перестрое-
нии хроматограмм с использованием тока только заданных ионов, например, m/z 141
и 156 на рис. 2.3б. Будучи очень эффективен для детектирования в образце целевых со-
единений, такой вариант представления называется масс-хроматограммой, реконстру-
ированной ионной хроматограммой (reconstructed ion chromatogram, RIC), селективной
ионной хроматограммой (selected ion chromatogram, SIC) или хроматограммой по току
выбранных ионов (extracted ion current, EIC).
Например, ионы с m/z 141 и 156 характерны для алкилнафталинов. Поскольку уров-
ни этих соединений в проанализированном образце природной воды были низки, их
a
Рис. 2.3. ГХ/МС-анализ. Хроматограммы образца природной воды с пиками органи-
ческих загрязняющих веществ. (а) Хроматограмма по полному ионному току;
(б) масс-хроматограмма по току ионов с m/z 141 (рыжий) и m/z 156 (зеленый), ха-
рактерных для метилнафталинов и диметилнафталинов соответственно
Время, с
Спектр №
Время, с
Спектр №
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 57
пики отсутствуют на ПИТ-хроматограмме (рис. 2.3а). Напротив, пики изомерных ме-
тил- и диметилнафталинов доминируют на масс-хроматограмме (рис. 2.3б). Становит-
ся возможным не просто детектирование, но и надежное количественное определение
этих соединений. Принимая во внимание, что построение масс-хроматограммы осно-
вано на перестроении исходной хроматограммы ПИТ и занимает лишь несколько се-
кунд компьютерного времени, эффективность такого подхода очевидна.
Хотя формально масс-хроматография не повышает чувствительности метода,
она позволяет наглядно выпятить инфомацию о целевых аналитах, скрытую на ПИТ-
хроматограмме пиками фона и мажорных компонентов. Масс-хроматограммы всегда ме-
нее сложны и более селективны, что делает этот подход очень полезным, когда речь идет
о многокомпонентных образцах. Очень часто целевой аналит выходит из колонки одно-
временно с мажорным компонентом. Результирующий масс-спектр оказывается мало-
пригодным для надежной идентификации, а пик на ПИТ-хроматограмме — неприемле-
мым для количественного определения. Пример такого случая представлен на рис. 2.4.
Образец жира серого кита был подвергнут экстракции дихлорметаном с последующей
простенькой очисткой. Жирные кислоты, продукты окисления жиров и холестериновые
производные составляют около 90 % компонентов экстракта, проходящих через хрома-
тографическую колонку. Их пики доминируют на хроматограмме по полному ионному
току, закрывая значительно меньшие пики целевых ксенобиотиков. Обработка ПИТ-
хроматограммы с построением масс-хроматограмм по току характеристических ионов
позволяет выявить пики целевых соединений, например экологически значимых поли-
хлорированных бифенилов. На рис. 2.4 видно, что никаких проблем с измерением пло-
щадей соответствующих пиков и установлением уровней этих соединений нет.
Рис. 2.5 позволяет понять, насколько элегантно ГХ/МС преодолевает еще один не-
достаток ГХ, связанный с количественным определением соединений с близкими вре-
менами удерживания. Эта проблема возникает и при целевом, и при скриниговом ана-
лизе. В качестве примера можно привести результат анализа образца нефтепродуктов.
На рис. 2.5а представлен небольшой фрагмент ПИТ-хроматограммы с основным пиком
с временем выхода 555,262 секунд, а на рис. 2.5б — масс-спектр, зарегистрированный
на его вершине. Пики с m/z 43, 57, 71… обусловлены характеристическими ионами ал-
кильной серии. Однако ион с m/z 154 определенно принадлежит другому соединению.
Следовательно, данный спектр — суперпозиция масс-спектров двух соединений.
ПИТ
326×500
360×500
Время, с
550
2e+006
4e+006
6e+006
8e+006
1e+007
1,2e+007
1,4e+007
1,6e+007
1,8e+007
600 650 700 750 800 850
Рис. 2.4. Фрагмент ПИТ-хроматограммы (оранжевый) образца жира серого кита и масс-
хроматограммы по току ионов с m/z 326 (зеленый), характерных для тетрахлорби-
фенилов, и m/z 360 (голубой), характерных для пентахлорбифенилов
58 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
a
б
в
г
д
Рис. 2.5. ГХ/МС-анализ образца нефтепродуктов. (а) 14-секундный фрагмент ПИТ-
хроматограммы; (б) масс-спектр на вершине хроматографического пика (RT
555,262 с); (в) масс-хроматограммы по току ионов с m/z 154 и m/z 71; (г) масс-
спектр первого компонента (тетрадекан, молекулярный ион с m/z 198 едва заме-
тен) с временем выхода 554,719 с; (д) масс-спектр второго компонента (бифенил)
с временем выхода 555,562 с
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 59
Масс-хроматограммы, построенные по току ионов с m/z 154 и 71 (рис. 2.5в), позволя-
ют увидеть, что времена выхода этих двух соединений очень близки и отличаются менее
чем на секунду (554,719 с и 555,562 с соответственно). Масс-спектры, зарегистрирован-
ные на вершине каждого из этих пиков после вычета фона с обеих сторон, позволяют
идентифицировать эти ингредиенты смеси как тетрадекан и бифенил, причем с высо-
кой степенью сходимости с библиотечными спектрами этих соединений. Площади пи-
ков на масс-хроматограммах дают возможность установить количество каждого из этих
компонентов в образце.
Масс-хроматограммы эффективны для подобных целей, если вершины двух пиков
отстоят не менее чем на 2 сканирования полного спектра. Таким образом, чем выше ско-
рость сканирования (сбора данных) масс-спектрометра, тем выше эффективность раз-
решения накладывающихся хроматографических пиков.
Существует вариант ГХ/МС-анализа, когда записи полного масс-спектра не тре-
буется. В этом случае масс-спектрометр настраивается на регистрацию только одного
или нескольких ионов с заранее выбранными значениями m/z. Этот метод называется
«мониторинг заданных (выбранных) ионов» (МЗИ, SIM) или «масс-фрагментография»
и используется для детектирования и количественного определения целевых аналитов
в сложных образцах (наиболее простой вариант целевого анализа). В этом случае ин-
формация о всех других компонентах образца теряется. Тем не менее, поскольку детек-
тор прибора в этом режиме постоянно измеряет лишь ток заданных ионов, а не скани-
рует несколько сотен различных величин m/z, интегральная чувствительность анализа
может быть повышена примерно на 2 порядка. Масс-фрагментография часто исполь-
зуется в экологических, криминалистических исследованиях, допинг-контроле, т. е.
в тех случаях, когда необходимо детектировать целевые соединения в ультра-следовых
количествах. Наличие пика заданного характеристического иона с известным временем
выхода на масс-фрагментограмме свидетельствует о присутствии данного соединения
Время, с
1e+006
2e+006
3e+006
4e+006
5e+006
6e+006
7e+006
8e+006
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
128
136
154
178
188
202
228
252
276
278
Рис. 2.6. SIM-анализ ПАУ в образце почвы (нафталин — m/z 128; аценафтен — m/z 154;
фенантрен и антрацен — m/z 178; флуорантен и пирен — m/z 202; бенз[a]антра-
цен и хризен — m/z 228; бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен и бенз[a]пирен —
m/z 252; бенз[ghi]перилен и индено[1,2,3-cd]пирен — m/z 276; дибенз[a,h]антра-
цен — m/z 278; пердейтеронафталин — m/z 136 и пердейтерофенантрен — m/z 188
использованы в качестве внутренних стандартов)
60 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
в образце, а площадь пика позволяет провести его количественное определение. Однако,
поскольку вероятность присутствия в сложном образце веществ с близкими временами
выхода и имеющими в спектрах ионы с одинаковыми значениями m/z достаточно высо-
ка, результаты SIM не столь надежны, как результаты, полученные в режиме полного
сканирования спектра. Для повышения надежности используется одновременная реги-
страция нескольких характеристических ионов. Например, стандартные методы Агент-
ства по охране окружающей среды США требуют регистрации трех характеристических
ионов каждого целевого аналита. Аналогичный европейский документ (2002/657/EC)
еще жестче. Он требует четырех идентификационных точек (глава 3). Аналит считается
детектированным, если зарегистрированы все характеристические ионы, причем со-
отношения их пиков соответствуют этим соотношениям в стандартном масс-спектре
данного соединения.
Поскольку время выхода целевых компонентов всегда известно заранее, детектор
масс может переключаться для регистрации ионов с другими величинами m/z, как толь-
ко аналит был зарегистрирован (вышел из колонки). Такой подход позволяет создавать
автоматизированные программы для детектирования методом МЗИ серии аналитов
Время, мин.
Интенсивность Рис. 2.7. SIM по току характеристических для станозолола ионов с
m/z
560, 545 и
143 (
об-
разец мочи) с низким разрешением R = 500 на приборе Agilent 5973 (с разрешения
Э. Вирюса)
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 61
за один ввод пробы в прибор. На рис. 2.6 представлены результаты количественного
масс-фрагментографического определения 14 полициклических ароматических угле-
водородов (ПАУ) в образце почвы. Хотя на рис. 2.6 видны пики, обусловленные неко-
торыми другими компонентами образца, проблемы с идентификацией и количествен-
ным определением ПАУ нет, поскольку их времена выхода точно известны. Количество
целевых соединений в аналогичных автоматизированных программах анализа может
достигать сотен. Если одни и те же целевые аналиты должны быть определены во мно-
гих аналогичных образцах, очень полезным становится применение автосамплера.
В этом случае система ГХ/МС будет проводить последовательные анализы без участия
оператора.
Для улучшения пределов обнаружения и надежности определения исполь-
зуется масс-фрагментография высокого разрешения. На рис. 2.7 видно, что масс-
Рис. 2.8. SIM по току характеристических для станозолола ионов с m/z 560,3650; 545,3415
и 520,3642 (образец мочи) с высоким разрешением R = 10000 на приборе DSF ком-
пании Thermo Scientifi c (с разрешения Э. Вирюса)
Время, мин.
Интенсивност
Станозолол
Станозолол
62 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
хроматограммы по току ионов с m/z 560, 545 и 143, характерных для станозолола (спортив-
ный допинг, запрещенный WADA), едва ли предоставляют какое-либо доказательство
наличия данного соединения в пробе мочи (время выхода 26,95 мин.).
Улучшение качества сигнала в режиме высокого разрешения как для детектирова-
ния, так и для количественного определения, очевидно (рис. 2.8) Это обусловлено тем,
что запись масс-фрагментограммы по току ионов с величиной m/z, измеренной с не-
сколькими десятичными знаками, фактически позволяет детектировать только ионы
с определенным элементным составом. Эта особенность дает возможность существенно
сократить число мешающих ионов. Чтобы избежать проблем, связанных с небольшими
флуктуациями в работе прибора, ионы регистрируются в очень узком массовом диапа-
зоне, например m/z 560,3649—560,3651 (рис. 2.8).
Еще один красивый пример эффективности данного подхода представлен
на рис. 1.10 (глава 1). Он демонстрирует корректное установление уровня 2,3,7,8-тетра-
хлордибензодиоксина в анализируемом образце. МЗИ с высоким разрешением особен-
но полезен при анализе очень сложных матриц, когда требуется обнаружить ультрасле-
довые уровни экотоксикантов.
Еще одним усовершенствованием метода масс-фрагментографии для детектирова-
ния целевых аналитов является использование тандемной масс-спектрометрии с реги-
Рис. 2.9. Мониторинг заданных реакций (МЗР) на примере характеристических процес-
сов фрагментации станозолола (560 → 455, 560 → 545 и 560 → 387) (образец мочи)
на приборе Polaris Q (Thermo Scientifi c) (с разрешения Э. Вирюса)
Относительная интенсивность
Время, мин.
2.3. Скорость сбора данных 63
страцией выбранных процессов фрагментации. Этот метод называется мониторингом
заданных реакций (МЗР, selected reaction monitoring, SRM или multiple reactions monitoring,
MRM). Он заключается в регистрации распада выбранного иона-предшественника
(зачастую молекулярного иона) с образованием известного иона-продукта. Подобные
процессы очень селективны и с учетом времени выхода аналита позволяют получить на-
дежные результаты качественного и количественного анализа даже при работе с самыми
сложными матрицами. В данном случае используется тандемная масс-спектрометрия
или МС/МС, которая будет подробно рассмотрена в главе 4. Рис. 2.9 демонстрирует
эффективность метода МС/МС на примере определения станозолола в том же образце
(сравн. рис. 2.7 и 2.8). В этом случае регистрируются три реакции фрагментации молеку-
лярного иона (m/z 560) с образованием фрагментных ионов с m/z 455, 545 и 387.
Как и МЗИ, МЗР позволяет детектировать большое число соединений за один ввод
образца в прибор. Это достигается последовательным изменением условий регистрации
для определения все новых и новых аналитов и дает возможность создавать автомати-
зированные программы. Так, на рис. 2.10 представлена обобщенная картина результата
определения 700 пестицидов в одном вводе образца в прибор. Результат получен с помо-
щью прибора ЖХ/МС, но сам принцип в этом случае остается тем же.
2.3. Ñêîðîñòü ñáîðà äàííûõ
Скорость сканирования спектров (сбора данных) — еще один очень важный параметр
масс-спектрометра, уже упоминавшийся ранее. В идеале для получения надежных ка-
чественных и количественных результатов каждый хроматографический пик должен
быть охарактеризован 10—15 полными масс-спектрами. На рис. 2.11 представлен любо-
пытный пример катастрофического различия полученной формы хроматографического
пика аналита в зависимости от скорости записи масс-спектра. Поскольку количествен-
ное определение аналита осуществляется при измерении площади хроматографическо-
го пика, понятно, что измереннное с низкой скоростью сбора данных количество до-
декана в анализируемом образце будет абсолютно неправильным (рис. 2.11, красный).
Рис. 2.10. МЗИ для определения 700 пестицидов за один ввод пробы (с разрешения Applied
Biosystems)
Время, мин.
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
2,4e6
2,2e6
2,0e6
1,8e6
1,6e6
1,4e6
1,2e6
1,0e6
8,0e5
6,0e5
4,0e5
2,0e5
0,0
64 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
В случае очень узких хроматографических пиков есть возможность совсем пропустить
важный для анализа ингредиент образца. Напротив, при регистрации 250 спектров в се-
кунду (рис. 2.11) форма пика практически идеальна и приближается к таковой для ана-
логового сигнала.
Рис. 2.11 позволяет обсудить еще один аспект, связанный с качеством масс-спектров.
Низкие скорости сбора данных могут привести не только к неправильному количе-
ственному определению, но и создать проблемы для правильной идентификации со-
единения. В частности, при низкой скорости аналит (додекан) характеризуется только
двумя масс-спектрами (рис. 2.11). Если анализ проводится на сканирующем приборе,
например популярных в экологических исследованиях квадруполях, детектор реги-
стрирует ионы один за одним по возрастанию или убыванию их величин m/z. Если в это
время происходит изменение количества аналита, что справедливо для процесса хро-
матографического элюирования, число образовавшихся ионов будет больше либо для
ионов с низким, либо высоким m/z, в зависимости от работы с нисходящей или восхо-
дящей частью хроматографического пика. Самые качественные спектры регистрируют-
ся на вершине пика. Этот эффект может привести к проблемам поиска в спектральных
базах даннах и, как следствие, ошибкам в идентификации аналита. Для случая, изобра-
женного на рис. 2.11, для скана, стартовавшего в 7,4 с, будет наблюдаться определенная
дискриминация фрагментных ионов с низкой и высокой массой в пользу ионов средней
массы. Скан, стартовавший в 7,5 с, позволит зарегистрировать лишь несколько ионов
с низкой массой при полном отсутствии каких-либо ионов средней и большой массы,
так как вещества уже не будет в источнике ионов. Это — искажение масс-спектра (spectral
skewing).
Следует подчеркнуть, что проблема искажения масс-спектра подобного типа харак-
терна только для сканирующих приборов. Напротив, времяпролетные анализаторы,
в которых происходит одновременный отбор всех ионов в заданном диапазоне m/z, обе-
Рис. 2.11. Форма хроматографического пика додекана шириной 150 мс при скорости сбора
данных 10 и 250 спектров в секунду (с разрешения LECO Corp.)
Додекан
Ширина 150 мс
Время в секундах
10 спектров в секунду 250 спектров в секунду
7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 8,1
2.4. Какие соединения можно анализировать методом ГХ/МС 65
спечивают практически идентичные масс-спектры вдоль всего хроматографического
пика. Рис. 2.12 иллюстрирует это утверждение на примере дихлорбензола.
Очень высокая скорость сбора данных во времяпролетных приборах позволяет ре-
гистрировать несколько сот спектров в секунду, обусловливая высокую точность коли-
чественных определений. Кроме того, все спектры оказываются идентичными и неис-
каженными. Это очень важное преимущество таких анализаторов, благодаря которому
появился метод быстрой хроматографии. Его подробности рассмотрены в главе 6.
Современная масс-спектрометрия является наиболее чувствительным, информа-
тивным и надежным методом идентификации и количественного определения эко-
токсикантов любого типа в образцах объектов окружающей среды любой сложности.
Возможности работать с самыми разными аналитами (от химических элементов до
сложнейших биомолекул) в сложнейших матрицах без предварительного разделения,
действительно, ставят масс-спектрометрию в приоритетное положение по сравнению
с любыми другими методами анализа. Еще одним преимуществом масс-спектрометрии
является возможность получения информации о сотнях и тысячах аналитов в процес-
се единичного анализа одной пробы. При этом результаты масс-спектрометрических
исследований позволяют делать выводы, которые подготавливают административные
решения, влияющие на здоровье населения и экосистем в целом.
Бурное развитие метода в начале XXI века привело к созданию новых приборов,
новых методов ионизации образцов. Появилась возможность работать с минимальной
пробоподготовкой или вовсе без пробоподготовки. Популярным направлением стала
масс-спектрометрия в нормальных условиях, активные работы ведутся по миниатюри-
зации масс-спектрометров. Появление простых и чувствительных портативных масс-
спектрометров, работающих при нормальных условиях, станет прорывом в аналити-
ческой химии. При снижении стоимости таких масс-спектрометров они могут стать
бытовыми приборами.
Данная книга предназначена, в первую очередь, для людей, работающих в смежных
дисциплинах (экология, геология, биология, гидрология, медицина и т. д.). Она состоит
из 21 главы, написанной ведущими масс-спектрометристами из 12 стран мира, которые
постарались в простой форме рассказать о достижениях и потенциальных возможно-
стях метода для решения самых разнообразных экологических проблем. Хотя диапазон
возможностей современной масс-спектрометрии необычайно широк, многие из них
остаются неизвестными непрофессионалам. Поэтому основная цель — продемонстри-
ровать, что самые разные научные задачи, стоящие перед учеными разных специаль-
ностей, могут быть решены масс-спектрометрически.
Оригинальное издание вышло на английском языке. Русскоязычное издание, на
мой взгляд, еще более актуально, поскольку в России и в странах бывшего СССР про-
паганда возможностей масс-спектрометрии крайне необходима. Хотя Всероссийское
масс-спектрометрическое общество (www.vmso.ru) проводит регулярные конференции,
школы, издает журнал, выпустило несколько книг, дополнительная литература, осо-
бенно учебно-научная, очень нужна русскоязычному научному сообществу.
Я надеюсь, читатели (студенты, аспиранты, научные сотрудники) найдут в этом из-
дании много интересной и полезной информации, а масс-спектрометрия станет для них
неотъемлемым методом исследований.
А. Т. Лебедев
Если проблему нельзя решить с помощью масс-спектрометрии,
возможно, ее и не надо решать.
Фред МакЛафферти
Красота спасет мир.
Федор Достоевский
Введение
Делая в последнее время доклады по разным аспектам масс-спектрометрии на кон-
ференциях химиков, биологов, токсикологов, экологов, медиков в самых разных
странах, я обнаружил, что большинство исследователей не представляют уникаль-
ных возможностей этого метода даже в плане решения своих научных задач. Читая
лекции аспирантам МГУ имени М. В. Ломоносова, я также обратил внимание, что
молодые ученые относятся к масс-спектрометрии как к весьма сложному аналити-
ческому методу, предпочитая использовать для решения задач альтернативные под-
ходы: ЯМР, ИК-, УФ-спектроскопию. Так родилась идея написания этой книги, по-
скольку эффективность, надежность, простота и широта применимости современной
масс-спектрометрии поистине впечатляющи. Помимо классических наук (физика,
химия, биология) масс-спектрометрия чрезвычайно успешно используется в медици-
не, космических исследованиях, археологии, антропологии, антитеррористической
деятельности, экспертизе предметов искусства, экологии, допинг-контроле, метроло-
гии, ядерной физике и т. д. Благодаря масс-спектрометрии недавно родились новые
дисциплины: петролеомика, гуминомика, метабономика, протеомика. Фактиче-
ски трудно назвать раздел науки, в которой нельзя было бы эффективно применить
масс-спектрометрию.
Современная масс-спектрометрия — наиболее чувствительный, быстрый и ин-
формативный аналитический метод. Ей доступны любые аналиты: от химических эле-
ментов до сложнейших биологических молекул (белки, сахара, нуклеиновые кислоты).
Качественный и количественный анализ индивидуальных компонентов сверхсложных
смесей, состоящих из многих тысяч ингредиентов, может осуществляться быстро и без
какого-либо предварительного разделения. Вы можете отобрать пробу воды из реки,
лужи, бутылки и в течение пары часов проверить наличие в ней сотен индивидуаль-
ных веществ. Любое значимое с точки зрения экологии соединение может быть надежно
определено масс-спектрометрически. Если вы не нашли соответствующей готовой ме-
тодики в литературе, это означает лишь то, что это соединение до этих пор не интересо-
вало масс-спектрометристов.
Масс-спектрометрия обладает непревзойденной чувствительностью. Метод опе-
рирует фемто-, зепто- (10—15—10—21) молярными уровнями аналитов в образце. Если
принять во внимание число Авогадро (6,022 1023), становится понятно, что масс-
спектрометрия приближается к абсолютному теоретическому пределу анализа. Клас-
сические, не разгадываемые без волшебства задачи уровня нахождения ржаного зер-
нышка в мешке пшеницы или иголки в стоге сена могут быть легко решены с помощью
масс-спектрометрии. На самом деле, когда речь идет о возможности детектирования со-
единения на уровне 10—18, это значительно «круче», чем обнаружение одной-единствен-
ной иголки в миллионе стогов сена.
Разнообразие типов масс-спектрометров очень велико. Различные задачи ре-
ализуются с помощью разных детекторов, источников ионов и методов иониза-
ции. В частности, различие в размерах может быть прекрасно проиллюстрировано
рис. 1а,б. Масс-спектрометр Mini 11.5 — хороший представитель переносных при-
боров (рис. 1б), а KATRIN (рис. 1a) — самый большой на сегодняшний день прибор,
созданный для проведения сверхтонких измерений масс, например измерения массы
нейтрино (Kluge, 2010).
Рис. 1. a — Транспортирование масс-спектрометра через деревню Леопольдсхафен в ис-
следовательский центр Карлсруэ (с разрешения EJMS); б — Грэм Кукс выполня-
ет измерения с помощью портативного масс-спектрометра Mini 11.5. (Фото Jon
Dagleish)
a
Теория метода достаточно проста, также как и его основные применения. Фактиче-
ски уже выпускник школы может регистрировать спектры и работать с ними, особенно
когда речь идет о серийных образцах или поиске целевых аналитов.
Основная идея данной книги — рассказать о возможностях масс-спектрометрии
в решении экологических и родственных задач с демонстрацией того, как элегантно
могут быть разрешены весьма сложные вопросы. Книга дает ключ к возможному реше-
нию проблем, стоящих перед биологом, геологом, врачом, экологом, химиком, нефте-
химиком, криминалистом и т. д. Студенты, как, впрочем, и профессиональные масс-
спектрометристы, также найдут в ней достаточно много весьма полезных сведений,
которые расширят их горизонты в этой области, поскольку целый ряд современных ме-
тодов (петролеомика, имиджинг, изотопная и атмосферная масс-спектрометрия) описа-
ны простыми словами в форме лекции для начинающих. Широкий круг реальных при-
меров решенных задач красиво подкрепляет теорию различных методов исследования.
Зачастую результат эксперимента может быть удивительным и неочевидным для не-
посвященных. Например, измерив соотношение природных изотопов углерода, кисло-
рода и азота в образце, можно установить район производства наркотиков, виновника
разлива нефти, подлинность напитка или даже различить по остаткам костей древних
европейцев и американцев.
Помимо указанных превосходных технических характеристик масс-спектро-
метрия — это очень красивый метод. Я надеюсь, читатели смогут разделить со мной
это чувство, ознакомившись с богатым иллюстративным материалом книги, демон-
стрирующим результаты реальных исследований. Именно поэтому я использовал ци-
тату из «Идиота» Ф. М. Достоевского в качестве одного из эпиграфов к книге. Второй
эпиграф — высказывание «отца-основателя» органической масс-спектрометрии Фреда
МакЛафферти. Безусловно, будучи шутливым, оно, тем не менее, прекрасно отражает
возможности метода и диапазон его применимости.
Каждая из 21 главы повествует об отдельном направлении масс-спектрометрии
объектов окружающей среды. Главы 1—5 посвящены основам масс-спектрометрии.
Они раскрывают наиболее распространенные общие приемы. Материал этих глав по-
зволит легче схватывать идеи последующих разделов книги.
Основные принципы масс-спектрометрии коротко изложены в главе 1. Это форма
представления масс-спектров, системы ввода, анализаторы масс и методы ионизации,
играющие основную роль в экологической масс-спектрометрии.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия (ГХ/МС) остается на сегодняшний
день наиболее эффективным методом качественного и количественного определения
наиболее распространенных загрязняющих веществ: фенолов, полициклических аро-
матических углеводородов, полихлорированных бифенилов, дибензодиоксинов и ди-
бензофуранов и т. д. Важнейшие аспекты этого комбинированного метода представлены
в главе 2.
С момента успешной стыковки масс-спектрометра с жидкостным хроматогра-
фом метод ЖХ/МС становится все более и более востребованным, поскольку огром-
ное число полярных и термолабильных соединений вошли в рабочий диапазон масс-
спектрометрии. Глава 3 повествует об основных деталях, особенностях и преимуществах
метода ЖХ/МС.
26 Введение
Курс на повышение чувствительности и надежности анализов привел ко все более
частому приложению тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) к проблемам окружаю-
щей среды. Ранее этот метод использовался в основном в фундаментальных исследова-
ниях. Экологические приложения тандемной масс-спектрометрии рассмотрены в гла-
ве 4. Этот метод надежнее, чем обычная масс-спектрометрия. Кроме того, он позволяет
создавать различные автоматизированные программы для эффективного качественно-
го и количественного определения сотен экотоксикантов и(или) биомаркеров за один
ввод пробы. Метод МС/МС незаменим, когда речь идет об установлении структуры со-
единений в нецелевых анализах.
Поскольку за регистрацией всегда следует какая-либо процедура обработки масс-
спектра, эта часть эксперимента имеет особое значение. Сейчас в большинстве случаев
работы с экотоксикантами нет необходимости проводить установление структуры ана-
лита вручную. Представительные базы данных и постоянно совершенствующееся про-
граммное обеспечение — неотъемлемая часть современных масс-спектрометров. Имен-
но таким базам данных и компьютерным программам посвящена глава 5.
Следующий блок (главы 6—9) представляет инновации XXI века. Усовершенство-
ванные ГХ/МС-методы: ГХ/ГХ/МС и быстрая ГХ/МС (глава 6) расширили возможно-
сти метода. Первый из них делает возможным получение информации о тысячах ин-
дивидуальных компонентов сложнейших смесей за однократный ввод пробы, второй
позволяет сократить время анализа в 5—10 раз. Недавно внедренный интерфейс сверх-
звуковых молекулярных пучков продемонстрировал новые впечатляющие возможности
классического метода электронной ионизации и позволил расшить круг соединений,
которые можно эффективно анализировать ГХ/МС.
Долгие годы основным недостатком масс-спектрометрии считалась необходимость
пробоподготовки, зачастую весьма трудоемкой. Начало XXI века ознаменовалось рево-
люционными подвижками в преодолении этой трудности. Сегодня предложены более
40 масс-спектрометрических методов с ионизацией в нормальных (природных) услови-
ях с применением плазмы или распыления. Глава 7 посвящена наиболее эффективным
среди них: ДЭРИ, ПАРВ, EASY, ЭЭРИ и т. д. Во многих случаях процедура пробоподго-
товки может быть полностью устранена.
Исторически первый метод ионизации в нормальных условиях был назван десорб-
ционной электрораспылительной ионизацией (ДЭРИ, DESI). Он уникален по скорости,
кругу анализируемых молекул и области применения, включая, например, онлайн-де-
тектирование биомаркеров во время хирургических операций. Глава 8 посвящена воз-
можностям этой замечательной техники.
Другим недостатком масс-спектрометрии прошлых лет был размер приборов. Сей-
час производится много мощных и надежных настольных масс-спектрометров. Тем не
менее борьба за сокращение размеров не прекращается. Например, размер играет едва
ли не ключевую роль в создании приборов для размещения на космических кораблях.
В последние годы созданы портативные приборы (до нескольких килограммов), спо-
собные решать весьма сложные задачи. Один из авторов главы 9, посвященной мини-
атюризации, Грэм Кукс отметил в своей лекции на недавней международной масс-
спектрометрической конференции в Бремене (Cooks et al., 2010), что будет правильно,
если в недалеком будущем обычный человек сможет использовать масс-спектрометр
для замеров на «кухне», например для проверки качества пищевых продуктов, простых
экологических тестов или контроля здоровья.
С главы 10 начинается блок, посвященный наиболее значимым типам загрязнений
окружающей среды. Метод индуктивно связанной плазмы с масс-спектрометрическим
детектированием (ИСП МС) является наиболее быстрым и информативным для каче-
ственного и количественного определения химических элементов в пробах. Менее ми-
нуты достаточно для того, чтобы получить надежную информацию о наличии и уровнях
большинства химических элементов таблицы Д. И. Менделеева. Поскольку диапазон
линейности метода достигает 12 порядков, за один ввод пробы можно получить инфор-
мацию и о макроэлементах, и об элементах, присутствующих в ультраследовых количе-
ствах. Этому замечательному методу посвящена глава 10.
Достаточно большая группа химических соединений в объектах окружающей сре-
ды объединяется термином «летучие». Это связано исключительно с низкой величиной
давления их паров. В эту группу входят самые разнообразные органические вещества.
Опасность соединений этой группы для человека и экосистемы в целом лежит в широ-
ком диапазоне, а их присутствие должно контролироваться в атмосфере, воде, других
образцах и продуктах. Масс-спектрометрическому анализу таких соединений, которые
можно разделить на антропогенные и биогенные, посвящена глава 11.
Побочные продукты дезинфекции, возникающие при подготовке питьевой воды,
а также при эксплуатации плавательных бассейнов и утилизации отходов, представля-
ют собой серьезную экологическую проблему, нанося существенный вред здоровью че-
ловека. Не существует лучшего метода качественного и количественного определения
этих соединений, чем масс-спектрометрия. Об этом повествуется в главе 12.
Глава 13 посвящена опасным современным экотоксикантам: фармацевтическим
препаратам, наночастицам, металлоорганическим соединениям. Набор этих ксеноби-
отиков неуклонно возрастает год от года с появлением новых продуктов, часто не самых
экологичных. И вновь следует сказать, что для их детектирования не существует более
эффективного метода, чем масс-спектрометрия.
Пестициды всегда считались приоритетными загрязняющими веществами. Раз-
личные варианты ГХ/МС или ЖХ/МС показали свою эффективность в определении
этих экотоксикантов в объектах окружающей среды. Тем не менее в связи с широчай-
шим разнообразием структур и наличием очень жестких требований по чувствитель-
ности и надежности определение пестицидов продвинутыми хроматомасс-спектроме-
трическими методами представлено в главе 14.
Масс-спектрометрия является единственным аналитическим методом, способным
надежно определять суперэкотоксиканты: полихлорированные дибензодиоксины и ди-
бензофураны. Благодаря своей высочайшей токсичности и стабильности эти ксенобио-
тики должны контролироваться на постоянной основе. Более 30 лет им уделяется особое
внимание. Ежегодный представительный научный форум посвящен исключительно
этим соединениям. Детали масс-спектрометрического определения этих веществ пред-
ставлены в главе 15.
Загрязнение атмосферы является важным аспектом химии окружающей среды.
Глава 16 названа «Масс-спектрометрия атмосферных аэрозолей». Уникальные резуль-
таты, включая анализ единичных частиц, наглядно демонстрируют преимущество
масс-спектрометрии перед другими аналитическими методами в подобных анализах.
28 Введение
Что происходит, когда загрязняющее вещество попадает в организм человека? Воз-
можность масс-спектрометрического изучения взаимодействия экотоксикантов с ДНК
является предметом главы 17. Чрезвычайная сложность задачи требует высочайшей чув-
ствительности метода и возможности работать как с целевыми, так и нецелевыми ад-
дуктами ксенобиотиков с биомолекулами.
В четырех последних главах рассматриваются масс-спектрометрические подходы,
которые привели к созданию новых направлений научных исследований. В частности,
появилась возможность прямого анализа состава самых сложных смесей природных
соединений. Сверхвысокая разрешающая способность масс-спектрометрии с преоб-
разованием Фурье позволяет идентифицировать и оценить уровни тысяч индивиду-
альных родственных природных соединений без какого-либо предварительного разде-
ления. Главы 18 и 19 знакомят читателя с новейшими дисциплинами: петролеомикой
и гуминомикой.
Масс-спектрометрия изображений (имиджинг) — еще одно уникальное научное
направление, возникшее в самом конце XX века. Этот удивительный метод позволяет
детектировать и картировать распределение тысяч самых разнообразных соединений
в органах и тканях животных и растений, в минералах, овощах и фруктах, произведе-
ниях искусства. Стало возможным устанавливать распределение экотоксиканта, лекар-
ственного препарата или его метаболитов в целом организме лабораторного животного
или определять, какие белки и где конкретно генерируются организмом в качестве от-
клика на проникновение чужеродного вещества в организм. Эти аспекты рассматрива-
ются в главе 20.
Глава 21 посвящена изотопной масс-спектрометрии — красивому методу, базирую-
щемуся на существовании природных изотопов химических элементов. Соотношение
этих изотопов зависит от происхождения образца. Измерив отношения D/H или 13C/12C,
можно делать выводы о подлинности произведений искусства, определять, на каком за-
воде синтезировано данное вещество, устанавливать, природным или синтетическим
является полезный ингредиент (аскорбиновая или лимонная кислота) в соках и напит-
ках. Этот мощный метод полезен в криминалистике (анализ наркотиков) и в допинг-
контроле (различие между эндогенными и синтетическими стероидами).
Таким образом, я надеюсь, что читатель не только обнаружит в этой книге мно-
го полезной для своей будущей работы информации, но и просто получит удоволь-
ствие, знакомясь с фантастическими возможностями современной экологической
масс-спектрометрии.
Литература
[1]. Cooks R. G., Ifa D. R., Sharma G., Tadjimukhamedov F. Kh., Ouyang Zh. (2010). «Persrectives
and retrospectives in mass spectrometry: one view». European Journal of Mass Spectrometry,
16, 3: 283—300.
[2]. Kluge H.-Jurgen (2010). «High accuracy mass spectrometry for fundamental studies». European
Journal of Mass Spectrometry, 16, 3: 269—282
Глава 1
Основные принципы масс-спектрометрии
Альберт Лебедев
1.1.Базовые аспекты
Для того чтобы получить масс-спектр, необходимо ввести образец в ионный ис-
точник масс-спектрометра, ионизировать молекулы (получить положительные или
отрицательные ионы), разделить эти ионы по величинам m/z (отношение их массы
к заряду) и установить число ионов с каждым m/z. Компьютер управляет всеми про-
цессами и проводит обработку данных. Принципиальная схема масс-спектрометра
представлена на рис. 1.1. Дополнительные узлы могут добавляться для решения более
сложных задач.
Таким образом, масс-спектрометрия является аналитическим методом, оперирую-
щим заряженными атомами и молекулами химических соединений. Принципиальным
моментом является ионизация молекул образца или перевод ионов, уже имеющихся
в растворе или в твердой матрице, в газовую фазу. Отношение массы к заряду (m/z) ио-
нов может быть точно измерено, что позволяет установить молекулярные массы ингре-
диентов образца. Можно также инициировать фрагментацию исходных молекулярных
ионов с получением набора фрагментных ионов. Эти ионы представляют собой наибо-
лее стабильные фрагменты исходной молекулы и позволяют делать выводы о ее струк-
туре. Интенсивности и величины m/z молекулярного и фрагментных ионов на графике
по осям y и x соответственно называются масс-спектром. Обычно график нормализу-
ется на 100 % по наиболее интенсивному пику в спектре. Масс-спектр — уникальная
характеристика химического вещества. Для работы с масс-спектром необходимы толь-
ко атомные массы химических элементов, точнее природных изотопов этих элементов.
Поскольку атомные и молекулярные массы — простые и широко используемые характе-
ристики, масс-спектры значительно проще для интерпретации, чем ЯМР, ИК, УФ, ЭПР
и другие типы спектров.
ввод ионизация разделение масс-
спектр
детекти-
рование
обработка
данных
компьютер
Рис. 1.1. Принципиальная схема масс-спектрометра
Существуют определенные правила, определяющие направления фрагментации
химических соединений в масс-спектрометре. Поэтому на основе масс-спектра можно
установить молекулярную массу, элементный состав, присутствие определенных функ-
циональных групп, а зачастую и полную структуру аналита. Во многих случаях уже но-
вичок может успешно решать задачи даже без использования спектральных баз данных
и специального программного обеспечения.
Спектр электронной ионизации бензоилхлорида в классической графической фор-
ме представлен на рис. 1.2. Абсцисса соответствует массам ионов (точнее величинам
m/z), а ордината — относительным интенсивностям пиков этих ионов. Для новичка
проще принимать во внимание только наиболее интенсивные пики в спектре. Менее
интенсивные пики, следующие сразу за интенсивными, обусловлены наличием в со-
ставе молекул образца природных стабильных изотопов. Они играют важную роль при
установлении структуры и далее будут обсуждаться подробнее.
Пик иона с самой большой массой соответствует молекулярному иону анали-
та. В спектре на рис. 1.2 — это 140. Следует также обратить внимание на ион с m/z 142,
интенсивность пика которого составляет 1/3 от интенсивности пика иона с m/z 140.
Эти два пика обусловлены существованием двух природных изотопов хлора: 35Cl и 37Cl.
Их природное соотношение ~ 3 : 1. Первичный фрагментный ион с m/z 105 образует-
ся при потере 35 единиц массы из молекулярного иона с m/z 140 или 37 единиц мас-
27 38 62 85 111 122 140
m z /
105
20
9000
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
77
51
Рис. 1.2. Спектр электронной ионизации бензоилхлорида (NIST 27422)
m z /
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
I/%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 237
295
266
208
324
Рис. 1.3. Спектр электронной ионизации тетраэтилсвинца (NIST45993)
1.1. Базовые аспекты 31
сы из изотопного иона с m/z 142. Оба выброса обусловлены атомами хлора (35Cl и 37Cl).
Первичный ион с m/z 105 теряет молекулу CO с образованием вторичного фрагментного
иона (m/z 77), который, однако, может образоваться и напрямую из молекулярного иона
при разрыве связи С-С. Даже человек с минимальным опытом работы по расшифровке
масс-спектров знает, что ион с m/z 77 может считаться визитной карточкой фенильной
группы (C6H5
+). Это стабильный в газовой фазе ион, который указывает на ароматиче-
скую природу аналита. Продукт следующей стадии фрагментации, ион с m/z 51, образу-
ется при отщеплении из фенил-катиона молекулы ацетилена (C2H2). Измерение точной
массы (см. ниже) может надежно подтвердить сделанные выводы, поскольку дает воз-
можность установить элементный состав всех упомянутых выше ионов.
Существование природных изотопов химических элементов облегчает установле-
ние структуры и позволяет определить элементный состав анализируемого соединения
по его масс-спектру. На рис. 1.3 представлен хороший пример простоты и информатив-
ности масс-спектра, демонстрирующий важность учета изотопных пиков. Три основных
природных изотопа свинца имеют атомные массы 206, 207 и 208 единиц с распростра-
ненностью 25,15 %, 21,11 % и 52,38 % (грубо 1 : 1 : 2) соответственно. Тетраэтилсвинец —
топливная добавка. Будучи хорошо известным экотоксикантом, он запрещен в на-
m z /
9000
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
9000
9500
8500
7500
6500
5500
4500
3500
2500
1500
500
Интенсивность
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
40 60
31
81 112
270
191
61
74
92
110
128
150
185
220
292
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
m z /
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
a
б
Рис. 1.4. Масс-спектры электронной ионизации тетрахлорбифенила NIST 169679 (верх)
и трибромфосфина NIST 150824 (низ)
32 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
стоящее время в подавляющем большинстве стран. В области высоких масс, начиная
с m/z 324, в спектре отчетливо видны 5 триплетов (иногда искаженные) с соотношением
интенсивностей 1 : 1 : 2 и отстоящих друг от друга на 29 единиц массы. Эти группы ионов
обусловлены последовательными выбросами четырех этильных групп из молекулярно-
го иона Pb(C2H5)4. Детали работы с изотопными пиками представлены в (Lebedev, 2009;
Лебедев, 2003).
Хлор и бром часто присутствуют в молекулах приоритетных загрязняющих веществ
(пестициды, фармацевтические препараты, побочные продукты дезинфекции, анти-
пирены). Благодаря уникальному соотношению природных изотопов (35Cl : 37Cl ~ 3 : 1;
79Br : 81Br ~ 1 : 1) присутствие этих элементов в анализируемых образцах может быть мо-
ментально установлено по масс-спектру. Для этого надо обращать внимание на мульти-
плеты, пики в которых отстоят друг от друга на две единицы массы. Число атомов этих
элементов в молекуле также однозначно определяется по изотопной картинке. Так, два
атома хлора в молекуле дадут изотопный кластер (триплет) с относительными интенсив-
ностями (3 : 1)2 = 9 : 6 : 1; три атома — (3 : 1)3 = 27 : 27 : 9 : 1 и т. д. Вид мультиплетов ионов в за-
висимости от числа атомов хлора и брома в молекуле представлен на рис. 12.9 в главе 12.
Примеры масс-спектров экологически важных тетрахлорбифенила и трибромфосфина
представлены на рис. 1.4. Последовательные выбросы атомов хлора и брома с образо-
ванием характеристических изотопных кластеров ионов позволяют легко идентифи-
цировать эти токсиканты. Спектр трибромфосфина особенно прост, поскольку после-
довательное элиминирование трех атомов брома приводит к иону атомарного фосфора
с m/z 31. При этом дублет с m/z 79 и 81 определяется двумя стабильными изотопами брома.
1.2. Ввод образца
Любой масс-спектрометрический эксперимент начинается с ввода образца в прибор.
На этой стадии наиболее серьезная проблема связана с тем, что большинство приборов
функционирует в условиях глубокого вакуума (10–5—10–6 торр). Существует несколько
подходов: прямой ввод, ввод через полупроницаемую мембрану, интерфейсы с много-
численными хроматографами (ГХ, ВЭЖХ, СКФХ, КЭ) и даже самостоятельное натека-
ние молекул или ионов из атмосферы в прибор, работающий в условиях пониженного
давления. Последний вариант будет детально рассматриваться в последующих главах,
посвященных миниатюризации и современным методам анализа без пробоподготовки
(главы 7—9).
В случае прямого ввода жидкий или твердый образец направляется в ион-
ный источник через вакуумный шлюз. Поскольку обычное давление в источнике
10–5—10–6 мм рт. ст., а образец может быть нагрет до 400 °C и более, значительное число
органических соединений может быть переведено в газовую фазу и проанализировано.
Однако, если образец представляет собой смесь соединений с близкими летучестями,
зарегистрированный масс-спектр будет представлять собой суперпозицию спектров
компонентов. Этот факт может существенно усложнить процесс идентификации, при-
чем как компьютеризованный, так и производимый вручную.
Полупроницаемые мембраны могут с успехом применяться в экологическом мо-
ниторинге. Например, пусть вода протекает по трубке из полимерного материала.
При этом липофильные соединения могут адсорбироваться на поверхности такого ма-
териала, просачиваясь через тонкие стенки. С наружной стороны они попадают в поток
инертного газа, доставляющего их непосредственно в ионный источник, где и проис-
ходит их детектирование. Подобные устройства успешно используются в онлайн-ре-
жиме для определения конкретных соединений в реках, промышленных сбросах и т. д.
(глава 9). Аналогичные системы используются для детектирования целевых соединений
в биологических жидкостях. К сожалению, метод не универсален и должен несколько
модифицироваться для каждого нового аналита. Вариант мембранного ввода представ-
лен на рис. 1.5.
Наиболее популярными являются системы ввода в виде различных интерфей-
сов между блоком разделения (хроматографы) и масс-спектрометром. Несколько глав
(2, 3, 6) посвящены подробному изложению вариантов такого комбинированного
метода — хроматомасс-спектрометрии.
1.3. Ионизация
Масс-спектрометрия регистрирует исключительно заряженные частицы. Ни молеку-
лы, ни радикалы не могут быть исследованы в своей исходной нейтральной форме. Сле-
довательно, молекулы образца должны быть ионизированы. Альтернативно ионы целе-
вого вещества, уже существующие в конденсированной фазе, могут быть каким-либо
образом переведены в газовую фазу. За столетнюю историю масс-спектрометрии описа-
но несколько десятков методов ионизации, причем следует отметить, что значительное
число новых атмосферных методов были предложены совсем недавно, уже в XXI веке.
Частота использования того или иного метода с годами изменяется. Одни из них про-
должают играть важную роль в современных исследованиях, другие уже прошли свой
«золотой период» и заменены более эффективными.
Все существующие методы могут быть грубо разделены на две группы: «мягкие»
и «жесткие». Это разделение основано на величине избытка внутренней энергии в об-
разующемся молекулярном ионе. Если эта величина мала, фрагментация незначи-
тельна и ион регистрируется как молекулярный. Такой процесс называется «мягкой
ионизацией». Определенный избыток внутренней энергии запускает процесс разрыва
конкретных химических связей в исходном молекулярном ионе, приводя к появлению
различных фрагментных ионов. Иногда молекулярный ион вообще не удается зареги-
Источник ионов
Мембрана
Выход
He
Вход
Рис. 1.5. Вариант мембранного ввода с положением мембраны вне источника ионов
34 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
стрировать. Подобный процесс называется «жесткой» ионизацией. Оба варианта по-
лезны. Первый дает информацию о молекулярной массе соединения и его элементном
составе (масс-спектрометрия высокого разрешения), второй позволяет получить струк-
турную информацию благодаря массам фрагментных ионов.
В этой главе будут рассмотрены только наиболее значимые для экологической масс-
спектрометрии методы ионизации. Несколько новых методов описаны в главах 7 и 8.
Для дополнительной информации может быть рекомендована книга (Westman-Brinkmalm
and Brinkmalm, 2009) и литература, процитированная в ней.
1.3.1. Электронная ионизация
Электронная ионизация (традиционно называвшаяся «электронным ударом»), пред-
ложенная Демпстером еще в 1921 году (Dempster, 1921), исторически была первым и до
сих пор остается одним из наиболее востребованных методов ионизации. Она особен-
но важна для масс-спектрометрии образцов объектов окружающей среды. В процессе
электронной ионизации (ИЭ) газообразные молекулы образца должны оказаться в ион-
ном источнике, функционирующем в условиях высокого вакуума (10–5—10–6 мм рт. ст.).
Испускаемые катодом электроны, пролетая через ионный источник к противоэлектро-
ду, взаимодействуют с этими молекулами. В результате собственные электроны молекул
переходят на более высокие орбитали или совсем покидают молекулу с образованием
ионов. Процесс может быть представлен следующим уравнением:
M + ē = M+• + 2 ē. (1.1)
Теряя электрон, молекула превращается в катион-радикал. Более 95 % образую-
щихся ионов однозарядные, хотя образуются двух- и даже многозарядные ионы. Их ко-
личество зависит от природы молекул образца. Стандартная энергия ионизирующих
электронов — 70 эВ, что близко к максимуму сечения ионизации для большинства ор-
ганических молекул. Внутренняя энергия образующихся молекулярных ионов лежит
в диапазоне от 0 до 20 эВ, приводя к интенсивной фрагментации. В условиях высоко-
го вакуума отсутствуют ионно-молекулярные взаимодействия, т. е. перераспределение
энергии между частицами за счет их столкновений отсутствует. В результате образо-
вавшиеся молекулярные ионы ведут себя далее исключительно в зависимости от при-
обретенной в процессе ионизации внутренней энергии. Определенный избыток этой
энергии запускает соответствующий процесс фрагментации. Поскольку статистиче-
ски в результате ионизации образуются миллиарды и триллионы молекулярных ио-
нов с очень широким диапазоном внутренней энергии, активируются все возможные
пути фрагментации. Поэтому спектры электронной ионизации предоставляют богатую
структурную информацию и характеризуются высокой воспроизводимостью независи-
мо от типа масс-спектрометра. Последняя особенность позволила создать и эффектив-
но использовать библиотеки масс-спектров (глава 5).
Электронная ионизация — это универсальный метод, позволяющий исследовать
разные классы химических соединений. Однако у него есть существенный недостаток,
связанный с необходимостью перевода молекул образца в газовую фазу. Именно поэто-
му метод непригоден для полярных, термолабильных и тяжелых молекул. Тем не менее
электронная ионизация прекрасно справляется с анализом подавляющего большин-
ства экологически значимых соединений в самых разных матрицах.
Хотя в процессе ионизации электронами образуются и отрицательные ионы, их вы-
ходы существенно ниже, что лимитирует использование этого режима на практике.
1.3.2. Химическая ионизация
В 1966 г. Мансон и Филд описали «мягкий» метод ионизации (Munson and Field, 1966),
названный химической ионизацией (ХИ, chemical ionization, CI). Поскольку внутрен-
няя энергия образующихся в результате ХИ ионов обычно ниже 5 эВ, фрагментация
практически отсутствует. Иногда в спектре наблюдается исключительно пик молеку-
лярного иона. Наиболее полное описание процессов ХИ можно найти в книге А. Гарри-
сона (Harrison, 1992).
Основное различие между ИЭ и ХИ связано со значительно более высоким давле-
нием в источнике (~1 мм рт. ст.) во втором случае. Это давление достигается введением
так называемого газа-реагента, в качестве которого можно использовать практически
любое вещество (воду, аммиак, метан, бензол, гелий, этилендиамин и т. д.). Взаимодей-
ствие молекул газа-реагента с электронами высокой энергии (200—500 эВ) приводит
к ионизации. Благодаря высокому давлению образующиеся молекулярные ионы вза-
имодействуют с нейтральными молекулами. В результате самых разнообразных ион-
но-молекулярных реакций создается газовая плазма, существующая в динамическом
равновесии. Наиболее распространенные и реакционноспособные ионы в этой плазме
называются ионами-реагентами. Это могут быть молекулярные, фрагментные ионы
или ионы — продукты реакций исходных молекул газа-реагента. Уравнения (1.2) дают
представление о некоторых основных процессах в случае химической ионизации мета-
ном. Два иона (CH5
+ — 44 % и C2H5
+ — 30 %) являются доминирующими ионами-реаген-
тами в образующейся плазме.
CH4 → CH4
+•, CH3
+, CH2
+• …
CH4
+• + CH4 → CH5
+ + CH3
•
CH3
+ + CH4 → C2H5
+ + H2 (1.2)
CH2
+• + CH4 → C2H3
+ + H2 + H
C2H3
+ + CH4 → C3H5
+ + H2
Когда молекула образца вводится в ионный источник, она взаимодействует с ио-
нами-реагентами. Возможны несколько типов реакций. Наиболее значимым является
протонирование (перенос протона). Если сродство к протону у аналита M выше, чем
у газа-реагента B (например метана в случае CH5
+), протекает следующая реакция:
М + ВН+ → MH+ + B. (1.3)
Необходимо подчеркнуть два момента. Во-первых, протонирование приводит
к возникновению четноэлектронных катионов (протонированных молекул), кото-
рые значительно стабильнее катион-радикалов, образующихся в условиях ионизации
электронами. Во-вторых, избыток внутренней энергии MH+ может быть легко вычислен
по уравнению
E = СП(M) – СП(B), (1.4),
где СП — сродство к протону M и B соответственно.
36 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
Таким образом могут быть генерированы протонированные молекулы аналита с из-
вестной внутренней энергией.
Помимо протонирования возможны три других важных процесса ионизации.
Перенос заряда. Если молекула газа-реагента не имеет водородных атомов (напри-
мер He), образуются катион-радикалы M+• аналита.
М + X+• → M+• + X (1.5)
В отличие от ИЭ их внутренняя энергия может быть легко рассчитана на основе зна-
чений энергии ионизации (ЭИ) аналита и энергии рекомбинации (ЭР) газа-реагента.
Е = ЭР(Х+•) – ЭИ(М) (1.6)
Электрофильное присоединение. Если сродство к протону молекулы аналита недоста-
точно велико, она может сформировать с ионом-реагентом стабильный комплекс.
М + X+ → MX+ (1.7)
Например, пики ионов [M + NH4]+ и [M + NO]+ весьма интенсивны в условиях ХИ
аммиаком и окисью азота соответственно.
Отрыв аниона. Такой процесс протекает при взаимодействии ионов-реагентов пере-
носа протона с аналитами с низким СП.
АВ + Х+ → AX + B+ (1.8)
Наиболее распространенный пример — это образование ионов [M – H]+ в условиях
химической ионизации алифатических углеводородов метаном.
В отличие от ИЭ в условиях ХИ образование отрицательных ионов может быть
весьма выраженным. Четыре основных процесса образования отрицательных ионов
аналита во многом напоминают процессы образования положительных ионов: перенос
протона (депротонирование), перенос заряда, нуклеофильное присоединение и нукле-
офильное замещение (Лебедев, 2003).
Химическая ионизация отрицательных ионов (ХИОИ, negative ion chemical ionization,
NICI) — это эффективный метод анализа соединений с высоким сродством к элек-
трону. В этом случае выигрыш в чувствительности по сравнению с режимом положи-
тельных ионов может быть весьма существенным. Хорошим примером использования
ХИОИ в экологических исследованиях является качественный и количественный ана-
лиз полихлорированных соединений (глава 15).
Недостатками химической ионизации являются необходимость перевода образца
в газовую фазу, слабо выраженная фрагментация и быстрое загрязнение источника ио-
нов. Тем не менее комбинация ХИ и ИЭ может быть очень успешной, поскольку первая
дает возможность зарегистрировать молекулярный ион, а вторая предоставляет исчер-
пывающую структурную информацию.
1.3.3. Полевая ионизация
Еще одним популярным «мягким» методом является полевая ионизация (ПИ, fi eld ionization,
FI). Само явление было открыто Е. Мюллером в 1951 году. Он создал полевой
ионный микроскоп, наблюдая за появлением катионов вблизи металлической поверх-
ности в сильном электростатическом поле (Muller, 1951). Через несколько лет источ-
1.3. Ионизация 37
ник ПИ был использован в масс-спектрометре (Inghram and Gomer, 1954). Тем не менее
успешное внедрение ПИ в систему ГХ/МС произошло только 20 лет спустя (Beckey, 1969;
Damico and Barron, 1971). Метод основан на эффекте туннелирования электрона. Ио-
низация происходит, когда молекула образца в газовой фазе оказывается вблизи эмит-
тера, к которому приложен очень высокий потенциал (8—10 кВ). В качестве эмиттера
обычно используются острые металлические поверхности (лезвие бритвы, острие иглы)
или острые иголочки, образующиеся при пиролизе бензонитрила. Кривизна поверх-
ности приводит к очень высоким значениям плотности электрического поля (~1 В/A).
В результате электрон молекулы аналита туннелирует с образованием катион-радика-
ла практически без избытка внутренней энергии. Помимо того, этот катион не может
долго находиться рядом с положительно заряженным эмиттером (8—10 кВ) и выталки-
вается из источника за 10—12 с, т. е. в 106 раз быстрее, чем в случае ЭИ. Фрагментация ока-
зывается практически невозможной, а масс-спектр очень часто состоит исключительно
из пика молекулярного иона.
Если образец наносится непосредственно на поверхность эмиттера при атмосфер-
ном давлении, а затем эмиттер вводится в ионный источник и на него подается напря-
жение, протекает аналогичный процесс ионизации, а метод называется полевой де-
сорбцией (ПД, fi eld desorption, FD). Этот метод был весьма популярен в 1970—1980-е гг.,
поскольку позволил впервые получить масс-спектры целого ряда нелетучих соедине-
ний. Механизм в этом случае связан с туннелированием электрона из твердофазного
образца с последующей десорбцией с эмиттера образовавшегося иона.
Некоторое время назад казалось, что ПИ утратила свое значение, но недавно по-
явившиеся приборы, способные попеременно снимать масс-спектры ЭИ и ПИ, вдохну-
ли новую жизнь в этот метод. Самые разнообразные экотоксиканты могут быть надеж-
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
0
10
0
10
74,04
55,05
87,05
75,04
298,29
143,11 255,23
101,06 129,09
199,17
157,12 185,16 213,19 241,22
267,27
269,25 299,29
298,29
299,30
300,31
EI
FI
Рис. 1.6. Масс-спектры электронной ионизации (верх) и полевой ионизации (низ) метил-
стеарата (с разрешения Waters Corp.)
38 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
но идентифицированы, когда их молекулярные ионы зарегистрированы в режиме ПИ,
а структурная информация получена в режиме ЭИ (рис. 1.6).
Еще три метода ионизации могут быть отмечены как наиболее приемлемые для
экологических исследований, связанных с определением полярных, термолабильных
и тяжелых молекул, т. е. таких, для которых предпочтительным методом разделения яв-
ляется ЖХ (глава 3).
1.3.4. Ионизация электрораспылением
Ионизация электрораспылением, или электроспрей (ЭРИ, еlectrospray ionization, ESI),
позволила совершить научный прорыв в область масс-спектрометрических исследо-
ваний нелетучих, нестабильных молекул, высокомолекулярных соединений, включая
природные полимеры (белки, сахара, нуклеиновые кислоты и т. д.). Основу для создания
метода заложили теоретические работы Доула (Dole et al., 1968). За пионерской работой
группы Л. Н. Галль (Александров и др., 1984) последовала публикация Дж. Фенна (Yamashita
and Fenn, 1984), который в 2002 году получил за создание электрораспыления
Нобелевскую премию.
Часто ионы аналита присутствуют уже в растворе, а если исходное полярное сое-
динение нейтрально, оно может быть легко переведено в ионную форму добавкой к его
раствору кислоты или основания. Для того чтобы использовать масс-спектрометрию
для регистрации этих ионов, надо всего лишь избавиться от молекул растворителя.
Для этой цели раствор аналита распыляется при атмосферном давлении в ионный ис-
точник прибора через тонкий капилляр (рис. 3.4 в главе 3), на который подается высо-
кое напряжение (3—7 кВ). Ионы одинаковой полярности в образующихся капельках
спрея стараются отойти друг от друга как можно дальше, распределяясь по поверхно-
сти сферической капли. Нагрев и поток инертного газа вызывают испарение раство-
рителя непосредственно из капелек спрея. В какой-то момент силы поверхностного
натяжения больше не могут компенсировать силы кулоновского расталкивания, вы-
зывая микровзрыв с образованием таких же капелек меньшего размера. Этот процесс
может повторяться многократно, приводя каждый раз к образованию капель мень-
шего размера. Предложено два основных механизма высвобождения ионов аналита.
Первый (Mora et al., 2000) базируется на том, что свободные ионы аналита образуются
исключительно благодаря последовательным микровзрывам, в результате которых ис-
ходные заряженные частицы мало-помалу теряют свою сольватную оболочку. Второй
ставит во главу угла ионное испарение за счет кулоновских взаимодействий (Iribarne
and Thomson, 1976). Серьезным аргументом в пользу ионного испарения служит не-
давнее исследование, проведенное группой Р. Зеноби методом ионной спектроскопии
(Chingin et al., 2010).
Существует несколько вариантов стыковки электрораспыления с жидкостным
хроматографом. Для улучшения процесса испарения могут использоваться несколько
дополнительных газовых потоков. Скорость потока элюента через колонку может со-
ставлять от нескольких миллилитров до нескольких нанолитров. В частности, режим
наноспрея с потоком 20—200 нЛ/мин. завоевал широкую популярность для анализа
биополимеров. В таком варианте достигаются сразу две цели: чувствительность значи-
тельно улучшается, а расход образца значительно уменьшается.
1.3. Ионизация 39
Важной особенностью ионизации электрораспылением является преимуществен-
ное образование многозарядных ионов. Поскольку анализаторы масс разделяют ионы
по их значениям m/z, спектры очень сложных соединений могут быть получены на до-
статочно простых приборах. Например, ион с массой 100 000 дальтон и зарядом +100 бу-
дет зарегистрирован прибором в том же месте спектра, что и однозарядный ион с массой
1000. По этой причине электрораспыление успешно используется для исследования со-
единений с молекулярными массами от сотен до миллионов дальтон. Рекордная зареги-
стрированная молекулярная масса составляет 110 миллионов дальтон (Chen et al., 1995).
Авторам удалось детектировать молекулярные ионы ДНК бактериофага T4 с зарядами
от 28000 до 35000.
Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением обладает превосходной
чувствительностью, достигая аттомолярных (10—18) и даже зептомолярных (10—21) уров-
ней. С источником электрораспыления, помимо жидкостной хроматографии, успешно
сочетается и капиллярный электрофорез. Возможен и прямой ввод раствора образца.
Перечисленные преимущества сделали ионизацию электрораспылением одним из наи-
более эффективных и востребованных методов сегодняшнего дня.
1.3.5. Химическая ионизация и фотоионизация при
атмосферном давлении
Впервые о химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД, atmospheric pressure
chemical ionization, APCI) заявил Хорниг в 1973 году (Horning et al., 1973), а в 1974 она
уже была успешно использована в сочетании с ЖХ (Horning et al., 1974). Метод основан
на подаче растворенного образца в источник ионов, работающий при атмосферном дав-
лении. Высокое напряжение, приложенное к электроду в виде острой иглы, создает ко-
ронный разряд, который и генерирует ионную плазму (рис. 3.5 в главе 3). Большинство
этих ионов обусловлено молекулами растворителя и атмосферных газов: азота и кисло-
рода. В таких условиях самые разнообразные ионно-молекулярные реакции неизбеж-
ны. Так, реакция первичных ионов с молекулой воды может привести к образованию
катиона H3O+ и аниона OH–. Реакции этих ионов-реагентов с молекулами аналита ведут
к появлению протонированных MH+- и депротонированных [M – H]–-молекул, которые
вытягиваются в анализатор. ХИАД демонстрирует лучшие результаты по сравнению
с электрораспылением, когда речь идет об умеренно полярных или легких органиче-
ских соединениях. ХИАД превосходит электроспрей и в том, что касается толерант-
ности по отношению к солям и компонетам буферных растворов, часто используемых
в жидкостной хроматографии.
Если необходимо проанализировать сложную смесь неполярных соединений (на-
пример нефть, см. главу 18 — «Петролеомика»), эффективным может быть метод фотоио-
низации при атмосферном давлении (ФИАД, atmospheric pressure photoionization, APPI).
Фотоионизация традиционно использовалась в основном для установления физико-хи-
мических характеристик молекул. Первый коммерческий прибор был создан в 1956 году
(Lossing and Tanaka, 1956). Однако вариант метода при атмосферном давлении был пред-
ложен только в 1986 году, когда И. А. Ревельский (Revelskii, 1985, 1986) продемонстриро-
вал его успешное использование для решения проблем анализа объектов окружающей
среды. Дополнительные преимущества ФИАД для ЖХ/МС были представлены Роббом
в 2000 году (Robb et al., 2000). ФИАД требует распыления раствора аналита в ионный ис-
40 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
точник (рис. 3.6 в главе 3), где УФ-излучение вызывает ионизацию молекул аналита в ре-
зультате прямого или вторичных процессов. Образуются одновременно как положитель-
ные, так и отрицательные ионы. ФИАД особенно полезна при работе с неполярными
соединениями, когда альтернативные электрораспыление и ХИАД не столь эффектив-
ны. Процесс ионизации можно модифицировать, введя в систему избыток специально-
го реагента (допанта). Толуол, ацетон, некоторые другие простые молекулы легко иони-
зуются в условиях ФИАД, а затем передают заряд молекуле аналита. В таком варианте
правильнее называть процесс фотохимической ионизацией при атмосферном давлении.
1.3.6. Матрично-активированная лазерная
десорбция/ионизация
Еще один эффективный метод ионизации, созданный в 1980-х, был назван матрично-
активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ, matrix assisted laser desorption/
ionization, MALDI). Его важность для науки была подтверждена присуждени-
ем за его создание (в тандеме с электрораспылением) Нобелевской премии в 2002 году.
Пока он не столь популярен в масс-спектрометрии окружающей среды, но в будущем
может оказаться весьма полезным. Метод основан на предварительной сокристаллиза-
ции молекул образца и матрицы. Облучение такого образца короткими лазерными им-
пульсами приводит к поглощению энергии лазера молекулами матрицы с практически
взрывным переносом этих молекул вместе с молекулами аналита в газовую фазу. По-
следующие реакции в образовавшейся плазме приводят к образованию ионов аналита.
Метод позволяет работать с очень сложными молекулами, включая природные и синте-
тические полимеры. МАЛДИ также является одним из наиболее эффетивных методов
для масс-спектрометрического имиджинга (глава 20).
1.4. Ìàññ-àíàëèçàòîðû
После того как ионы образца получены, необходимо их разделить. Для этой цели исполь-
зуются масс-анализаторы. Существует несколько типов анализаторов. Каждый из них
имеет свои преимущества и недостатки. Поэтому, покупая масс-спектрометр, очень
важно представлять диапазон задач, которые вы собираетесь решать с его помощью.
1.4.1. Секторные приборы
Исторически магнитные секторные приборы были первыми масс-спектрометрами.
Эти приборы могут иметь один магнитный анализатор или несколько магнитных и элек-
тростатических анализаторов. Чем больше анализаторов имеет масс-спектрометр, тем
более сложные исследования могут осуществляться с его помощью. Схема секторного
масс-спектрометра прямой геометрии с двойной фокусировкой (магнитный анализатор
следует за электростатическим) представлена на рис. 1.7. Покидая источник, ионы уско-
ряются по направлению к анализаторам.
Формула 1.9 — уравнение разделения ионов в магнитном секторе:
m/z e = B2R2/2V, (1.9)
1.4. Масс-анализаторы 41
где m — масса иона, e — элементарный заряд, z — число зарядов, B — напряженность
магнитного поля, R — радиус магнита, V — ускоряющее напряжение (обычно несколь-
ко кВ). Таким образом, магнитный анализатор может разделять ионы по их значениям
m/z при изменении напряженности поля, радиуса или ускоряющего напряжения, при-
чем предпочтительно изменять именно напряженность поля. Электростатический сек-
тор называется анализатором «энергий», поскольку пропускает только ионы с опреде-
ленной кинетической энергией (в обычном режиме напряжение электростатического
поля равно ускоряющему напряжению).
Объединение в приборе двух и более анализаторов позволяет проводить тандемные
масс-спектрометрические эксперименты (глава 4). Помимо этого, электростатический
анализатор (рис. 1.7) привносит дополнительную особенность — высокую разрешаю-
щую способность (разрешение по массе).
Разрешение по массе (R) означает способность масс-спектрометра разделять два
иона с массами m и (m + Δm). Формально для двух соседних пиков однозарядных ио-
нов равной интенсивности (рис. 1.8) разрешающая способность определяется как
R = m/Δm. Другой часто используемый термин «разрешение по массе» определяется
как Δm. Если Δm = 1, то R — теоретический предел измеряемой массы на приборе (когда
еще возможно увидеть два разделенных сигнала от соседних ионов целочисленной мас-
сы). Единичное разрешение означает, что масс-спектрометр позволяет разделять ионы
с точностью до целочисленных масс. Например, разрешающей способности 1000 доста-
точно для разделения ионов с m/z 999 и m/z 1000. Рис. 1.8 иллюстрирует определение
разрешающей способности (10%-я ложбина). Следует отметить, что для разрешающей
способности других анализаторов обычно пользуются 50%-й ложбиной.
Возникает вопрос, зачем необходима высокая разрешающая способность (сот-
ни тысяч и даже миллионы), когда речь идет о молекулах с молекулярными массами
в пределах нескольких сотен единиц? Ответ заключается в том, что любой изотоп любо-
го химического элемента имеет свой уникальный дефект массы. Поскольку в качестве
стандарта был выбран основной изотоп углерода 12C (12,000000…), массы всех осталь-
Источник ионов
Детектор
1 БП
2 БП
Магнитный
анализатор
Электростатический
анализатор
Рис. 1.7. Принципиальная схема двухфокусного масс-спектрометра (прямая геометрия).
БП — бесполевое пространство
42 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
ных изотопов нецелочисленны. Например, 1H — 1,00782506…; 14N — 14,00307407…; 16O —
15,99491475… . Измерив точную массу иона, можно установить его элементный состав,
поскольку не существует ионов с одинаковой массой и разным составом. Эти аспекты
будут детально рассмотрены в главе 18 при обсуждении петролеомики.
Важность высокого разрешения можно продемонстрировать на простейшем приме-
ре разделения мультиплета с целочисленной массой 28 дальтон. Три соединения с такой
молекулярной массой всегда присутствуют в фоне масс-спектрометра. Это азот, окись
углерода и этилен. Если разрешающая способность прибора ниже 500, молекулярные
ионы всех трех соединений регистрируются как один пик (рис. 1.9а). Постепенное уве-
личение разрешающей способности существенно меняет картину, приводя сначала
к дублету, а в конечном счете — к триплету (рис. 1.9б, в, г).
Чтобы разделить пики ионов составов СО и С2Н4 с точными масса-
ми 27,994915 и 28,03300 соответственно, необходима разрешающая способность
R = 28/(28,03300 – 27,994915) = 770, а для разделения пиков СО и N2 (масса молекулы
азота 28,006148 единиц) — 2500.
Установление элементного состава соединения, содержащего любые химические
элементы, за пару минут — важное преимущество масс-спектрометрии над трудоем-
ким определением состава с помощью классического элементного анализа. Тем не ме-
m
10%
m m m
Рис. 1.8. Определение разрешающей способности масс-спектрометра
R250 R1200 R2000 R3500
a б в г
Рис. 1.9. Форма пика фоновых ионов с m/z 28 при разной разрешающей способности
прибора
1.4. Масс-анализаторы 43
нее следует отметить, что элементный анализ дает информацию о составе всего образца
(включая примеси), тогда как масс-спектрометрия устанавливает элементный состав
индивидуальных соединений (отдельно всех компонентов и примесей образца).
Принимая во внимание, что число возможных элементных составов резко возрас-
тает с увеличением массы иона, масс-спектрометрия высокого разрешения становится
крайне важной при использовании во время работы с биомолекулами методов электро-
распыления и МАЛДИ. В этих случаях для надежного определения точных масс необ-
ходимы очень высокая разрешающая способность и точность измерения.
Кстати, разрешение по массе не является синонимом точности измерения массы.
Первый из этих параметров определяет способность масс-спектрометра получить раз-
дельные изображения (пики) ионов с близкими массами, а второй — установить точное
и правильное значение m/z иона, обычно для последующего определения его элементно-
го состава. Не стоит думать, что увеличение разрешения всегда ведет к автоматическому
улучшению точности измерения масс. Как только разрешение оказывается достаточ-
ным для разделения пиков измеряемых ионов, бессмысленно увеличивать его далее, по-
скольку интенсивность сигналов будет уменьшаться с неизбежным уменьшением точ-
ности измерений масс.
Рис. 1.10 иллюстрирует важность применения масс-спектрометрии высокого раз-
решения для экологических исследований. Наблюдение широкого пика со временем
Рис. 1.10. Форма хроматографического пика в режиме SIM (см. главу 2) при использова-
нии разрешающей способности 3000 (широкий пик) и 10000 (два узких пика)
(с разрешения Thermo)
Высокое разрешение
Низкое разрешение
Относительная интенсивность
m/z
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
321,3 321,4 321,5 321,6 321,7 321,8 321,9 322,0 322,1 322,2 322,3 322,4 322,5
5
0
Другое
хлорированное
соединение
ТХДД
44 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
выхода 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксина на масс-хроматограмме (глава 2) по току
ионов с m/z 321,9 может привести к выводу о присутствии в образце значительных ко-
личеств этого суперэкотоксиканта. Тем не менее более точные измерения массы (4 де-
сятичных знака) наглядно демонстрируют, что этот широкий пик обусловлен супер-
позицией двух пиков ионов с m/z 321,8936 и 321,8678. Первый из них действительно
обусловлен 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксином, однако второй принадлежит значи-
тельно менее токсичному гептахлорбифенилу; т. е., возможно, экологическая ситуация
не настолько плоха, как могло показаться исходя из результатов анализа с недостаточ-
ным разрешением.
Измеряя массы с очень высоким разрешением, фактически можно измерять энер-
гии. Работает знаменитое уравнение Эйнштейна E = mc2. В частности, энергия связи,
складывающаяся из сильных, слабых и электромагнитных взаимодействий, может быть
определена при измерении масс всей молекулы и ее составляющих.
Возвращаясь к секторным масс-спектрометрам, следует отметить следующие
аспекты. Современные приборы этого типа обладают великолепным разрешением
по массе, точностью измерения масс, чувствительностью, а также надежностью ко-
личественного определения. Их динамический диапазон остается непревзойденным,
а диапазон измеряемых масс уступает только времяпролетным приборам. К недостат-
кам этих анализаторов можно отнести небольшую скорость сканирования и достаточ-
но большие размеры.
1.4.2. Квадрупольные приборы
Прорыв масс-спектрометрии в область экологии произошел в 1970-х с внедрением ква-
друпольных приборов в широкую практику. Это устройство часто называют фильтром
масс. Оно состоит из четырех параллельных стержней (рис. 1.11), к которым приложено
переменное и постоянное напряжения, создающие квадрупольное поле, способное фо-
кусировать, удерживать и анализировать ионы. Низкая стоимость, небольшие размеры,
высокая скорость сбора данных, превосходный динамический диапазон, хорошая вос-
Ось поля
z
y
x
(U V cos t)
(U V cos t )
Рис. 1.11. Принципиальная схема квадрупольного анализатора
1.4. Масс-анализаторы 45
производимость и пониженные требования к вакуумной системе являются основными
достоинствами квадрупольных масс-спектрометров.
Благодаря этим характеристикам даже невысокое разрешение по массе не оста-
новило активного продвижения квадруполей на приборный рынок. Поскольку моле-
кулярные массы подавляющего большинства приоритетных загрязняющих веществ
редко превосходят 500 Дальтон, квадрупольные масс-спектрометры с разрешающей
способностью 1000 оказались идеальным инструментом для качественного и количе-
ственного определения этих соединений в самых разнообразных образцах. Неплохая
чувствительность квадруполей в режиме сканирования может быть увеличена при-
мерно в 100 раз при работе в режиме масс-фрагментографии (мониторинга заданных
ионов, см. главу 2).
Комбинация трех квадруполей (QqQ) позволяет использовать несколько режимов
тандемной масс-спектрометрии (MС/MС, глава 4). Этот подход активно применяется
в настоящее время для надежной идентификации и количественного определения за-
грязняющих веществ и природных соединений, включая пептиды и белки.
Предположим, у нас имеется смесь нескольких соединений. Можно ли установить
масс-спектрометрически их структуры без предварительного разделения (хроматогра-
фии), а введя непосредственно в ионный источник всю смесь? Действительно, магнит-
ные секторные и тройные квадрупольные приборы, ионные ловушки, приборы ионного
циклотронного резонанса, орбитальные ловушки (см. ниже) могут справиться с этой
задачей.
Использование «мягкого» метода ионизации (ХИ, ПИ, МАЛДИ, электрораспы-
ление) дает возможность получить молекулярные ионы компонентов смеси. Молеку-
лярные ионы каждого типа (рис. 1.12, белые, розовые или зеленые шарики) по очереди
проходят через первый квадруполь и направляются к следующему анализатору (Q3).
На пути следования они попадают в специальную ячейку (Q2), в которой их внутрен-
няя энергия повышается каким-либо образом для того, чтобы инициировать их фраг-
ментацию. Существует достаточно много реакций активации, хотя соударение с ато-
мами инертного газа остается наиболее популярным процессом. Фрагментные ионы
(рис. 1.12, синие, красные и черные шарики) исходного молекулярного иона (рис. 1.12,
зеленые шарики) достигают второго анализатора, в котором они разделяются по m/z,
т. е. происходит регистрация масс-спектра первого компонента образца. Далее про-
Рис. 1.12. Схема эксперимента МС/МС в пространстве. В качестве примера использован
тройной квадруполь (с разрешения Applied Biosystems)
ввод N2
Радио-
частотный
ионный фильтр
Q1 Q2
Камера соударений
Q3
Детектор
МС/МС
в пространстве
46 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
цедура повторяется со вторым молекулярным ионом (например, розовые шарики
на рис. 1.12) и так далее. Когда будет осуществлена фрагментация всех молекулярных
ионов, анализ образца без его предварительного разделения будет завершен. Обыч-
но такой режим занимает значительно меньше времени, чем, например, ГХ/МС или
ЖХ/МС. Очевидным недостатком является невозможность анализировать изомеры.
Кстати, при наличии соответствующих конструкционных характеристик каждый
из фрагментных ионов может быть выделен аналогично молекулярному и после про-
цедуры активации фрагментации мы получим его масс-спектр. Этот метод называет-
ся МС3. Ионные ловушки способны зарегистрировать спектры до 10 поколений фраг-
ментных ионов. Этот метод называется МСn. Детали тандемной масс-спектрометрии
будут рассмотрены в главе 4.
1.4.3. Ионные ловушки
Впервые ионная ловушка в качестве устройства для удерживания ионов была предложе-
на Паулем (Paul, Steinwedel, 1953) в 1953 году. Существует много разных ионных ловушек:
квадрупольные, цилиндрические, линейные и т. д. (подробнее см. главу 9). Принцип ра-
боты наиболее популярной цилиндрической ловушки мало отличается от такового для
квадруполя. Разница заключается в геометрии. Обычно ловушки состоят из двух торце-
вых и одного кольцевого электрода, которые создают рабочий объем для экспериментов
с ионами. Ловушки оказались еще дешевле и меньше по размеру, чем квадруполи. Более
того, сложные тандемные эксперименты (МСn) могут осуществляться в любой ионной
ловушке, а при использовании низкой скорости сканирования разрешающая способ-
ность этих приборов может достигать 107 (March, 1998). Кстати, МС/МС-эксперименты
в ионных ловушках называются МС/МС во времени в противоположность МС/МС
в пространстве в тройных квадрупольных и магнитных секторных приборах. Эти осо-
бенности сделали ионные ловушки вполне конкурентоспособными квадруполям,
несмотря на меньший динамический диапазон и ухудшенные характеристики коли-
чественного анализа. В любом случае ионные ловушки позволяют работать с разноо-
бразными экотоксикантами в требуемых диапазонах концентраций. В экологических
исследованиях для повышения чувствительности и скорости сбора данных они обычно
стыкуются с газовым или жидкостным хроматографом и функционируют с разрешени-
ем в 1 единицу массы. Линейная квадрупольная ионная ловушка — еще один вариант
анализаторов этого типа. Она отлично зарекомендовала себя в качестве устройства для
инициирования фрагментации в режиме МС/МС.
1.4.4. Времяпролетные масс-спектрометры
Пусть у нас есть полая труба, а ионы с разными значениями m/z находятся на стартовой
линии около входа в эту трубу. Если, приложив потенциал (V), мы ускорим одновремен-
но все эти ионы, они полетят по трубе, причем их кинетическая энергия будет одинако-
вой (см. также главу 9).
eV = mv2/2 или m = 2eV/v2 (1.10)
Это означает, что более тяжелые ионы достигнут конца трубы позже, чем более лег-
кие. Это основной принцип времяпролетной масс-спектрометрии (time-of-fl ight, TOF).
1.4. Масс-анализаторы 47
Хотя теоретические основы этого метода были заложены в середине XX века (Wolff and
Stephens, 1953), использование этих приборов для изучения самых разнообразных ор-
ганических соединений началось только через 40 лет. Проблемы были связаны с раз-
бросом по времени старта, энергии и в пространстве, а также с необходимостью иметь
очень быстрые детекторы, поскольку ионы с разной величиной m/z достигают детек-
тора с очень небольшой разницей по времени (если, конечно, труба имеет реальную
длину). Однако теперь при наличии современной электроники и после изобретения
рефлектрона (Mamyrin, 1973), применения фокусировки с временной задержкой (Wiley
and McLaren, 1955) и техники ортогонального ускорения (Dodonov et al., 1994, Dawson and
Guilhaus, 1989) времяпролетные приборы стали наиболее популярными, а их перспек-
тивы — самыми радужными. Разрешающая способность современных времяпролетных
масс-спектрометров достигает сотен тысяч, они обладают высокой точностью измере-
ния масс, теоретически неограниченным диапазоном масс. Их чувствительность до-
статочно высока, а скорость сбора данных непревзойденная. Например, прибор LECO
Pegasus IVD может регистрировать до 500 спектров в секунду. Эта особенность привела
к созданию быстрой хроматографии (глава 6). Кроме того, благодаря единовременному
старту ионов со всеми значениями m/z к детектору масс-спектры оказываются идентич-
ными вне зависимости от того, в какой части хроматографического пика они были за-
регистрированы (рис. 2.6, глава 2). Это важное преимущество времяпролетных анали-
заторов по сравнению с другими масс-спектрометрами.
Времяпролетные анализаторы лучше других подходят для работы с импульсными
методами ионизации типа МАЛДИ, однако техника ортогонального ускорения позво-
ляет эффективно использовать их и в комбинации с непрерывными источниками ионов.
Времяпролетные приборы могут применяться и для МС/МС-экспериментов. При этом
они являются идеальным анализатором ионов-продуктов в различных гибридных при-
борах типа QTOF, IT-TOF.
1.4.5. Масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса
с преобразованием Фурье
История наиболее мощных анализаторов (масс-спектрометрия ионного циклотронного
резонанса с преобразованием Фурье, ИЦР ПФ, Fourier transform ion cyclotron resonance,
FTICR) связана с тремя датами. Принцип ионного циклотронного резонанса был пред-
ложен Лоуренсом в 1930-м году (Lawrence and Edelfsen, 1930), первый прибор был создан
Соммером в 1950 (Hipple et al., 1949), а в 1974 Маршалл и Комисаров впервые применили
преобразования Фурье (Comisarow and Marshall, 1974). В противоположность ранее опи-
санным анализаторам в масс-спектрометрах ионного циклотронного резонанса ионы
удерживаются в ячейке прибора благодаря приложенным перпендикулярным магнит-
ным и электростатическим полям. При этом ионы движутся по круговым траекториям,
перпендикулярным магнитному полю. Частоты движущихся в ячейке ионов зависят
от их значений m/z. Можно провести возбуждение ионов радиочастотным импульсом
и перевести их на резонансные орбиты. Движение ионов в ячейке генерирует во внеш-
них пластинах детектора наведенный ток, причем его частота точно соответствует зна-
чению m/z ионов в ячейке. Затухание этих наведенных токов регистрируется как времен-
ной сигнал, который может быть конвертирован в классическую форму масс-спектра
48 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
приложением преобразований Фурье. Поскольку ионы не покидают ячейку, процесс
возбуждения и детектирования может повторяться многократно. Подробнее этот метод
изложен в главе 18.
Метод ИЦР ПФ дает возможность инициировать каким-либо образом фрагмен-
тацию интересующих исследователя ионов и осуществить эксперимент тандемной
масс-спектрометрии. Кроме того, можно изучать реакции целевых ионов с разными
нейтральными или заряженными частицами. В этом случае речь идет об ионно-моле-
кулярных и ионно-ионных реакциях в газовой фазе.
Основным достоинством метода ионного циклотронного резонанса является его
сверхвысокая разрешающая способность. Именно благодаря ей элементный состав ио-
нов может быть установлен с высокой надежностью. Метод эффективен для решения
фундаментальных научных проблем, а на его базе были созданы новые прикладные
дисциплины, занимающиеся сверхсложными смесями природных соединений типа
нефтей и нефтепродуктов (глава 18) или гуминовых веществ (глава 19).
Основным недостатком масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса яв-
ляется очень высокая стоимость оборудования и его эксплуатации. Этот момент суще-
ственно сдерживает распространение этого фантастического метода.
1.4.6. Орбитальные ловушки
К концу XX века казалось, что будущее масс-спектрометрии будет связано исключи-
тельно с усовершенствованием известных типов анализаторов. Это мнение базирова-
лось на факте, что за несколько прошедших десятилетий не было предложено никаких
новых систем. Поэтому, когда Александр Макаров объявил о создании орбитальной ло-
вушки (рис. 1.13), это было воспринято в качестве революционного события (Makarov,
1999, 2000). Избегая технических деталей, не являющихся необходимыми для целей
данной книги, следует лишь отметить, что в орбитальных ловушках, как и в приборах
ИЦР, для измерения масс используются преобразования Фурье. Однако дорогостоящие
супермагниты в этом случае не нужны. Обладая высокой разрешающей способностью
Ионный
источник ХИАД
Линейная
ионная ловушка С-ловушка
Дифференциальная
откачка Орбитальная
ловушка
Рис. 1.13. Принципиальная схема орбитальной ловушки (с разрешения A. Макарова)
Литература 49
и высокой точностью измерения масс, орбитальные ловушки за 5 лет стали самыми вос-
требованными приборами на масс-спектрометрическом рынке.
1.5. Äåòåêòèðîâàíèå èîíîâ
Конечный блок масс-спектрометра отвечает за детектирование ионов. В первых клас-
сических приборах использовалась фотопластинка. Ионы с одинаковым значением m/z
попадали на конкретный участок фотопластинки, а уровень засвечивания позволял
проводить количественные измерения.
Токи ионов с одной величиной m/z в конкретном эксперименте очень малы (10–9—
10—17 А) для прямого измерения. Поэтому детектированию предшествует процедура уси-
ления сигнала. Умножители генерируют вторичные токи, более мощные в 104—108 раз.
Когда ион проходит анализатор и попадает в детектор, он инициирует эмиссию вторич-
ных частиц, например фотонов или электронов. Детекторы конвертируют энергию вхо-
дящих частиц в ток, который измеряется соответствующими устройствами.
Электронные умножители могут быть разделены на две основные группы: с дискрет-
ным динодом (несколько раздельных динодов) и непрерывным динодом (непрерывная
эмиссионная поверхность с высокой способностью ко вторичной эмиссии, например
мультиканальная пластина). Несколько эффективных конструкций детекторов описаны
в (Westman-Brinkmalm and Brinkmalm, 2009). Для регистрации отрицательных ионов на пер-
вой стадии регистрирующей системы находится конверсионный динод. Отрицательный
ион, попадая на этот динод, генерирует разные частицы, включая положительные ионы,
которые регистрируются далее обычным образом. В случае приборов ионного цикло-
тронного резонанса и орбитальных ловушек процесс регистрации ионов недеструктивен
и основан на измерении наведенных токов. Важнейшими характеристиками детекто-
ров являются линейность, коэффициент умножения, время восстановления и уровень
шума. Дополнительная полезная информация о детекторах представлена в главе 9.
Ëèòåðàòóðà
[1]. Aleksandrov M. L., Gall L. N., Krasnov V. N., Nikolaev V. I., Pavlenko V. A., Shkurov V. A.
(1984). «Ion extraction from solutions at atmospheric pressures: a mass spectrometric method
of analysis of bioorganic compounds». Doklady Akademii Nauk SSSR. 277, 2: 379—383.
[2]. Beckey H. D., Hilt E., Maas A., Migahed M. D., and Ochterbeck E. (1969). «A method for
strong activation of fi eld ion emitters». International Journal of Mass Spectrometry and Ion
Physics. 3, 1—2: 161—165.
[3]. Chingin K., Frankevich V., Balabin R. M., Barylyuk K., Chen H., Wang R., and Zenobi R.
(2010). «Direct access to isolated biomolecules under ambient conditions». Angewandte Chemie.
International Edition., 49, 13: 2358—2361.
[4]. Chen R., Cheng X., Mitchell D. W., Hofstadler S. A., Wu Q., Rockwood A. L., Sherman
M. G., and Smith R. D. (1995). «Trapping, Detection, and Mass Determination of
Coliphage T4 DNA Ions by Electrospray Ionization Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance
Mass Spectrometry». Analytical Chemistry. 67, 7: 1159—1164.
50 Глава 1. Основные принципы масс-спектрометрии
[5]. Comisarow M. B., and Marshall A. G. (1974). «Fourier transform ion cyclotron resonance
spectroscopy». Chemical Physics Letters. 25, 2: 282—283.
[6]. Damico J. H., and Barron R. P. (1971). «Application of fi eld ionization to gas-liquid chromatography-
mass spectrometry (GLC-MS) studies». Analytical Chemistry. 43, 1: 17—21.
[7]. Dawson J. H. J., and Guilhaus M. (1989). «Orthogonal-acceleration time-of-fl ight mass
spectrometer». Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 5: 155—159
[8]. Dempster A. J. (1921). «Positive ray analysis of lithium and magnesium». Physical Reviews.
18, 6: 415—422.
[9]. Dodonov A. F., Chernushevich I. V., and Laiko V. V. (1994). Electrospray Ionization on a Refl
ecting Time-of-Flight Mass Spectrometer. In: Cotter R. J. Time-of-Flight Mass Spectrometry.
ACS Symposium Series 549, Washington, DC, 108—123.
[10]. Dole M., Mack L. L., Hines R. L., Mobley R. C., Ferguson L. D., and Alica M. B. (1968).
«Molecular beams of macroions». Journal of Chemical Physics. 49, 5: 2240—2249
[11]. Harrison A. G. (1992). Chemical Ionization Mass Spectrometry, CRC Press, Boca Raton,
USA.
[12]. Hipple J. A., Sommer H., and Thomas H. A. (1949). «A precise method of determining the
Faraday by magnetic resonance». Physical Reviews. 76, 12: 1877—1878
[13]. Horning E. C., Horning M. G., Carroll D. I., Dzidic I., and Stillwell R. N. (1973). «New
picogram detection system based on a mass spectrometer with an external ionization source
at atmospheric pressure». Analytical Chemistry. 45, 6: 936—943
[14]. Horning E. C., Carroll D. I., Dzidic I., Haegele K. D., Horning M. G., and Stillwell R. N.
(1974). «Liquid chromatograph-mass spectrometer-computer analytical systems: a continuous-
fl ow system based on atmospheric pressure ionization mass spectrometry». Journal
Chromatography A. 99, 13—21.
[15]. Inghram M. G., and Gomer R. (1954). «Mass spectrometric analysis of ions from the fi eld
microscope». Journal of Chemical Physics. 22, 7: 1279—1280.
[16]. Iribarne J. V., and Thomson B. A. (1976). «On the evaporation of small ions from charged
droplets». Journal of Chemical Physics. 64, 6: 2287—2294.
[17]. Lawrence E. O., and Edelfsen N. E. (1930). «On the production of high speed protons». Science.
72, 376—377
[18]. Lebedev A. T. (2009). Introduction to mass spectra interpretation: Organic chemistry. In: Ekman
R., Silberring J., Westman-Brinkmalm A. M., and Kraj A. (Ed.), Mass spectrometry.
Instrumentation, interpretation and applications. John Wiley @ Sons Inc., Hoboken, New
Jersey.
[19]. Lossing F. P., Tanaka I. J. (1956). «Photoionization as a source of ions for mass spectrometry
». Journal of Chemical Physics. 25, 5: 1031—1034.
[20]. Makarov A. A., Mass Spectrometer. US Pat. 5,886,346, 1999.
[21]. Makarov A. (2000). «Electrostatic axially harmonic orbital trapping: a high-performance
technique of mass analysis». Analytical Chemistry. 72, 6: 1156—1162.
[22]. Mamyrin B. A., Karataev V. I., Shmikk D. V., and Zagulin V. A. (1973). «The mass refl ectron,
a new non-magnetic time-of-fl ight mass spectrometer with high resolution». Zurnal
Experimentalnoi y Teoreticheskoi Physiki. 64, 1: 82—90
[23]. March R. E. (1998). «Quadrupole ion trap mass spectrometry: Theory, Simulation, Recent
Developments and Applications». Rapid Communications in Mass Spectrometry. 12, 21:
1543—1554
Литература 51
[24]. Mora J. F., Van Berkel G. J., Enke C. G., Cole R. B., Martinez-Sanchez M., and Fenn J. B.
(2000). «Electrochemical processes in electrospray ionization mass spectrometry». Journal
of Mass Spectrometry. 35, 8: 939—952.
[25]. Muller E. W. (1951). «Das Feldionenmikroskop». Zeitschrift fur Physic. A131, 1: 136—142.
[26]. Munson M. S. B., Field F. H. (1966). «Chemical ionization mass spectrometry. I. General
introduction». Journal American Chemical Society. 88, 12: 2621—2630.
[27]. Paul W., and Steinwedel H. (1953). Ein neues Massenspektromrter ohne Magnetfeld. Z. Naturforsch,
A8: 448—450
[28]. Revelskii I. A. (1985). The method of mass spectrometric analysis of the gas mixtures. USSR
Patent 1159412, Bulletin 47.
[29]. Revelskii I. A., Yashin Yu. S., Voznesenskii V. N., Kurochkin V. K., Kostyanovskii R. G.
(1986). Mass spectrometry with phjtjionization of n-Alkanes, Alkohols, Ketones, Esters and
Amines at atmospheric pressure. Izvestiya Akademii Nauk SSSR, Seriya Khimiya, 9:
1887—1892.
[30]. Robb D. R., Covey T. R., and Bruins A. P. (2000). «Atmospheric pressure photoionization:
an ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry». Analytical Chemistry.
72, 15: 3653—3659
[31]. Westman-Brinkmalm A. M., and Brinkmalm G. (2009). A mass spectrometer´s building
blocks. In: Ekman R., Silberring J., Westman-Brinkmalm A. M., and Kraj A. (Ed.), Mass
spectrometry. Instrumentation, interpretation and applications. John Wiley @ Sons Inc.,
Hoboken, New Jersey.
[32]. Wiley W. C., and McLaren I. H. (1955). «Time-of-fl ight mass spectrometer with improved
resolution». The review of Scientifi c Instruments. 26, 12: 1150—1157
[33]. Wolff M. M., and Stephens W. E. (1953). «A pulsed mass spectrometer with time dispersion
». The review of Scientifi c Instruments. 24. 8: 616—617.
[34]. Yamashita M., and Fenn J. B. (1984). «Electrospray ion source: another variation on the
free-jet theme». The Journal of Physical Chemistry. 88, 20: 4451—4459.
[35]. А. Т. Лебедев. Масс-спектрометрия в органической химии. Бином, 2003
ÃËÀÂÀ 2
ÃÀÇÎÂÀß ÕÐÎÌÀÒÎÃÐÀÔÈß /
ÌÀÑÑ-ÑÏÅÊÒÐÎÌÅÒÐÈß —
«ÐÀÁÎ×Àß ËÎØÀÄÊÀ»
ÄËß ÀÍÀËÈÇÀ ÎÁÚÅÊÒÎÂ
ÎÊÐÓÆÀÞÙÅÉ ÑÐÅÄÛ
А. Т. Лебедев
2.1. Îáùèå âîïðîñû
Соединение газового хроматографа и масс-спектрометра было абсолютно логично, по-
скольку оба метода обладали примерно равной чувствительностью и успешно исполь-
зовались для анализа органических соединений. Газовый хроматограф разделяет ком-
поненты образца, а масс-спектрометр отвечает за их детектирование и идентификацию.
Однако благодаря синергетическому эффекту эта комбинация стала одним из наиболее
мощных аналитических методов современной науки. Основные принципы стыковки
были выдвинуты и реализованы в 1957 году. Единственной технической сложностью
объединения этих методов было рабочее давление. Если газовая хроматография работа-
ет в условиях атмосферного давления, то масс-спектрометрия требует условий высокого
вакуума. Разница достигает 8 порядков. В первых приборах вслед за набивной хрома-
тографической колонкой устанавливались специальные сепараторы, которые снижали
поток газа-носителя (30 мл/мин). Появление капиллярных колонок и более мощных
насосов устранило эту проблему. Теперь конец гибкой колонки из плавленого кварца
вводится непосредственно в ионный источник масс-спектрометра.
Более 20 лет потребовалось для того, чтобы состыковать масс-спектрометр с жид-
костным хроматографом. Подробнее о приборах и применении метода «жидкостная
хроматография/масс-спектрометрия» повествует Глава 3.
Безусловно, круг соединений, которые можно исследовать методом газовой хро-
матографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС) значительно уже, чем тот, который можно
исследовать методом масс-спектрометрии индивидуально. По счастью, для подавляю-
щего большинства антропогенных загрязняющих веществ газовая хроматография при-
менима. Поэтому ГХ/МС является чрезвычайно эффективным аналитическим мето-
дом в экологических исследованиях.
Говоря о методах ионизации в ГХ/МС, следует отметить, что более 90 % проводи-
мых анализов основано на электронной ионизации (ИЭ, глава 1), которая обеспечивает
интенсивную фрагментацию и позволяет эффективно применять компьютерные би-
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 53
блиотеки масс-спектров (глава 5). Существенно реже, но весьма успешно применяются
химическая ионизация (ХИ) и полевая ионизация (ПИ). Основная цель этих методов —
регистрация пика молекулярного иона, поскольку он зачастую отсутствует в спектрах
электронной ионизации. В этом случае эти методы являются отличным дополнением
к ИЭ. Поочередная регистрация ИЭ- и ХИ- (ПИ-) спектров во время ГХ/МС-анализа
дает информацию и о молекулярном ионе, и о наиболее значимых фрагментных ионах
(рис. 1.6 в главе 1). Кроме того, поскольку в спектрах ХИ и ПИ часто присутствует лишь
один пик молекулярного иона, они могут характеризоваться лучшими пределами обна-
ружения при количественном определении аналитов.
Хроматография привносит в комбинированный метод ГХ/МС (ЖХ/МС) очень важ-
ный параметр — время выхода (удерживания). Благодаря этому параметру появляется
возможность различать изомеры, даже в тех случаях, когда их масс-спектры очень близ-
ки друг другу. Это особо значимо для экологических исследований, поскольку токсич-
ности изомеров могут отличаться в миллионы и миллиарды раз (например, бенз[a]пи-
рен и бенз[e]пирен; 2,3,7,8-тетрахлордибензодиоксин и его многочисленные изомеры).
Таким образом, время удерживания может играть ключевую роль в установлении (под-
тверждении) структуры аналита.
2.2. Òèïû õðîìàòîãðàìì ñ ðåãèñòðàöèåé èîííîãî òîêà
Покидая колонку, элюат попадает в источник ионов масс-спектрометра, где осущест-
вляется ионизация. Образующиеся молекулярный и фрагментные ионы аналитов разде-
ляются в масс-анализаторе, причем осуществляется постоянная запись масс-спектров
в заданном диапазоне масс. Результирующая хроматограмма (рис. 2.1а) демонстрирует
последовательность пиков, обусловленных индивидуальными соединениями — ком-
понентами анализируемого образца. Каждый пик, как правило, охарактеризован не-
сколькими масс-спектрами. По абсциссе откладывается время выхода ингредиентов,
а по ординате — величина полного ионного тока (ПИТ), зарегистрированная в данный
момент времени. Другими словами, ПИТ — это абсолютное количество всех ионов,
образующихся в данный момент времени и регистрирующихся за одно сканирование
спектра во всем заданном диапазоне масс. Чем больше ионный ток, тем выше положе-
ние сигнала данного скана на оси ординат. Количественное определение достаточно
очевидно, так как площадь хроматографического пика пропорциональна количеству
данного компонента в образце.
Хроматограмма такого типа называется хроматограммой по полному ионному
току или ПИТ (рис. 2.1а). Компьютер обычно автоматически перестраивает ПИТ-
хроматограмму, чтобы устранить фоновые пики, дрифт нулевой линии, остаточные
сигналы растворителя, артефакты и т. д., создавая реконструированную хроматограм-
му по полному ионному току (РПИТ). Рис. 2.1 демонстрирует различия между ПИТ-
и РПИТ-хроматограммами. Почти все пики на РПИТ-хроматограмме разрешены до ну-
левой линии, что улучшает возможности как идентификации, так и количественного
определения. Таким образом, ГХ/МС позволяет проводить качественный и количе-
ственный анализ, оперируя с очень сложными смесями соединений без их предвари-
тельного разделения.
54 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
Компьютерная обработка может существенно улучшить качество масс-спектров.
Наиболее распространенными вариантами являются усреднение спектров и вычитание
фона. В первом случае интенсивность пиков ионов с конкретной величиной m/z в масс-
спектрах по всему профилю хроматографического пика суммируется и делится на чис-
ло спектров. В частности, усреднение минимизирует искажение спектров (см. ниже).
На рис. 2.2 представлена процедура вычитания фона. Она позволяет детектировать, на-
пример, следовые количества аналита на фоне значительного матричного фона в слож-
ных образцах. Хотя два основных кластера пиков ДДЕ (m/z 246 и 318) едва различимы
в масс-спектре, зарегистрированном на вершине хроматографического пика (рис. 2.2а),
после процедуры вычитания сходимость очищенного спектра со стандартным (библио-
течным) составила 88 % (рис. 2.2в).
Фоновый спектр необходимо выбрать на расстоянии нескольких сканирований
справа или слева от пика аналита, в точке, в которой интенсивность пиков ионов ана-
лита близка к нулю. Сигналы ионов каждого значения m/z в фоновом спектре должны
быть вычтены из аналогичных сигналов (с тем же значением m/z) в спектре, зарегистри-
рованном на вершине хроматографического пика. Результирующий пик практически
не содержит фоновых сигналов. В этом случае идентификация по спектральным базам
данных становится значительно надежнее и эффективнее. Иногда таким образом мож-
но расчистить сигналы аналитов, присутствующих в пробе в следовых количествах.
Чтобы улучшить качество спектра, полезно также перед вычитанием фона провести
усреднение фонового спектра. В этом варианте интенсивности ионов с каждым значе-
500
2,5е+007
2е+007
1,5е+007
1е+007
5е+006
0
2е+007
1,75е+007
7,5е+006
1,5е+007
1,25е+007
1е+007
5е+006
2,5е+006
0
600 700 800 900 1000 1100
500 600 700 800 900 1000 1100
a
б
Время, с
Время, с
РПИТ
ПИТ
Рис. 2.1. ГХ/МС-анализ. Органические загрязняющие вещества в образце природной
воды. (a) Хроматограмма по полному ионному току (ПИТ); (б) реконструирован-
ная хроматограмма по полному ионному току (РПИТ)
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 55
нием m/z суммируются по двум спектрам, зарегистрированным справа и слева у подно-
жия хроматографического пика, а полученные величины делятся на два. Усредненный
спектр вычитается из спектра аналита, как уже описано выше.
Существует две основные стратегии использования ГХ/МС. Первая связана с де-
тектированием целевых соединений. В этом случае задача обычно заключается в коли-
чественном определении заранее выбранных аналитов. При этом все остальные компо-
ненты образца, как правило, игнорируются. Вторая стратегия называется скринингом,
нецелевым анализом или анализом полного спектра. Эта существенно более сложная
задача включает идентификацию всех компонентов образца с последующим выбором
среди них наиболее значимых исходя из целей анализа. Точное количественное опре-
Рис. 2.2. (а) Масс-спектр, зарегистрированный на вершине хроматографического пика;
(б) масс-спектр фона; (в) масс-спектр аналита после вычитания фона (степень
идентичности 88 %); (г) библиотечный (NIST) масс-спектр ДДЕ
a
б
в
г
56 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
деление в режиме скрининга, как правило, невозможно. Однако по результатам можно
сделать более или менее точные количественные оценки. Наиболее полезные варианты
ГХ/МС-анализа в рамках этих двух стратегий описаны далее.
Существует еще один крайне полезный момент, невозможный в обычной газовой
хроматографии. Он особенно хорош для целевого анализа и заключается в перестрое-
нии хроматограмм с использованием тока только заданных ионов, например, m/z 141
и 156 на рис. 2.3б. Будучи очень эффективен для детектирования в образце целевых со-
единений, такой вариант представления называется масс-хроматограммой, реконстру-
ированной ионной хроматограммой (reconstructed ion chromatogram, RIC), селективной
ионной хроматограммой (selected ion chromatogram, SIC) или хроматограммой по току
выбранных ионов (extracted ion current, EIC).
Например, ионы с m/z 141 и 156 характерны для алкилнафталинов. Поскольку уров-
ни этих соединений в проанализированном образце природной воды были низки, их
a
Рис. 2.3. ГХ/МС-анализ. Хроматограммы образца природной воды с пиками органи-
ческих загрязняющих веществ. (а) Хроматограмма по полному ионному току;
(б) масс-хроматограмма по току ионов с m/z 141 (рыжий) и m/z 156 (зеленый), ха-
рактерных для метилнафталинов и диметилнафталинов соответственно
Время, с
Спектр №
Время, с
Спектр №
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 57
пики отсутствуют на ПИТ-хроматограмме (рис. 2.3а). Напротив, пики изомерных ме-
тил- и диметилнафталинов доминируют на масс-хроматограмме (рис. 2.3б). Становит-
ся возможным не просто детектирование, но и надежное количественное определение
этих соединений. Принимая во внимание, что построение масс-хроматограммы осно-
вано на перестроении исходной хроматограммы ПИТ и занимает лишь несколько се-
кунд компьютерного времени, эффективность такого подхода очевидна.
Хотя формально масс-хроматография не повышает чувствительности метода,
она позволяет наглядно выпятить инфомацию о целевых аналитах, скрытую на ПИТ-
хроматограмме пиками фона и мажорных компонентов. Масс-хроматограммы всегда ме-
нее сложны и более селективны, что делает этот подход очень полезным, когда речь идет
о многокомпонентных образцах. Очень часто целевой аналит выходит из колонки одно-
временно с мажорным компонентом. Результирующий масс-спектр оказывается мало-
пригодным для надежной идентификации, а пик на ПИТ-хроматограмме — неприемле-
мым для количественного определения. Пример такого случая представлен на рис. 2.4.
Образец жира серого кита был подвергнут экстракции дихлорметаном с последующей
простенькой очисткой. Жирные кислоты, продукты окисления жиров и холестериновые
производные составляют около 90 % компонентов экстракта, проходящих через хрома-
тографическую колонку. Их пики доминируют на хроматограмме по полному ионному
току, закрывая значительно меньшие пики целевых ксенобиотиков. Обработка ПИТ-
хроматограммы с построением масс-хроматограмм по току характеристических ионов
позволяет выявить пики целевых соединений, например экологически значимых поли-
хлорированных бифенилов. На рис. 2.4 видно, что никаких проблем с измерением пло-
щадей соответствующих пиков и установлением уровней этих соединений нет.
Рис. 2.5 позволяет понять, насколько элегантно ГХ/МС преодолевает еще один не-
достаток ГХ, связанный с количественным определением соединений с близкими вре-
менами удерживания. Эта проблема возникает и при целевом, и при скриниговом ана-
лизе. В качестве примера можно привести результат анализа образца нефтепродуктов.
На рис. 2.5а представлен небольшой фрагмент ПИТ-хроматограммы с основным пиком
с временем выхода 555,262 секунд, а на рис. 2.5б — масс-спектр, зарегистрированный
на его вершине. Пики с m/z 43, 57, 71… обусловлены характеристическими ионами ал-
кильной серии. Однако ион с m/z 154 определенно принадлежит другому соединению.
Следовательно, данный спектр — суперпозиция масс-спектров двух соединений.
ПИТ
326×500
360×500
Время, с
550
2e+006
4e+006
6e+006
8e+006
1e+007
1,2e+007
1,4e+007
1,6e+007
1,8e+007
600 650 700 750 800 850
Рис. 2.4. Фрагмент ПИТ-хроматограммы (оранжевый) образца жира серого кита и масс-
хроматограммы по току ионов с m/z 326 (зеленый), характерных для тетрахлорби-
фенилов, и m/z 360 (голубой), характерных для пентахлорбифенилов
58 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
a
б
в
г
д
Рис. 2.5. ГХ/МС-анализ образца нефтепродуктов. (а) 14-секундный фрагмент ПИТ-
хроматограммы; (б) масс-спектр на вершине хроматографического пика (RT
555,262 с); (в) масс-хроматограммы по току ионов с m/z 154 и m/z 71; (г) масс-
спектр первого компонента (тетрадекан, молекулярный ион с m/z 198 едва заме-
тен) с временем выхода 554,719 с; (д) масс-спектр второго компонента (бифенил)
с временем выхода 555,562 с
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 59
Масс-хроматограммы, построенные по току ионов с m/z 154 и 71 (рис. 2.5в), позволя-
ют увидеть, что времена выхода этих двух соединений очень близки и отличаются менее
чем на секунду (554,719 с и 555,562 с соответственно). Масс-спектры, зарегистрирован-
ные на вершине каждого из этих пиков после вычета фона с обеих сторон, позволяют
идентифицировать эти ингредиенты смеси как тетрадекан и бифенил, причем с высо-
кой степенью сходимости с библиотечными спектрами этих соединений. Площади пи-
ков на масс-хроматограммах дают возможность установить количество каждого из этих
компонентов в образце.
Масс-хроматограммы эффективны для подобных целей, если вершины двух пиков
отстоят не менее чем на 2 сканирования полного спектра. Таким образом, чем выше ско-
рость сканирования (сбора данных) масс-спектрометра, тем выше эффективность раз-
решения накладывающихся хроматографических пиков.
Существует вариант ГХ/МС-анализа, когда записи полного масс-спектра не тре-
буется. В этом случае масс-спектрометр настраивается на регистрацию только одного
или нескольких ионов с заранее выбранными значениями m/z. Этот метод называется
«мониторинг заданных (выбранных) ионов» (МЗИ, SIM) или «масс-фрагментография»
и используется для детектирования и количественного определения целевых аналитов
в сложных образцах (наиболее простой вариант целевого анализа). В этом случае ин-
формация о всех других компонентах образца теряется. Тем не менее, поскольку детек-
тор прибора в этом режиме постоянно измеряет лишь ток заданных ионов, а не скани-
рует несколько сотен различных величин m/z, интегральная чувствительность анализа
может быть повышена примерно на 2 порядка. Масс-фрагментография часто исполь-
зуется в экологических, криминалистических исследованиях, допинг-контроле, т. е.
в тех случаях, когда необходимо детектировать целевые соединения в ультра-следовых
количествах. Наличие пика заданного характеристического иона с известным временем
выхода на масс-фрагментограмме свидетельствует о присутствии данного соединения
Время, с
1e+006
2e+006
3e+006
4e+006
5e+006
6e+006
7e+006
8e+006
800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
128
136
154
178
188
202
228
252
276
278
Рис. 2.6. SIM-анализ ПАУ в образце почвы (нафталин — m/z 128; аценафтен — m/z 154;
фенантрен и антрацен — m/z 178; флуорантен и пирен — m/z 202; бенз[a]антра-
цен и хризен — m/z 228; бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен и бенз[a]пирен —
m/z 252; бенз[ghi]перилен и индено[1,2,3-cd]пирен — m/z 276; дибенз[a,h]антра-
цен — m/z 278; пердейтеронафталин — m/z 136 и пердейтерофенантрен — m/z 188
использованы в качестве внутренних стандартов)
60 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
в образце, а площадь пика позволяет провести его количественное определение. Однако,
поскольку вероятность присутствия в сложном образце веществ с близкими временами
выхода и имеющими в спектрах ионы с одинаковыми значениями m/z достаточно высо-
ка, результаты SIM не столь надежны, как результаты, полученные в режиме полного
сканирования спектра. Для повышения надежности используется одновременная реги-
страция нескольких характеристических ионов. Например, стандартные методы Агент-
ства по охране окружающей среды США требуют регистрации трех характеристических
ионов каждого целевого аналита. Аналогичный европейский документ (2002/657/EC)
еще жестче. Он требует четырех идентификационных точек (глава 3). Аналит считается
детектированным, если зарегистрированы все характеристические ионы, причем со-
отношения их пиков соответствуют этим соотношениям в стандартном масс-спектре
данного соединения.
Поскольку время выхода целевых компонентов всегда известно заранее, детектор
масс может переключаться для регистрации ионов с другими величинами m/z, как толь-
ко аналит был зарегистрирован (вышел из колонки). Такой подход позволяет создавать
автоматизированные программы для детектирования методом МЗИ серии аналитов
Время, мин.
Интенсивность Рис. 2.7. SIM по току характеристических для станозолола ионов с
m/z
560, 545 и
143 (
об-
разец мочи) с низким разрешением R = 500 на приборе Agilent 5973 (с разрешения
Э. Вирюса)
2.2. Типы хроматограмм с регистрацией ионного тока 61
за один ввод пробы в прибор. На рис. 2.6 представлены результаты количественного
масс-фрагментографического определения 14 полициклических ароматических угле-
водородов (ПАУ) в образце почвы. Хотя на рис. 2.6 видны пики, обусловленные неко-
торыми другими компонентами образца, проблемы с идентификацией и количествен-
ным определением ПАУ нет, поскольку их времена выхода точно известны. Количество
целевых соединений в аналогичных автоматизированных программах анализа может
достигать сотен. Если одни и те же целевые аналиты должны быть определены во мно-
гих аналогичных образцах, очень полезным становится применение автосамплера.
В этом случае система ГХ/МС будет проводить последовательные анализы без участия
оператора.
Для улучшения пределов обнаружения и надежности определения исполь-
зуется масс-фрагментография высокого разрешения. На рис. 2.7 видно, что масс-
Рис. 2.8. SIM по току характеристических для станозолола ионов с m/z 560,3650; 545,3415
и 520,3642 (образец мочи) с высоким разрешением R = 10000 на приборе DSF ком-
пании Thermo Scientifi c (с разрешения Э. Вирюса)
Время, мин.
Интенсивност
Станозолол
Станозолол
62 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
хроматограммы по току ионов с m/z 560, 545 и 143, характерных для станозолола (спортив-
ный допинг, запрещенный WADA), едва ли предоставляют какое-либо доказательство
наличия данного соединения в пробе мочи (время выхода 26,95 мин.).
Улучшение качества сигнала в режиме высокого разрешения как для детектирова-
ния, так и для количественного определения, очевидно (рис. 2.8) Это обусловлено тем,
что запись масс-фрагментограммы по току ионов с величиной m/z, измеренной с не-
сколькими десятичными знаками, фактически позволяет детектировать только ионы
с определенным элементным составом. Эта особенность дает возможность существенно
сократить число мешающих ионов. Чтобы избежать проблем, связанных с небольшими
флуктуациями в работе прибора, ионы регистрируются в очень узком массовом диапа-
зоне, например m/z 560,3649—560,3651 (рис. 2.8).
Еще один красивый пример эффективности данного подхода представлен
на рис. 1.10 (глава 1). Он демонстрирует корректное установление уровня 2,3,7,8-тетра-
хлордибензодиоксина в анализируемом образце. МЗИ с высоким разрешением особен-
но полезен при анализе очень сложных матриц, когда требуется обнаружить ультрасле-
довые уровни экотоксикантов.
Еще одним усовершенствованием метода масс-фрагментографии для детектирова-
ния целевых аналитов является использование тандемной масс-спектрометрии с реги-
Рис. 2.9. Мониторинг заданных реакций (МЗР) на примере характеристических процес-
сов фрагментации станозолола (560 → 455, 560 → 545 и 560 → 387) (образец мочи)
на приборе Polaris Q (Thermo Scientifi c) (с разрешения Э. Вирюса)
Относительная интенсивность
Время, мин.
2.3. Скорость сбора данных 63
страцией выбранных процессов фрагментации. Этот метод называется мониторингом
заданных реакций (МЗР, selected reaction monitoring, SRM или multiple reactions monitoring,
MRM). Он заключается в регистрации распада выбранного иона-предшественника
(зачастую молекулярного иона) с образованием известного иона-продукта. Подобные
процессы очень селективны и с учетом времени выхода аналита позволяют получить на-
дежные результаты качественного и количественного анализа даже при работе с самыми
сложными матрицами. В данном случае используется тандемная масс-спектрометрия
или МС/МС, которая будет подробно рассмотрена в главе 4. Рис. 2.9 демонстрирует
эффективность метода МС/МС на примере определения станозолола в том же образце
(сравн. рис. 2.7 и 2.8). В этом случае регистрируются три реакции фрагментации молеку-
лярного иона (m/z 560) с образованием фрагментных ионов с m/z 455, 545 и 387.
Как и МЗИ, МЗР позволяет детектировать большое число соединений за один ввод
образца в прибор. Это достигается последовательным изменением условий регистрации
для определения все новых и новых аналитов и дает возможность создавать автомати-
зированные программы. Так, на рис. 2.10 представлена обобщенная картина результата
определения 700 пестицидов в одном вводе образца в прибор. Результат получен с помо-
щью прибора ЖХ/МС, но сам принцип в этом случае остается тем же.
2.3. Ñêîðîñòü ñáîðà äàííûõ
Скорость сканирования спектров (сбора данных) — еще один очень важный параметр
масс-спектрометра, уже упоминавшийся ранее. В идеале для получения надежных ка-
чественных и количественных результатов каждый хроматографический пик должен
быть охарактеризован 10—15 полными масс-спектрами. На рис. 2.11 представлен любо-
пытный пример катастрофического различия полученной формы хроматографического
пика аналита в зависимости от скорости записи масс-спектра. Поскольку количествен-
ное определение аналита осуществляется при измерении площади хроматографическо-
го пика, понятно, что измереннное с низкой скоростью сбора данных количество до-
декана в анализируемом образце будет абсолютно неправильным (рис. 2.11, красный).
Рис. 2.10. МЗИ для определения 700 пестицидов за один ввод пробы (с разрешения Applied
Biosystems)
Время, мин.
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0
2,4e6
2,2e6
2,0e6
1,8e6
1,6e6
1,4e6
1,2e6
1,0e6
8,0e5
6,0e5
4,0e5
2,0e5
0,0
64 Глава 2. Газовая хроматография-масс-спектрометрия — рабочая лошадка
для анализа объектов окружающей среды
В случае очень узких хроматографических пиков есть возможность совсем пропустить
важный для анализа ингредиент образца. Напротив, при регистрации 250 спектров в се-
кунду (рис. 2.11) форма пика практически идеальна и приближается к таковой для ана-
логового сигнала.
Рис. 2.11 позволяет обсудить еще один аспект, связанный с качеством масс-спектров.
Низкие скорости сбора данных могут привести не только к неправильному количе-
ственному определению, но и создать проблемы для правильной идентификации со-
единения. В частности, при низкой скорости аналит (додекан) характеризуется только
двумя масс-спектрами (рис. 2.11). Если анализ проводится на сканирующем приборе,
например популярных в экологических исследованиях квадруполях, детектор реги-
стрирует ионы один за одним по возрастанию или убыванию их величин m/z. Если в это
время происходит изменение количества аналита, что справедливо для процесса хро-
матографического элюирования, число образовавшихся ионов будет больше либо для
ионов с низким, либо высоким m/z, в зависимости от работы с нисходящей или восхо-
дящей частью хроматографического пика. Самые качественные спектры регистрируют-
ся на вершине пика. Этот эффект может привести к проблемам поиска в спектральных
базах даннах и, как следствие, ошибкам в идентификации аналита. Для случая, изобра-
женного на рис. 2.11, для скана, стартовавшего в 7,4 с, будет наблюдаться определенная
дискриминация фрагментных ионов с низкой и высокой массой в пользу ионов средней
массы. Скан, стартовавший в 7,5 с, позволит зарегистрировать лишь несколько ионов
с низкой массой при полном отсутствии каких-либо ионов средней и большой массы,
так как вещества уже не будет в источнике ионов. Это — искажение масс-спектра (spectral
skewing).
Следует подчеркнуть, что проблема искажения масс-спектра подобного типа харак-
терна только для сканирующих приборов. Напротив, времяпролетные анализаторы,
в которых происходит одновременный отбор всех ионов в заданном диапазоне m/z, обе-
Рис. 2.11. Форма хроматографического пика додекана шириной 150 мс при скорости сбора
данных 10 и 250 спектров в секунду (с разрешения LECO Corp.)
Додекан
Ширина 150 мс
Время в секундах
10 спектров в секунду 250 спектров в секунду
7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 8,1
2.4. Какие соединения можно анализировать методом ГХ/МС 65
спечивают практически идентичные масс-спектры вдоль всего хроматографического
пика. Рис. 2.12 иллюстрирует это утверждение на примере дихлорбензола.
Очень высокая скорость сбора данных во времяпролетных приборах позволяет ре-
гистрировать несколько сот спектров в секунду, обусловливая высокую точность коли-
чественных определений. Кроме того, все спектры оказываются идентичными и неис-
каженными. Это очень важное преимущество таких анализаторов, благодаря которому
появился метод быстрой хроматографии. Его подробности рассмотрены в главе 6.